SOCSs在慢加急性肝衰竭大鼠肝組織中的表達變化及意義

王柯尹 楊乃彬 倪順蘭 謝新生 余 曉 盧明芹

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SOCSs在慢加急性肝衰竭大鼠肝組織中的表達變化及意義

王柯尹 楊乃彬 倪順蘭 謝新生 余 曉 盧明芹

目的 探討細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子(suppressors of eytokine signaling,SOCSs)在慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure，ACLF)大鼠肝組織中的表達及其在ACLF發(fā)生中的作用。方法 健康SD大鼠隨機分組，ACLF組大鼠腹腔注射1.5ml/kg的50%四氯化碳花生油溶液，每3天1次，10次后改為2ml/kg，每3天1次，9次后給予250mg/kg D-氨基半乳糖(D-GalN)聯(lián)合50μg/kg脂多糖(LPS)急性攻擊，給藥后0、6、12、24h 留取大鼠血及肝組織。血生化檢測ALT、AST水平和ELISA法檢測TNF-α、IL-6水平。HE染色下觀察肝臟病理學變化。RT-PCR檢測大鼠肝組織SOCS-1、SOCS-3mRNA表達。結(jié)果 大鼠慢加急性肝衰竭模型復制成功，ACLF組血清ALT和AST水平逐漸上升，在12h升高最明顯，血清TNF-α、IL-6水平在造模后0h 即明顯高于對照組,至6h達峰值(P<0.05)，肝組織SOCS-1、SOCS-3mRNA水平于造模后0h開始升高，12h升高最為顯著，之后逐漸下降，與正常對照組相比，各時間點差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 SOCSs在慢加急性肝衰竭過程中升高，其變化與TNF-α、IL-6改變相關，提示SOCSs可能參與慢加急性肝衰竭中的炎癥及免疫調(diào)節(jié)過程。

慢加急性肝衰竭 細胞因子 細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子

慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure，ACLF)是在慢性肝病基礎及急性損傷因素作用下出現(xiàn)的肝功能急劇惡化，表現(xiàn)為黃疸、腹腔積液、凝血功能障礙、肝性腦病等，預后差，病死率高[1]。其發(fā)病機制十分復雜，涉及感染、炎性反應、免疫損傷、器官衰竭等，其中TNF-α、IL-6等細胞因子在肝臟免疫和炎性反應中起重要作用，可直接參與引起肝細胞的壞死，加重肝衰竭病變過程[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導因子和轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase/sigal transduction and activators of transcription,JAK/STAT)通路是細胞因子發(fā)揮生物學效應的信號轉(zhuǎn)導通路之一，參與機體炎性反應，免疫調(diào)節(jié)及細胞損傷、凋亡等過程[3]。SOCSs是一種細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子，對JAK-STA途徑進行負反饋抑制，在維持機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)等起著重要作用，近年研究表明，SOCSs表達上調(diào)可能與肝細胞損傷炎性過程相關。本研究通過檢測慢加急性肝衰竭大鼠各時間點肝組織SOCS-l、SOCS-3mRNA和血清TNF-α、IL-6表達的動態(tài)變化，探討SOCSs在ACLF臨床轉(zhuǎn)歸中的作用。

材料與方法

1.試驗動物:清潔級SD大鼠30只，雄性，體重180～200g，由中國科學院上海實驗動物中心提供。試驗前1周領取動物，分籠飼養(yǎng)，自由進食、飲水，室溫約23℃，間隔12h照明。

2.試劑：四氯化碳購自天津博迪股份有限公司；D-GalN購自南通通呂生物制品有限公司；LPS購自上海閃晶生物技術有限公司；RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒由大連寶生物公司提供；TNF-α、IL-6試劑盒購自美國Genzyme公司。

