人參皂甙Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤血管生成擬態(tài)的研究

江丹丹 郭敬強 陳 亮

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人參皂甙Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤血管生成擬態(tài)的研究

江丹丹 郭敬強 陳 亮

目的 本實驗通過建立胰腺癌SW-1990細(xì)胞株皮下移植瘤模型，探討人參皂甙Rg3對胰腺癌皮下移植瘤血管生成擬態(tài)的影響。方法 首先建立人胰腺癌細(xì)胞裸鼠模型，后給予不同藥物濃度的人參皂甙Rg3(0、5、10、20mg/kg)處理裸鼠，觀察人參皂甙Rg3對裸鼠移植瘤生長的影響，免疫組化-PAS雙染觀察人參皂甙Rg3對裸鼠胰腺癌皮下移植瘤血管生成擬態(tài)和血管內(nèi)皮因子CD31的影響，并用熒光定量PCR和Western blot法分別檢測MMP-2、MMP-9在mRNA和蛋白水平的表達。結(jié)果人參皂甙Rg3能夠抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長，其中20mg/kg人參皂甙Rg3組最明顯；Western blot法和熒光定量PCR示用藥組與空白組比較，MMP-2、MMP-9在蛋白和mRNA水平的表達下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；免疫組化-PAS雙染后發(fā)現(xiàn)血管擬生(+)和CD31(+)數(shù)量均較空白組減少。結(jié)論 通過體內(nèi)實驗筆者證實人參皂甙Rg3能夠通過降低MMP-2、MMP-9的表達來抑制胰腺癌血管生成擬態(tài)的形成。

胰腺癌 胰腺癌裸鼠皮下移植瘤 血管生成擬態(tài) 基質(zhì)金屬蛋白酶

胰腺癌是一種惡性程度非常高的消化道腫瘤，由于其起病隱匿，臨床發(fā)現(xiàn)時大部分已處于晚期，治療上手術(shù)切除是目前主要的治療方式，但由于術(shù)后易復(fù)發(fā)，其5年的生存率僅為20%[1]。腫瘤的生長主要依靠新生血管的形成，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為新生血管的形成大都起源于血管內(nèi)皮細(xì)胞。然而Maniotis等[2]發(fā)現(xiàn)在人眼葡萄膜黑色素瘤中存在一種由細(xì)胞外基質(zhì)和黑色瘤細(xì)胞包繞組成的，在電子微鏡下觀察到在管腔中存在紅細(xì)胞而無內(nèi)皮細(xì)胞的互相連接的環(huán)袢狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通常將這種不依賴于內(nèi)皮細(xì)胞的腫瘤內(nèi)血管生成狀態(tài)稱為血管生成擬態(tài)，隨后人們陸續(xù)在其他腫瘤中同樣證實這種血管生成擬態(tài)的存在。有臨床報道，胰腺癌中存在血管生成擬態(tài)，但是其形成具體機制仍不清楚。

人參皂甙Rg3是從人參中提取的一種微量四環(huán)三萜皂甙，其能夠通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用[3～7]。筆者前期實驗研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌SW-1990細(xì)胞株在體外三維培養(yǎng)環(huán)境中能形成血管生成擬態(tài)，人參皂甙Rg3能夠使MMP-2、MMP-9的表達下降，抑制胰腺癌SW-1990細(xì)胞株在三維培養(yǎng)環(huán)境中血管生成擬態(tài)的生成，但體外三維培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)的差異較大，對實驗結(jié)果會造成影響。本實驗通過建立胰腺癌SW-1990細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤模型，探討人參皂甙Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤血管生成擬態(tài)的影響。

材料與方法

1.試劑:人參皂甙Rg3標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，購買于美國Sigma公司,DMEM培養(yǎng)液、胰酶購于Gibco公司，MMP-9、MMP-2抗體購買于Abcam公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和胰腺癌動物模型的建立:胰腺癌細(xì)胞株SW-1990購買于美國ATCC公司，培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、飽和濕度含5%C02及95%氧氣的孵箱中培養(yǎng)。動物實驗經(jīng)過嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院倫理文員會批準(zhǔn)。BALB-/C-nu裸鼠28只,18～22g，4～6周齡,購自中科院上海實驗動物中心,飼養(yǎng)于嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院實驗動物中心(SPF級),有關(guān)動物的實驗操作均按規(guī)定進行。動物模型的建立：待SW-1990細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿瓶底70%～80%時，用胰酶消化貼壁細(xì)胞,用含DMEM和血清1∶1的液體稀釋成2×106/100μl的單細(xì)胞溶液，在無菌條件下于裸鼠背側(cè)近右后肢處皮下接種100微升/只。當(dāng)癌細(xì)胞接種后3天，把裸鼠隨機分成4組，每組7只，之后通過腹腔注射給予不同人參皂甙Rg3濃度處理(0、5、10、20mg/kg)，隔日1次，共給藥4周，最后一次給藥后3天處死裸鼠，取移植瘤組織用于后續(xù)實驗研究。

