老年患者感染鮑曼不動桿菌耐藥性變遷機制

劉 英 李紅松 王麗娜 劉金霞 郭亞春

(承德醫(yī)學院，河北 承德 067000)

老年患者感染鮑曼不動桿菌耐藥性變遷機制

劉 英 李紅松1王麗娜 劉金霞 郭亞春

(承德醫(yī)學院，河北 承德 067000)

目的 通過分析鮑曼不動桿菌的感染特征、耐藥性及其產(chǎn)碳青霉烯酶的類型，探討其對亞胺培南類抗生素的耐藥機制。方法 收集該院對碳青霉烯類藥物敏感、中介或耐藥的鮑曼不動桿菌株162株，用瓊脂紙片擴散法(K-B法)及肉湯稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)，用聚合酶鏈反應(PCR)檢測其耐藥基因。結果 60株耐藥細菌均為多重耐藥株，PCR檢出47株攜帶OXA-23基因，3株攜帶OXA-24基因，85株敏感株均未檢出OXA-23及OXA-24基因，各年份與2008年對亞胺培南類藥物敏感性以及耐藥基因OXA-23基因攜帶率比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。結論 攜帶OXA-23和OXA-24碳青霉烯酶基因的鮑曼不動桿菌對臨床常用亞胺培南類抗生素的耐藥率明顯增高，且伴隨用藥時間延長呈逐年上升趨勢。

鮑曼不動桿菌；碳青霉烯酶；耐藥基因

鮑曼不動桿菌(AB)是醫(yī)院感染常見病原菌，廣泛存在于自然界、人體皮膚等環(huán)境中，是醫(yī)院感染主要的條件致病菌之一，常引起醫(yī)院獲得性肺炎、敗血癥、尿道感染、傷口感染；特別是免疫受損、術后患者以及老年患者的原發(fā)感染或繼發(fā)感染，病原體種類多見于革蘭陰性桿菌中的鮑曼不動桿菌。抗菌譜較廣的碳青霉烯類抗生素，殺菌活性強，常作為治療革蘭陰性菌感染的最強有力的藥物，是免疫功能低下重癥感染的老年患者的首選藥物。然而，隨著臨床碳青霉烯類抗生素的長時間廣泛應用，鮑曼不動桿菌對其出現(xiàn)耐藥性，且呈現(xiàn)逐年增多趨勢〔1〕。本研究就我院碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌分子流行病學及耐藥機制進行初步分析。

1 材料和方法

1.1 一般資料 收集2008～2013年我院收治60歲以上所有發(fā)生院內(nèi)感染的患者臨床標本共648份。診斷依據(jù)2001年衛(wèi)生部頒布的醫(yī)院內(nèi)感染診斷標準〔2〕。

1.2 菌株來源 分別培養(yǎng)648例發(fā)生院內(nèi)感染的老年患者不同感染部位的組織標本、血液標本和感染部位分泌物標本，共獲得162株鮑曼不動桿菌菌株，確認發(fā)生鮑曼不動桿菌感染，呼吸道感染占70.99%，尿路感染占0.62%，傷口創(chuàng)面感染占20.37%，導管相關血流感染占0.62%，敗血癥患者占1.85%。

1.3 細菌鑒定 所有標本培養(yǎng)方法均按全國操作規(guī)程完成，細菌分離培養(yǎng)后均應用VII'EK全自動微生物分析儀(法國梅里埃公司)進行鑒定。同一患者同一部位相同菌種標本，收集時間在5 d內(nèi)為同一菌株，不重復進行統(tǒng)計。

1.4 抗菌藥物選擇和藥敏試驗 采用標準K-B紙片擴散法，藥敏紙片購自中國藥品生物制品檢定所，操作及結果判斷按照美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)2010年版標準〔3〕。選擇阿米卡星、氨曲南、氨芐西林/舒巴坦、慶大霉素、亞胺培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢哌酮/舒巴坦、妥布霉素、替卡西林/克拉維酸等16種抗生素。