3.方法:(1)動物模型建立與分組:清潔級雄性SD大鼠30只，實驗前1日下午禁食，飲水不限，隨機分為:慢加急性肝衰竭組(ACLF組，n=24): 腹腔注射1.5ml/kg的50%四氯化碳花生油溶液，每3天1次，注射10次后改為2ml/kg，每3天1次，共9次。D-GalN溶于無菌生理鹽水，配成10%的溶液，用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，給予250mg/kg D-GaIN聯(lián)合50μg/kg LPS急性攻擊，分別于給藥后0、6、12、24h 4個時間點處死大鼠，每次處死6只。正常對照組(n=6):腹腔注射同等劑量花生油。(2)取標本:以10%水合氯醛麻醉，采集大鼠門靜脈血，離心10min后留取上清液，存放-80℃冰箱供檢測使用。(3)肝組織病理檢查：肝組織標本用100ml/L甲醛固定，逐級乙醇脫水，石蠟包埋，制備切片，經(jīng)HE染色光鏡下觀察病理變化。(4)肝功能檢測：采用全自動生化分析儀檢測ALT、AST水平。(5)血清TNF-α、IL-6測定:按試劑盒說明書采用ElISA法檢測。(6)RT-PCR法檢測肝組織SOCS-1、SOCS-3mRNA表達:肝組織勻漿，Trizol法提取肝組織總RNA，用紫外線分光光度儀測定吸光度后計算樣本A260/A280比值，介于1.8～2.0的用于反轉(zhuǎn)錄，取樣本PCR產(chǎn)物5μl和溴酚藍緩沖液1μl混勻，取標志物2.5μl作相對分子質(zhì)量標準，進行瓊脂糖凝膠穩(wěn)壓電泳(100V 27min)，采用凝膠圖像系統(tǒng)，用Gel-Pro3.1軟件對電泳條帶進行密度掃描，以SOCS-1、SOCS-3與β-actin吸光度比值作為目的基因mRNA的相對表達量，引物由上海捷瑞公司合成。SOCS-1 PCR反應條件:95℃ 5min，95℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 17s，35個循環(huán)；4℃ 3min。內(nèi)參β-actin PCR反應條件: 95℃ 5min，95℃ 30s，58.4℃ 30s，72℃ 6s，35個循環(huán)；4℃ 5min。SOCS-3 PCR反應條件:95℃ 5min，95℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 27s，35個循環(huán)；4℃ 3min。內(nèi)參β-actin PCR反應條件: 95℃ 5min，95℃ 30s，58.4℃ 30s，72℃ 6s，35個循環(huán)；4℃ 5min。序列見表1。

結(jié) 果

1. 一般情況:對照組大鼠反應靈敏，攝食飲水量多，模型組0h開始活動、進食減少，6h精神萎靡，動作遲緩，對刺激反應減弱，12h后逐漸出現(xiàn)呼吸氣促、肢體發(fā)抖、口鼻出血。

表1 PCR引物序列

2.血清學變化:ACLF組血清ALT和AST在造模后很快上升，12h達高峰，與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(ALT：F=71.937，286.218，456.977，297.659，P<0.05；AST：F=68.050，195.495，440.675，664.438，P<0.05，表2)。ACLF組大鼠血清TNF-α、IL-6均在造模后0h即有所上升，至6h達峰值，之后逐漸下降，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(TNF-α:F=367.468,463.177,874.417,283.401,P<0.05；IL-6:F=757.885,803.649,698.713,477.883,(P<0．05),詳見表2。

表2 各組大鼠血清ALT、AST、TNF-α、IL-6檢測結(jié)果

與正常對照組比較，P<0.05

3.肝臟形態(tài)、病理學變化：正常對照組大鼠肝臟呈鮮紅色，形態(tài)正常，表面光滑，病理顯示肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見肝細胞變性、壞死。實驗組肝臟體積縮小，表明呈細顆粒或結(jié)節(jié)狀，病理示顯示纖維組織增生，同時存在壞死、凋亡及再生肝細胞，再生肝細胞排列紊亂，形成肝內(nèi)假小葉，伴有肝細胞再生結(jié)節(jié)，存在炎性細胞浸潤。6h時可見大量肝細胞壞死，炎性浸潤及出血明顯，肝竇或間質(zhì)內(nèi)見出血灶。12h后顯示肝細胞大片壞死、凋亡，壞死區(qū)及匯管區(qū)有大量炎性細胞浸潤，肝竇明顯擴張充血，殘存肝細胞可見水腫、嗜酸性變(圖1)。