3.免疫組化-PAS雙染：上述留取的裸鼠移植瘤組織，經(jīng)4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，經(jīng)3%的雙氧水滅活過氧化物酶20min，1×PBS洗滌3次，每次5min，后經(jīng)5%的山羊血清室溫下封閉20min，一抗CD31(1∶100)4℃過夜孵育，PBS洗滌后經(jīng)辣根標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶100)37℃孵育1h。DAB復(fù)染8min，高碘酸作用10min，然后置于Schiff液中，目測組織出現(xiàn)紫紅質(zhì)后流水沖洗終止。蘇木素復(fù)染2min，流水沖洗12min，分化、反藍、常規(guī)脫水、透明、樹膠封片。CD31/PAS陽性結(jié)果判定及量化方法如下[8]：400×高倍顯微鏡下隨機選取10個視野，腫瘤細(xì)胞彼此融合，連接成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)且PAS陽性的為形成擬生態(tài)血管；腫瘤組織中出現(xiàn)CD31陽性、PAS染色陰性的為血管內(nèi)皮依賴的管道，CD31陰性、PAS染色陽性且管腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞者為擬生態(tài)血管，以平均數(shù)來計算兩者的量。

4.熒光定量PCR檢測MMP-2、MMP-9 mRNA的表達:根據(jù)說明用TRIzol一步法提取裸鼠移植瘤組織中總的RNA，按RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA用DEPC水稀釋3倍。MMP-2、MMP-9和內(nèi)參GAPDH的引物用1×TBE Buffer 稀釋成10pmol/ml待用，其引物序列見表1。將擴增好的cDNA，待用的稀釋引物，熒光PCR水，SYRB Green按照SYRB Green 5μl、上游下游引物各1μl、cDNA 1μl、余下用熒光PCR水補足配成10μl的反應(yīng)體系，上機(Roche)擴增45個循環(huán)。結(jié)果用Light Cycler 480軟件分析。

表1 引物序列和擴增產(chǎn)物長度 ±s)

5.Western blot法檢測MMP-2、MMP-9蛋白水平的表達：裸鼠移植瘤組織獲取后立即放入加有液氮的研缽中碾磨，提取移植瘤組織的蛋白，之后用BAC試劑盒測定蛋白的濃度，配體系。制好10%的膠板后，蛋白60μg濃度上樣電泳，恒流300mA 轉(zhuǎn)膜，1×TBS平衡5min，后5%的脫脂牛奶封閉2h，一抗(MMP-9 1∶1000，MMP-2 1∶100)4℃過夜，二抗(1∶5000) 室溫下2h，1×TBST洗滌后，加ECL 化學(xué)發(fā)光曝光，結(jié)果用AlphaEaseFC 4.0軟件分析。

結(jié) 果

1.人參皂甙Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤生長的影響: 與不用藥組比較，人參皂甙Rg3可以抑制裸鼠胰腺癌皮下移植瘤的生長，并且隨著用藥濃度的增加，移植瘤的形成有逐漸變小的趨勢，其中10mg/kg和20mg/kg濃度人參皂甙Rg3作用最明顯。裸鼠麻醉后取瘤稱重，測量瘤體長和寬，按照(4/3)π[(長度+ 寬度)/4][9]計算瘤體的體積，各組瘤體重量和體積的量化差別見表2所示。

圖1 不同濃度的人參皂甙Rg3(0、5、10、20mg/kg)分別作用于裸鼠皮下移植瘤4周后，對胰腺癌皮下移植瘤的影響A.0mg/kg;B.5mg/kg;C.10mg/kg;D.20mg/kg;由圖A、B、C、D可以看出，隨著藥物濃度的升高，移植瘤的形成有逐漸變小的趨勢

表2 不同濃度的人參皂甙Rg3對裸鼠皮下移植瘤重量和體積影響的量化

2.人參皂甙Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤血管生成擬態(tài)的影響：單純CD31染色，可見一抗CD31將具有血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的血管部分染成棕黃色(圖2A)；單純PAS染色，將血管擬態(tài)區(qū)管道壁及細(xì)胞外基質(zhì)染成紫紅色(圖2B)；圖2C所示在PAS(+)的通道中能夠見到腫瘤細(xì)胞，說明腫瘤細(xì)胞可以經(jīng)過血管生成擬態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)移；圖2D所示CD31染色(+)的管道和PAS(+)的通道相連，說明血管生成擬態(tài)和內(nèi)皮依賴性血管相通，血管生成擬態(tài)同樣可以給腫瘤組織的生長、侵襲、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)；空白組和用藥組的雙染結(jié)果分別如圖2E、F、G、H所示，隨著人參皂甙Rg3的用藥，血管擬生態(tài)的形成能力逐漸下降，CD31/PAS陽性量逐漸下降，其具體數(shù)值如表3所示。

