C-型鈉尿肽對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞PCNA、P53和P21表達(dá)的影響

劉明新 陶貴周 游 陸 劉奇峰

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

C-型鈉尿肽對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞PCNA、P53和P21表達(dá)的影響

劉明新 陶貴周 游 陸 劉奇峰

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

目的 觀察C-型鈉尿肽(CNP)對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中PCNA、P53、P21表達(dá)水平的影響。方法 傳代培養(yǎng)大鼠A10主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，并分為空白對(duì)照組及CNP組，其中CNP組給予10-6mol/L CNP處理24 h，應(yīng)用MTT法檢測(cè)兩組VSMC的增殖能力；應(yīng)用RT-PCR 和 Western印跡方法檢測(cè)兩組PCNA、P53、P21表達(dá)水平。結(jié)果 CNP組VSMC增殖能力較對(duì)照組明顯下降(P<0.01)；RT-PCR 和 Western印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，CNP組PCNA表達(dá)明顯被抑制(P<0.01)，而P53、P21表達(dá)水平則明顯增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)論 CNP可以通過(guò)抑制PCNA表達(dá)，同時(shí)上調(diào)P53、P21表達(dá)，從而抑制VSMC的增殖。

C-型鈉尿肽；PCNA；P53；P21

血管重塑是涉及高血壓、冠心病等血管相關(guān)疾病的共同病理生理過(guò)程，而血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)向內(nèi)膜下增殖與遷移是造成血管重塑的重要病理基礎(chǔ)〔1～3〕。因此，有效抑制VSMC的增殖與遷移成為防治血管重塑的重點(diǎn)。C-型鈉尿肽(CNP)是Sudoh等于1990 年發(fā)現(xiàn)的心血管活性多肽，屬鈉尿肽家族成員。文獻(xiàn)報(bào)道，CNP能夠有效抑制VSMC的增殖與遷移，從而在防治血管重塑的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用〔4～7〕。本文觀察CNP 對(duì)大鼠VSMC中PCNA、P53、P21表達(dá)水平的影響，探討CNP抑制VSMC增殖的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠A10主動(dòng)脈VSMC株(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))；胎牛血清(杭州四季青公司)；CNP、胰蛋白酶、二甲基亞砜(Sigma公司)；PCNA小鼠抗大鼠單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、P53、P21小鼠抗大鼠單克隆抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) VSMC采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10%的FBS)，細(xì)胞在5%CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)。每2～3天予以換液一次。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，予以傳代。

1.3 細(xì)胞分組 培養(yǎng)的VSMC分為：空白對(duì)照組；CNP組(10-6mol/L CNP刺激24 h)。

1.4 MTT法檢測(cè)VSMC的增殖能力 于96孔板中以5×104個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種，每孔加含10% FBS且不含抗生素的DMEM 200 μl，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%后，分組同上，每組5孔，于24 h終止培養(yǎng)，終止前每孔加入5 g/L 的MTT溶液20 μl，繼續(xù)孵育4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，選用490 nm波長(zhǎng)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度(A)，取平均數(shù)。

