絕經(jīng)對大鼠血栓前狀態(tài)的影響

高 輝 奚 水 徐 苓

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絕經(jīng)對大鼠血栓前狀態(tài)的影響

高 輝 奚 水 徐 苓

目的 通過去勢建立絕經(jīng)大鼠模型，觀察絕經(jīng)對大鼠血栓前狀態(tài)的影響。方法 將32只9～10月齡的健康雌性SD大鼠隨機分成4組，每組8只。實驗組手術(shù)去勢，對照組行假手術(shù)，分別于術(shù)后1周或10周處死。采用凝血酶比濁法檢測各組大鼠血漿纖維蛋白原(FIB)含量；采用發(fā)射底物法檢測抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)活性；采用ELISA雙抗體夾心法檢測纖溶酶原激活劑抑制劑(PAI-1)、D-二聚體(D-D)、血管性假血友病因子(vWF)含量；采用硝酸還原酶法檢測NO含量；采用放射性核素放射免疫法檢測血漿血栓素A2(TXA2)、前列環(huán)素(PGI2)含量。結(jié)果 在絕經(jīng)早期，血漿FIB含量明顯升高，血漿ATⅢ活性無明顯變化；血漿PAI-1含量呈升高趨勢；血漿vWF含量顯著升高，同時血漿NO含量顯著下降；隨著絕經(jīng)時間延長，到絕經(jīng)晚期，與對照組相比，PAI-1含量顯著增加，而血漿FIB含量有所回落，血漿ATⅢ活性顯著升高；血漿vWF含量仍保持在較高水平，但血漿NO含量有所回升。在絕經(jīng)早期及絕經(jīng)晚期，血漿TXA2和PGI2同步升高，D-D含量各組間均無明顯變化。結(jié)論 在血栓形成的不同環(huán)節(jié)，絕經(jīng)事件發(fā)揮了不同的影響，導(dǎo)致絕經(jīng)早期血栓形成風(fēng)險增加；隨著絕經(jīng)時間延長，各相關(guān)參數(shù)達成新的平衡，血栓風(fēng)險回落。

血栓前狀態(tài) 絕經(jīng) 去勢大鼠

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展及人類壽命的延長，女性有1/3的時間在絕經(jīng)期度過。絕經(jīng)后卵巢功能衰退，雌激素水平低下。雌激素受體廣泛分布于大腦、心血管、骨骼、皮膚、泌尿生殖系統(tǒng)等。因此，絕經(jīng)后長期低雌激素狀態(tài)導(dǎo)致一系列衰退性改變及軀體疾病。研究顯示，增齡可以改變凝血、抗凝及纖溶系統(tǒng)，影響血管內(nèi)皮及血小板功能，導(dǎo)致血栓形成風(fēng)險增加[1,2]。絕經(jīng)后婦女同時受年齡增長和雌激素水平下降兩大因素影響，絕經(jīng)事件本身是否會導(dǎo)致血栓前狀態(tài)，目前還有爭議。本研究擬通過手術(shù)去勢建立絕經(jīng)大鼠模型，觀察絕經(jīng)對凝血、抗凝、纖溶系統(tǒng)及血管內(nèi)皮功能、血管舒縮功能的影響。

資料與方法

1.研究對象：9～10月齡的健康雌性SD大鼠(SPF級)32只，平均體重370±34g，飼養(yǎng)于北京協(xié)和醫(yī)院動物中心嚙齒類屏障環(huán)境(24～28℃，通風(fēng)良好，濕度60%～80%，自由攝食、水)，通過陰道細胞形態(tài)判斷大鼠動情周期存在。1周后行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，假手術(shù)組僅切開腹壁后縫合。術(shù)后3天起行陰道細胞學(xué)檢查，確認去勢成功，絕經(jīng)模型建立。

2.方法：(1)分組：所有大鼠隨機分為4組，每組8只。第1、2組為假手術(shù)組：第1組(基線組)假手術(shù)1周后處死，第2組(對照組)假手術(shù)10周后處死；第3、4組為手術(shù)去勢組：第3組(絕經(jīng)早期組)去勢1周后處死，第4組(絕經(jīng)晚期組)去勢10周后處死；(2)采集血標本：處死前12h禁食不禁水，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40mg/kg)，0.109mol/L枸櫞酸鈉抗凝，用頸動脈插管法采集血標本。血標本于4℃放置4h后3000r/min離心15min，吸取上清液(血漿)，分裝成數(shù)小管，標記后置于中心實驗室-70℃冰箱保存，統(tǒng)一檢測。(3)血液生化學(xué)指標檢測:血漿FIB含量采用Clauss法(凝血酶比濁法)，血漿ATⅢ活性采用發(fā)射底物法，血漿PAI-1含量、D-D含量、vWF抗原含量采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法，血漿NO含量采用硝酸還原酶法。TXA2、PGI2采用放射性核素放射免疫法測定。TXA2半衰期短難以直接測定，采用平衡法測定其無活性代謝產(chǎn)物TXB2作為判斷濃度的指標。PGI2極不穩(wěn)定，采用非平衡法測定其代謝產(chǎn)物6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)作為判斷濃度的指標。