3.Western blot法和FQ-PCR檢測各組裸鼠移植瘤組織MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA的表達：如圖3A所示，隨著人參皂甙Rg3用藥濃度的增加，與不用藥組比較，移植瘤組織的MMP-2、MMP-9蛋白的表達逐漸下降；其中20mg/kg組下降最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) ；與Western blot法的結(jié)果相對應(yīng)的熒光定量PCR結(jié)果如圖3B所示，隨著人參皂甙Rg3用藥濃度的增加，與不用藥組比較，移植瘤組織的MMP-2、MMP-9在mRNA水平表達均下降，其中20mg/kg組下降最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 采用免疫組化-PAS雙染法觀察人參皂甙Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤血管生成擬態(tài)的影響

表3 裸鼠CD31/PAS陽性量化計數(shù)具體數(shù)值

圖3 采用Western blot法和FQ-PCR分別檢測不同用藥濃度的人參皂甙Rg3對MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA的表達的影響與對照組比較，P<0.05

討 論

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為腫瘤血管的形成主要依靠內(nèi)皮細(xì)胞，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中存在一種由腫瘤細(xì)胞自身和細(xì)胞外基質(zhì)形成的能夠運輸紅細(xì)胞的管型通道，即血管生成擬態(tài)[2]。血管生成擬態(tài)一般出現(xiàn)在高度惡性的腫瘤組織中，是腫瘤細(xì)胞形成的新型血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[5]。正如本實驗證實，在胰腺癌裸鼠移植瘤組織中存在血管生成擬態(tài)，血管可以形成花環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其為腫瘤的生成和侵襲提供營養(yǎng)基礎(chǔ)，隨著人參皂甙Rg3的用藥，裸鼠移植瘤組織形成血管擬生態(tài)的能力逐漸下降，主要表現(xiàn)在免疫組化-PAS雙染中CD31(+)和PAS(+)陽性數(shù)量逐漸下降。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是一組鋅依賴性內(nèi)肽酶，與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。據(jù)Seftor等[10]報道在高侵襲性黑色素瘤組織中 MMP2、MMP9的表達較其他腫瘤組織中明顯增加，使腫瘤細(xì)胞結(jié)合更多的層黏連蛋白，最終促進血管生成擬態(tài)的形成。研究發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rg3抑制MMP-2、MMP-9的表達而發(fā)揮抗腫瘤作用[11]。正如本研究所證實，在裸鼠移植瘤組織中，MMP2、MMP9呈高表達狀態(tài)，隨著人參皂甙Rg3的用藥，與不用藥組比較MMP-2、MMP-9在蛋白和mRNA水平的表達均下降。故通過本實驗筆者推測人參皂甙Rg3抑制胰腺癌皮下移植瘤的生長和其可抑制MMP2、MMP9的表達有關(guān)，并進一步抑制血管生成擬態(tài)的形成。

總之，血管生成擬態(tài)的提出是對經(jīng)典的內(nèi)皮依賴性腫瘤血管的補充，為部分臨床腫瘤抗血管治療效果不佳提供一合理的解釋。通過體內(nèi)實驗筆者證實人參皂甙Rg3能夠通過降低MMP-2、MMP-9的表達來抑制胰腺癌血管生成擬態(tài)的形成，該發(fā)現(xiàn)可能為臨床治療工作提供幫助。

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(修回日期：2015-01-06)

Effects of Ginsenosides Rg3 on Vasculogenic Mimicry of Pancreatic Cancer Xenograft.

JiangDandan,GuoJingqiang，ChenLiang.

DepartmentofHepatobiliarySurgery,FirstHospitalofJiaxing,Zhejiang314000,China

Objective To investigate the effects of ginsenosides Rg3 on vasculogenic mimicry of pancreatic cancer xenograft through the establishment of pancreatic cancer cell line SW-1990 subcutaneous xenograft model. Methods After pancreatic cancer xenograft in nude mice model beening established, All the mice were randomly divided into 4 groups and treated intraperitoneally (IP) with saline and various concentrations (5,10,20 mg/kg) of ginsenosides Rg3. To observe the effect of ginsenoside Rg3 on tumor growth. Immunohistochemical-PAS staining was used to detect the effects of ginsenosides Rg3 on vasculogenic mimicry of pancreatic cancer xenograft. and mRNA and protein expression of MMP2、MMP9 were respectively evaluated by FQ-PCR and Western blot. Results The ginsenosides Rg3 can inhibit the growth of the tumor xenografts in nude mice. The inhibitory effect is the most obvious the 20 mg/kg of ginsenosides Rg3 group. The expression of MMP-2, MMP-9 were down-regulated compare with the control group, and the difference was significant; the Immunohistochemical-PAS staining showed the number of vasculogenic mimicry (+) and CD31 (+) were less than that in the control group. Conlusion Our results demonstrate that pancreatic vascular mimicry formation can be suppressed by Ginsenoside Rg3 though reducing the expression of MMP-2, MMP-9 in our vivo experiments,

Pancreatic cancer; Xenograft model of pancreatic cancer; Vasculogenic mimicry; Matrix metalloproteinase

314000 嘉興市第一醫(yī)院(江丹丹、陳亮)；310012 麗水市中心醫(yī)院(郭敬強)

R6

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.035

2014-12-13)