1.5 RT-PCR法檢測(cè)PCNA、P53和P21的表達(dá) 具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書。反應(yīng)條件：94℃ 5 min ；93℃ 變性30 s，(PCNA為 56℃；P53為57℃；P21為54℃ )退火30 s，72℃ 延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后取 5 μl PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析(120 V，45 min)，DNAgreen染色，凝膠自動(dòng)成像分析系統(tǒng)掃描成像，以GAPDH為內(nèi)參。PCNA上游引物為：5′-GGGGTGAAGTTTTCTGCGAG-3′，下游引物5′-CGATCTTGGGAGCCAAATAATAC-3′；P53上游引物為：5′-GTGGCCTCTGTCATCTTCCG-3′，下游引物為5′-CCGTCACCATCAGAGCAACG-3′；P21上游引物為：5′-TCCGATCCTGGTGATG-3′，下游引物為：5′-TCTGTTAGGCTGGTCTGC-3′；內(nèi)參GAPDH的上游引物為：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物為：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.6 Western印跡檢測(cè)PCNA、P53和P21蛋白表達(dá) 加入RIPA裂解液(50 mmol/L tris-HCI，pH7.5；1 mmol/L PMSF，0.1 mmol/L，50 mmol/L NaCI，1 mmol/L EDTA，NaVO4，10 mg/ml aprotinin，10 mg/ml LeuPePtin)200 μl裂解細(xì)胞，將蛋白濃度調(diào)至5 μg/μl。以每孔50 μg的含量加樣，SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離。轉(zhuǎn)膜于PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入1∶300稀釋的PCNA小鼠抗大鼠單克隆抗體、P53小鼠抗大鼠單克隆抗體、P21小鼠抗大鼠單克隆抗體、β-actin小鼠抗大鼠單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜。TTBs洗膜5 min×3，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，TTBs洗膜5 min×2，TTBs洗膜5 min×1，加DAB液顯色5～10 min。凝膠成像分析系統(tǒng)成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行one-way ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1 CNP對(duì)VSMC增殖能力的影響 MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組比較，CNP組VSMC增殖能力明顯下降(0.106±0.025 vs 0.288±0.037，P<0.01)。

2.2 CNP對(duì)VSMC中PCNA、P53和P21 mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：CNP組PCNA mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(P<0.01)；而與對(duì)照組比較，CNP組P53和P21 mRNA表達(dá)則明顯增強(qiáng)(P<0.01)。見圖1。

2.3 CNP對(duì)VSMC中PCNA、P53和P21蛋白表達(dá)的影響 Western印跡結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，CNP組PCNA蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，而P53和P21蛋白的表達(dá)則明顯增強(qiáng)(P<0.01)。見圖2。

圖1 兩組PCNA、P53和P21 mRNA表達(dá)水平

圖2 兩組PCNA、P53和P21蛋白表達(dá)水平

3 討 論

眾多學(xué)者在探索中逐漸意識(shí)到血管重塑是涉及血管相關(guān)疾病的共同病理生理過(guò)程，而血管中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜下遷移與增殖是血管重塑的主要病理基礎(chǔ)之一。

近年來(lái)，CNP逐漸引起人們的重視。文獻(xiàn)報(bào)道，CNP具有利尿鈉、舒張血管、參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分裂以及促進(jìn)骨形成等作用〔8～10〕。目前更是被證實(shí)可以抑制VSMC的增殖和遷移，從而在維持血管功能穩(wěn)態(tài)以及防治血管損傷性疾病中具有重要的調(diào)節(jié)作用〔11～13〕，但其機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞周期是增殖信號(hào)傳導(dǎo)的最終共同通路，其主要有兩個(gè)調(diào)控點(diǎn)，其中之一為G1/S轉(zhuǎn)折點(diǎn)，即調(diào)控細(xì)胞由DNA合成準(zhǔn)備期至DNA合成期；另一調(diào)控點(diǎn)為G2/M轉(zhuǎn)折點(diǎn)，可以控制細(xì)胞一分為二。細(xì)胞周期的調(diào)控主要依賴周期素(cyclins)、周期素依賴激酶(CDKs)以及周期素依賴激酶抑制蛋白。G1早期時(shí)周期蛋白 D1(cydinD1)及CDK4表達(dá)增加，形成復(fù)合物后從而使Rb磷酸化，并釋放出E2F，而E2F可上調(diào)進(jìn)入S期的必須蛋白的表達(dá)；G1中晚期則由 cylinE/CDK2調(diào)節(jié)；而S期由cyclinA/CDK2調(diào)節(jié)；此外，細(xì)胞周期通過(guò)Gl期也需要抑制cyclin/CDK復(fù)合物酶活性的腫瘤抑制基因的失活，如P53、P21等〔14〕。