結(jié) 果

1.血漿FIB含量：絕經(jīng)后血漿FIB含量呈升高趨勢。與基線組相比，絕經(jīng)早期組血漿FIB含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。絕經(jīng)晚期組與基線組、對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.血漿ATⅢ活性：絕經(jīng)后ATⅢ活性升高。絕經(jīng)晚期組血漿ATⅢ活性顯著高于基線組和對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；絕經(jīng)早期組與基線組和對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3.血漿PAI-1含量：隨著絕經(jīng)時間延長，血漿PAI-1含量顯著升高。絕經(jīng)晚期組與基線組和對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與絕經(jīng)早期組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。絕經(jīng)早期組血漿PAI-1含量亦有所升高，但與基線組和對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

4.血漿D-D含量：各組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

5.血漿vWF含量：絕經(jīng)早期血漿vWF含量即顯著升高，并保持在較高水平。絕經(jīng)早期組、晚期組與基線組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；絕經(jīng)早期組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

6.血漿NO含量：絕經(jīng)早期組血漿NO含量顯著下降，與基線組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。隨著絕經(jīng)時間延長，絕經(jīng)晚期組血漿NO含量有所回升，絕經(jīng)晚期與基線組、對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

7.血漿6-Keto-PGF1α含量：6-Keto-PGF1α為PGI2代謝產(chǎn)物，可以反映血漿PGI2含量。結(jié)果顯示，絕經(jīng)后PGI2含量顯著升高。絕經(jīng)早期組、晚期組與基線組、對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

8.血漿TXB2含量：TXB2為TXA2代謝產(chǎn)物，可以反映血漿TXA2含量。絕經(jīng)早期血漿TXA2含量顯著升高，與基線組、對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；絕經(jīng)晚期組與基線組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組檢測結(jié)果見表1。

表1 各組血標本檢測結(jié)果

FIB.血漿纖維蛋白原；ATⅢ.抗凝血酶Ⅲ；PAI-1.纖溶酶原激活劑抑制劑；D-D.D-二聚體；vWF.血管性假血友病因子；NO.一氧化氮；6-Keto-PGF1α.6-酮-前列腺素F1α；TXB2.血栓素B2

討 論

絕經(jīng)(menopause)是婦女生命進程中必然發(fā)生的生理過程。卵巢功能衰退導(dǎo)致性激素水平和中樞神經(jīng)遞質(zhì)改變，從而引起一系列軀體表現(xiàn)。絕經(jīng)相關(guān)激素治療(menopause related hormone therapy，MHT)有效改善絕經(jīng)期綜合征，預(yù)防和緩解骨質(zhì)疏松、泌尿生殖道萎縮等絕經(jīng)相關(guān)疾病，是提高絕經(jīng)后婦女生活質(zhì)量的重要手段之一。然而臨床觀察顯示，MHT增加深靜脈血栓形成、肺栓塞、腦卒中等血栓性疾病風(fēng)險，尤其在使用的最初1年內(nèi)[3]?，F(xiàn)有研究顯示，MHT干擾凝血和纖溶過程，可能導(dǎo)致血栓風(fēng)險增加[4,5]；增齡也是血栓形成的獨立危險因素[6]。然而，絕經(jīng)事件本身是否會增加血栓形成風(fēng)險還不清楚。

血栓前狀態(tài)(prothrombotic state)是指血管內(nèi)皮細胞受損、血小板和白細胞被激活、凝血因子被活化、抗凝和纖溶系統(tǒng)功能降低以及血液黏滯度增高等一系列病理狀態(tài)，該病理狀態(tài)的特點是有利于血栓形成但尚未形成血栓。目前對于血栓前狀態(tài)沒有統(tǒng)一的診斷標準，亦缺乏精確的標志物，主要通過凝血和抗凝系統(tǒng)的相關(guān)指標、纖溶系統(tǒng)檢查、以及血管內(nèi)皮功能和血小板功能等多方面綜合評價[7]。纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)是凝血瀑布的底物，含量增高則血栓風(fēng)險增加[8]?？鼓涪?antithrombin-Ⅲ，ATⅢ)是血漿中主要的生理性抗凝物質(zhì)，占體內(nèi)抗凝活性的60%～70%，是防止血栓形成的重要生理物質(zhì)[9]。纖溶酶原激活抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)是纖溶活性的重要調(diào)節(jié)因子，其活性升高可以阻礙細胞外基質(zhì)和纖維蛋白降解，促進血管基膜增厚，與血栓形成相關(guān)，是血栓性疾病的危險因子之一，也是動脈粥樣硬化的獨立危險因子[10]。