1.5 耐藥基因檢測 PCR擴增OXA-23及OXA-24基因〔4〕。①采用酚、氯仿抽提法提取鮑曼不動桿菌DNA，通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析DNA制品質量。②PCR 擴增反應體系：2×Taq PCR MasterMix 10 μl，正、反義引物(10 pmol/L)各1 μl，模板1 μl，dsH2O 7 μl。OXA-23及OXA-24基因擴增的循環(huán)參數(shù)：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，42℃ 45 s，72℃ 1 min，循環(huán)30次；最后72℃延伸8 min。③1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。所用試劑購于北京天根生化科技公司。OXA-23基因引物：正義5′-GATGTGTCATAGTATTCGTCG-3′，反義5′-TCACAACAACTAAAAGCACTG-3′，產(chǎn)物長度1 067 bp；OXA-24基因引物：正義5′-ATGAAAAAATTTATACTTCCTATATTCAGC-3′，反義5′-TTAAATGATTCCAAGATTTTCTAGC-3′，產(chǎn)物長度825 bp。引物合成由上海生工公司完成。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SAS8.0軟件行χ2檢驗。

2 結 果

2.1 162株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌來源及逐年耐藥情況 對鮑曼不動桿菌感染部位分析，在痰液〔115株(70.99%)〕和傷口分泌物〔33例(20.37%)〕中檢出率較高，與血液標本〔3例(1.85%)〕、尿液〔(1例(0.62%)〕、腦脊液〔6例(3.70%)〕、胸水〔2例(1.23%)〕、膽汁〔1例(0.62%)〕、引流液〔1例(0.62%)〕總和比較，存在統(tǒng)計學差異(χ2=57.09，P<0.01)。162株鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類的敏感性隨著給藥時間逐年遞增，敏感性呈下降趨勢，在2008年為97.2%，到2013年降至40%，二者比較有極顯著性差異(χ2=13.94，P<0.01)，但2008年與2009年比較沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1。

2.2 鮑曼不動桿菌對亞胺培南耐藥基因檢測 選擇60株對亞胺培南耐藥的鮑曼不動桿菌菌株，分別利用PCR技術檢測OXA-23和OXA-24基因，發(fā)現(xiàn)47株鮑曼不動桿菌中耐藥基因OXA-23陽性，3株鮑曼不動桿菌OXA-24基因陽性；且隨著亞胺培南類抗生素應用時間延長，耐藥基因OXA-23陽性率逐年上升，與2008年的統(tǒng)計結果有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，但OXA-24基因的分布沒有統(tǒng)計學意義，見表2。85株敏感株均未檢出OXA-23及OXA-24基因，17株中度敏感菌株未行基因檢測。

表1 鮑曼不動桿菌對亞胺培南敏感情況〔n(%)〕

與2008年比較：1)P<0.05；2)P<0.01

表2 鮑曼不動桿菌對亞胺培南耐藥基因OXA-23和OXA-24的分布情況〔n(%)〕

3 討 論

鮑曼不動桿菌是一類不發(fā)酵糖類、氧化酶陰性、沒有動力的革蘭陰性細菌，能夠在醫(yī)院環(huán)境中長期生存，在機體抵抗力下降或免疫功能受損時易引起各種感染，包括肺炎、皮膚、尿路感染，特別是插管相關感染甚至敗血癥等，是目前引起醫(yī)院內(nèi)感染的常見重要病原菌。隨著抗生素廣泛應用，鮑曼不動桿菌對臨床常用藥物的耐藥性正在逐年上升，甚至對碳青霉烯類抗生素高耐藥。據(jù)文獻報道鮑曼不動桿菌對碳青霉烯耐藥的主要分子機制有〔5〕：①產(chǎn)生碳青霉烯酶；②細菌外膜蛋白通透性降低和主動外排泵系統(tǒng)的亢進使細菌內(nèi)有效藥物濃度減少；③青霉素結合蛋白改變導致與藥物親和力降低等。其中，產(chǎn)碳青霉烯酶是其主要耐藥機制，其碳青霉烯酶分為A、B、D 三類，D 類碳青霉烯酶按同源性可分為2 組：第1 組包括OXA-23 和OXA-27，它們只差2 個氨基酸，同源性達99%；第2 組包括OXA-24，OXA-25，OXA-26，同源性98%，兩組之間的同源性僅為60%〔6〕。王輝等〔7〕報道國內(nèi)耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌80%產(chǎn)OXA-23 型碳青霉烯酶，使臨床上耐碳青霉烯類藥物的不動桿菌的治療十分困難。