PCNA屬細(xì)胞增殖周期相關(guān)基因，在細(xì)胞的增殖中起著重要作用。PCNA主要在細(xì)胞核中表達(dá)，為細(xì)胞增殖的必需條件，細(xì)胞分裂時(shí)可促進(jìn)DNA引導(dǎo)鏈和隨從鏈的合成，且可以與CDK和cyclin結(jié)合從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。PCNA在G1后期開始表達(dá)，高峰期為S期，于G2期和M期開始下降，其含量與DNA合成一致。P53和P21蛋白是CDK抑制物。其中，P21蛋白能特異地與cyclin E/CDK2復(fù)合物結(jié)合，從而抑制CDK2活性，而P53蛋白則通過(guò)上調(diào)P21蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制CDK2 活性。激活的CDK4、CDK2通過(guò)使Rb蛋白磷酸化，從而促使細(xì)胞向G1/S期轉(zhuǎn)變，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。由此可見，P53、P21蛋白能夠抑制CDK4、CDK2活性，并抑制細(xì)胞周期向S期轉(zhuǎn)變，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。本研究顯示，CNP組PCNA mRNA和蛋白水平的表達(dá)均較對(duì)照組明顯降低，而P53和P21mRNA和蛋白水平則較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，表明CNP可通過(guò)抑制PCNA表達(dá)，并上調(diào)P53和P21表達(dá)從而抑制VSMC的增殖。

1 Li G，Chen SJ，Oparil S，etal.Direct in vivo evidence demonstrating neointimal migration of adventitial fibroblasts after balloon injury of rat carotid arteries〔J〕.Circulation，2000；101(12)：1362-5.

2 Schwartz RS，Henry TD.Pathophysiology of coronary artery restenosis〔J〕.Rev Cardiovasc Med，2002；3(suppl 5)：4-9.

3 Xu Y，Arai H，Murayama T，etal.Hypercholesterolemia contributes to the development of atherosclerosis and vascular remodeling by recruiting bone marrow-derived cells in cuff-induced vascular injury〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2007；363(3)：782-7.

4 陳晶晶，齊永芬，姜志勝.C型鈉尿肽與血管損傷性疾病〔J〕.生理科學(xué)進(jìn)展，2008；39(2)：119-23.

5 曾能初，劉海泉，周華明.淺談利鈉肽在心血管疾病中的應(yīng)用〔J〕.求醫(yī)問(wèn)藥，2012；10(4)：674-5.

6 郭天興，韓 濤.轉(zhuǎn)基因防治冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后再狹窄的目的基因選擇〔J〕.醫(yī)學(xué)臨床研究，2006；23(1)：115-8.

7 宋錦文，程彥斌，曉 紅，等.血管活性肽在血管再狹窄中的作用〔J〕.西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志，2003；24(6)：447-9.

8 周 婷，馬厚勛.利鈉因子家族與心力衰竭關(guān)系及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013；29(12)：1849-52.

9 姜曰水，陳 蘊(yùn)，金 堅(jiān).鈉尿肽受體的結(jié)構(gòu)特征及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制〔J〕.中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2013；43(5)：368-75.

10 竇 麗，張 釣，黃叔懷.C-型利鈉利尿鈦與心血管疾病〔J〕.心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2003；12(5)：475-8.

11 Potter LR.Regulation and therapeutic targeting of peptide-activated receptor guanylyl cyclases〔J〕.Pharmacol Ther，2011；130(1)：71-82.

12 肖 樂(lè)，龔昆梅，王昆華，等.C型利鈉肽在髂動(dòng)脈球囊成形術(shù)后再狹窄發(fā)生中的作用〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011；36(10)：1176-9.

13 白玲強(qiáng)，劉朝中，田建偉，等.C型鈉尿肽在糖尿病兔股動(dòng)脈狹窄中的作用〔J〕.中國(guó)介入心臟病學(xué)雜志，2009；17(5)：276-9.

14 Muller DW.The role of proto-oncogenes in coronary restenosis〔J〕.Prog Cardiovasc Dis，1997；40(2)：117-28.

〔2013-12-03修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢(mèng)園)

遼寧省醫(yī)學(xué)高峰建設(shè)工程項(xiàng)目(2010075)

劉奇峰(1980-)，女，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，主要從事冠心病基礎(chǔ)與臨床研究。

劉明新(1975-)，男，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，主要從事冠心病基礎(chǔ)與臨床研究。

R543.12

A

1005-9202(2015)12-3276-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.039