4.肝組織SOCS-1、SOCS-3mRNA表達：正常大鼠肝組織中存在少量SOCS-1、SOCS-3mRNA表達，ACLF組SOCS-1、SOCS-3mRNA表達均于造模后立即開始逐漸增加，12h達到高峰，24h開始下降，與正常對照組(0.718±0.102) 各時間點相比，差異有統(tǒng)計學意義(SOCS-1:F=28.734，80.533，409.701，220.445，P<0.05；SOCS-3:F=40.433，101.544，319.141，191.229，P<0.05，圖2，表3)。

圖1 大鼠肝組織HE染色(×200)A.正常對照組；B.ACLF組0h；C.ACLF組6h；D.ACLF組12h

討 論

圖2 RT-PCR法檢測肝組織SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平1.正常對照組；2.0h；3.6h；4.12h；5.24h；M.標志物；β-actin.β-肌動蛋白

表3 各組肝組織SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達(與β-actin灰度比值，

與正常對照組比較，*P<0.05

慢加急性肝衰竭是一種病因復雜、治療困難的疾病，目前認為免疫系統(tǒng)過度激活介導局部炎性反應，誘發(fā)細胞因子的大量分泌是造成其病理損害的中心環(huán)節(jié)。肝衰竭時循環(huán)中高水平的內(nèi)毒素可激活庫普弗細胞釋放TNF-α、IL-6等多種炎性介質(zhì)， 細胞因子網(wǎng)絡失衡，啟動一系列級聯(lián)反應，造成組織缺血缺氧甚至多器官衰竭。Mao等[4]發(fā)現(xiàn)ACLF患者肝內(nèi)TNF-α表達較慢乙肝患者明顯升高。Elsing等[5]在慢加急性肝衰竭中大鼠肝組織中檢測到高濃度的TNF-α、IL-6浸潤，提示TNF-α、IL-6等促炎因子可能導致肝細胞壞死或凋亡，抑制肝細胞再生，參與肝臟炎性損傷。本實驗結(jié)果顯示，慢加急性肝衰竭大鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著升高，提示TNF-α、IL-6等細胞因子可能通過引發(fā)多種化學介質(zhì)釋放，創(chuàng)建一個促炎性的周圍環(huán)境，加重組織損傷，促進肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展。

研究表明，當細胞因子作用于靶細胞表面受體，需要信號轉(zhuǎn)導通路的活化，才能啟動靶細胞發(fā)揮相應的生理效應，其中JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導途徑是一條重要途徑，它通過TNF-α與細胞膜上的INFAR-I綁定形成二聚體，激活細胞質(zhì)中Jak-1和Tyk2，使STAT1和STAT2磷酸化，參與細胞凋亡、致炎因子信號轉(zhuǎn)導及調(diào)控等多種生物學過程[6，7]。SOCS-1、SOCS-3屬于SOCS家族，目前已經(jīng)被認為是強有力的細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子，可介導SH2和KIR功能區(qū)與JAKs直接結(jié)合抑制其酪氨酸激酶活性，對JAK/STAT信號通路進行負調(diào)控[8，9]。有報道顯示SOCS蛋白參與T細胞的分化和調(diào)控，在天然免疫和獲得性免疫中扮演重要角色，與炎癥和免疫反應密切相關[10]。研究證實，JAK/STAT信號通路在肝臟炎性反應中發(fā)揮著重要作用，TNF-α、IL-6等細胞因子可有效刺激STAT活化，誘導目的基因表達[11～13]。另一方面，SOCSs可對STAT信號進行負調(diào)控，抑制上述細胞因子的信號轉(zhuǎn)導過程，推測SOCSs參與了對肝細胞炎性反應的特異性調(diào)控，與慢加急性肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展之間存在著某些聯(lián)系，但具體聯(lián)系到目前為止尚不十分明確[14]。