D-二聚體(D-dimer，D-D)是交聯(lián)纖維蛋白網(wǎng)的降解產(chǎn)物，是繼發(fā)纖溶亢進的敏感指標。低水平的D-D可以排除體內(nèi)有血栓存在。血管性假血友病因子(von Willebrand factor，vWF)和一氧化氮(nitric oxide，NO)是公認的反映內(nèi)皮細胞功能的重要指標，血漿vWF水平升高或NO水平下降與血栓風(fēng)險增加有關(guān)[11]。血管舒縮功能亦與血栓形成密切相關(guān)。正常狀態(tài)下，血管內(nèi)皮產(chǎn)生的舒張因子和收縮因子協(xié)同作用，調(diào)節(jié)血管張力處于正常水平。血栓素A2(thromboxane, TXA2)是體內(nèi)最強的血管收縮劑和血小板聚集劑，具有致動脈粥樣硬化的作用；前列環(huán)素(prostacyclin, PGI2)則是體內(nèi)最強的血管擴張劑和血小板聚集抑制劑，可以抑制氧化應(yīng)激和血小板活化，具有很強的抗血栓作用[12]。TXA2和 PGI2的動態(tài)平衡是調(diào)節(jié)血小板和血管舒縮功能的重要因素之一，TXA2水平增高或PGI2水平降低見于血栓前狀態(tài)。

本研究同時設(shè)立了基線組和對照組，通過對照組排除增齡對血栓前狀態(tài)的影響。筆者的數(shù)據(jù)顯示，在絕經(jīng)早期，血漿FIB含量明顯升高，而重要的抗凝物質(zhì)血漿ATⅢ活性無明顯變化，提示血液凝固能力增強；血漿PAI-1含量呈升高趨勢提示血栓風(fēng)險增加；血漿vWF含量顯著升高，血漿NO含量顯著下降，提示血管功能受損、血栓風(fēng)險增加；TXA2和PGI2同步升高，說明絕經(jīng)影響了血管舒縮功能，但尚能處于平衡狀態(tài)。隨著絕經(jīng)時間延長，到絕經(jīng)晚期，與對照組相比，PAI-1含量顯著增加，但血漿FIB含量有所回落，血漿ATⅢ活性顯著升高，部分抵消了血栓形成風(fēng)險；重要的排除指標D-D含量無明顯變化，說明凝血、抗凝及纖溶系統(tǒng)的改變尚處于平衡狀態(tài)。血漿vWF含量仍保持在較高水平，但血漿NO含量有所回升，說明血管內(nèi)皮功能重新達到相對平衡狀態(tài)。

從以上數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)事件本身對于凝血、抗凝及纖溶系統(tǒng)、血管內(nèi)皮功能及血管舒縮功能均有顯著影響，導(dǎo)致絕經(jīng)早期處于血栓前狀態(tài)，血栓形成風(fēng)險增加；隨著絕經(jīng)時間延長，各相關(guān)參數(shù)達成新的平衡，血栓形成風(fēng)險回落。由于血栓形成的復(fù)雜性，機體對凝血、抗凝、纖溶、血管舒縮狀態(tài)等方面的變化力圖通過復(fù)雜的調(diào)節(jié)維持著動態(tài)平衡，只有多種因素同時改變或某一種因素有嚴重改變時才會導(dǎo)致血栓形成。而且，血栓形成是一個十分復(fù)雜的病理過程，除受上述血凝學(xué)因素影響外，還與機體單核-吞噬細胞系統(tǒng)功能、神經(jīng)體液和內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)等密切相關(guān)。局部因素(血管局部狹窄、血管損傷、內(nèi)皮功能和結(jié)構(gòu)損害、血液淤積和紊亂)亦起著極為重要的作用。由于條件所限，本研究僅選擇了與血栓前狀態(tài)密切相關(guān)的幾個因子，對于血栓前狀態(tài)的評價尚不夠全面。絕經(jīng)對大鼠血栓前狀態(tài)的影響還有待于進一步研究。

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(修回日期：2015-06-01)

Effects of Menopause on Prothrombotic State in Ovariectomized Rats.

GaoHui，XiShui，XuLing.

DepartmentofObstetrics&Gynecology,BeijingTiantanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China

Objective To observe the effects of menopause on prothrombotic profiles in ovariectomized rats. Methods Thirty two healthy female SD rats of 9 to 10 months were divided into 4 groups, the control shamed and the observation groups ovariectomized. Rats in the baseline group and the early menopause group were sacrificed one week later, and the control and late menopause group 10 weeks later. The prothrombotic profiles were detected including plasma FIB, ATⅢ activity, PAI-1 levels, D-D level, vWF levels and NO concentration, TXA2and PGI2levels. Results In early menopause, plasma FIB increased dramatically while ATⅢ activity remained little changed. PAI-1 demonstrated an increasing trend. vWF significantly increased but NO significantly decreased. In later menopausal stage, PAI-1 increased dramatically but FIB somewhat decreased. Plasma ATⅢ activity significantly increased and vWF still remained a high level. NO increased a little. In both early and later stage, TXA2and PGI2simultaneously increased while D-D showed little change between groups.Conclusion Menopause plays different roles in different aspects of thromoembolism, resulting in increased risk in early menopause due to prothrombotic state and decreased risk in later menopause when new balances between profiles were established.

Prothrombotic state; Menopause; Ovariectomized rats

100050 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院婦產(chǎn)科(高輝)；100037 北京，解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科(奚水)；100730 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科(徐苓)(注：高輝和奚水為共同第一作者)

徐苓，電子信箱：xuling@pumch.cn

R71

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.025

2015-05-19)