本研究發(fā)現(xiàn)下呼吸道、皮膚和尿路感染比較多見，且對亞胺培南的耐藥性呈現(xiàn)逐年上升趨勢，耐藥性形成與OXA-23，OXA-24基因密切相關。經(jīng)過對耐藥菌株和部分敏感菌株的OXA型碳青霉烯酶屬絲氨酸蛋白酶OXA-23和OXA-24基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)在耐藥菌株攜帶率較高，在敏感菌株幾乎沒有攜帶，與周敏等〔8〕研究結果報道相似。耐藥基因 OXA-23位于CRAB質粒上，容易發(fā)生直接播散或通過整合子進行水平傳播；OXA-24位于細菌染色體上，只能發(fā)生克隆株的水平傳播，即通過病人或器械相互接觸傳播，需要引起臨床醫(yī)生關注。在臨床中除對藥物應用進行監(jiān)管，并做到合理應用外，還需對呼吸機做到合理應用及嚴格消毒，減少耐藥菌的出現(xiàn)和擴散。嚴格消毒隔離措施、手衛(wèi)生及抗生素的合理應用是控制多重耐藥鮑曼不動桿菌的關鍵環(huán)節(jié)。

1 李 春.鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥機制研究進展〔J〕.國外醫(yī)藥·抗生素分冊，2009；30(2)：54-6.

2 中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)院感染診斷標準(試行)〔J〕.中華醫(yī)學雜志，2001；81(5)：314-20.

3 Chang CJ，Ye JJ，Yang CC，etal.Influence of third-generation cephalosporin resistance on adult in-hospital mortality from post-neurosurgical bacterial meningitis〔J〕.J Microbiol Immunol Infect，2010;43(4)：301-9.

4 Fu Y，Zhou J，Zhou H，etal.Wide dissemination of OXA-23-producing carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clonal complex 22 in multiple cities of China〔J〕.J Antimicrob Chemother，2010;65(4)：644-50.

5 Fernandez-Cuenca F，Martinez Martinez L，Conejo MC，etal.Relationship between beta-lactamase production，outermembrane protein and penicillin-binding protein profileson the activity of carbapenems against clinical isolates ofAcinetobacter baumannii 〔J〕.Antimicrob Chemother，2003；51(3)：565-74.

6 Turton JF，Woodford N，Glover J，etal.Identification of Acinetobacter baumannii by detection of the bla OXA-51-like carbapenemase gene intrinsic to this species〔J〕.J Clin Microbiol，2006;44(7)：2974-9.

7 王 輝，孫宏莉，廖 康，等.北京和廣州地區(qū)四家醫(yī)院不動桿菌碳青霉烯酶基因型研究〔J〕.中華檢驗醫(yī)學雜志，2005;28(6)：636-7.

8 周 敏，黃 茂，梅亞寧.鮑曼不動桿菌OXA-23 型碳青霉烯酶相關耐藥基因分析〔J〕.南京醫(yī)科大學學報，2009；29(8)：1142-3.

〔2014-09-17修回〕

(編輯 李相軍)

河北省科技計劃項目(11276103D-62)

劉金霞(1969-)，女，主任醫(yī)師，博士，碩士生導師，主要從事病原生物學研究。 李紅松(1971-)，女，主治醫(yī)師，主要從事病原生物學研究。

劉 英(1983-)，男，在讀碩士，主要從事細菌學研究。

R181.3

A

1005-9202(2015)12-3375-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.088

1 承德市雙橋區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督所