本實驗結(jié)果顯示，ACLF組大鼠血清血清TNF-α、IL-6水平在造模后0h開始升高，6h達高峰，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，ACLF組SOCS-1、SOCS-3 mRNA于造模后即高于對照組，12h達峰值，之后逐漸下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這提示SOCSsmRNA的表達水平隨著肝臟損傷程度加重而增加，肝損害越明顯，SOCSs表達越多，但略晚于TNF-α、IL-6表達，考慮發(fā)生肝衰竭時，大量肝細胞損傷，TNF-α、IL-6等炎性因子釋放，與相應的受體結(jié)合導致JAKs 的激活，激活的JAKs將受體上特定的酪氨酸殘基磷酸化，誘導STATs活化，進一步刺激SOCSs mRNA表達上調(diào)。筆者的研究結(jié)果顯示，造模12h后肝組織TNF-α和IL-6表達水平下降,可能與SOCSs 通過阻止訪問信號傳感器、抑制STAT受體結(jié)合位點轉(zhuǎn)錄等方式對細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑進行負反饋環(huán)調(diào)節(jié)有關[15]。據(jù)此推測,在慢加急性肝衰竭發(fā)生、發(fā)展中，SOCSs表達水平的改變與TNF-α、IL-6等細胞因子的變化密切相關，影響慢加急性肝衰竭整個病理生理過程，但目前國內(nèi)外關于SOCSs在慢加急性肝衰竭發(fā)病機制中的影響報道較少，因此，仍有待于通過更深一步研究兩者之間的具體關系，從而減輕甚至阻止各種因素對肝臟造成的破壞,為發(fā)現(xiàn)慢加急性肝衰竭治療手段開拓新的領域。

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(修回日期：2015-02-12)

Expression of SOCSs in Rats with Acute-on-chronic Liver Failure and Its Significance.

WangKeyin，YangNaibin，NiShunlan，etal.

DepartmentofInfectionDisease，TheFirstHospitalofJiaxing，Zhejiang314000，China

Objective To investigate the expression of SOCSs in liver tissues of rats with acute on chronic liver failure(ACLF) and the function of SOCSs in ACLF. Methods The SD male rats were randomly divided into two groups. Rats in ACLF group were intraperitoneally injected with: 1.5ml/kg of 50% carbon tetrachloride peanut oil solution, every 3 days for the first month; 2ml/kg of 50% carbon tetrachloride peanut oil solution, every 3 days for another two months; then 250mg/kg D-GalN and 50μg/kg LPS at once. Rats in normal group were intraperitoneally injected with 0.9% NaCl solution. Liver tissue and blood were collected on 0,6,12,24hours after the final injection. The level of ALT、AST were detected by automatic biochemical analyzer and TNF-α,IL-6 were determined by ELISA. The liver pathologic changes were observed with HE staining by microscope. SOCS-1,SOCS-3mRNA of liver tissues were determined by RT-PCR. Results ACLF model of rats were successfully built. The level of ALT and AST in model group peaked at 12 hours. The level of TNF-α,IL-6 were obviously higher than those in control group and peaked at 6h(P<0.05). SOCS-1,SOCS-3mRNA began to rise after modeling，peaked at 12h and decreased gradually. Compared with the normal group, difference in all time point were statistically significant(P<0.05). Conclusion The level of SOCSs in ACLF group were upregulated and the upregulation was associated with IFN-α,IL-6, suggesting that SOCSs may participate in the process of inflammation and immune regulation in ACLF.

Acute-on-chronic liver failure；Cytokines；Suppressors of cytokine signalings

314000 嘉興市第一醫(yī)院感染科(王柯尹、謝新生、余曉)；325000 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院感染科(楊乃彬、倪順蘭、盧明芹)

盧明芹，電子信箱:LMQ0906@163.com

R575

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.030

2015-01-21)