解旋酶RECQ1和細(xì)胞核相關(guān)抗原 Ki-67在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及相關(guān)性

郭成永 梁朝輝 魏可欣 孫國柱 焦保華 趙宗茂

(保定市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 保定 071000)

解旋酶RECQ1和細(xì)胞核相關(guān)抗原 Ki-67在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及相關(guān)性

郭成永 梁朝輝 魏可欣1孫國柱 焦保華 趙宗茂

(保定市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 保定 071000)

目的 分析解旋酶RECQ1和細(xì)胞核相關(guān)抗原 Ki-67在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其相關(guān)性。方法 選取該院神經(jīng)外科收治的腦膠質(zhì)瘤手術(shù)治療患者80例，根據(jù)病理學(xué)分級分為Ⅰ～Ⅱ級44例，Ⅲ～Ⅳ級36例，另外選取正常腦組織20例，利用免疫組化法檢測RECQ1、Ki-67的表達(dá)情況，計算RECQ1、Ki-67表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 ①RECQ1、Ki-67在正常腦組織中表達(dá)呈陰性，在膠質(zhì)瘤組織表達(dá)呈陽性；RECQ1、Ki-67在Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤組織中多為低表達(dá)，在Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中多為高表達(dá)；②RECQ1在正常腦組織中無表達(dá)，Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤組織RECQ1表達(dá)率與Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織比較明顯降低(P<0.05)；③Ki-67在正常腦組織組織中無表達(dá)，Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤組織RECQ1表達(dá)率為75%，與Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織比較明顯降低(P<0.05)；④膠質(zhì)瘤組織中RECQ1和Ki-67表達(dá)均為陽性的有57例(71.3%)，均為陰性的有14例(17.5%)。RECQ1陽性但Ki-67陰性的有4例(5%)，RECQ1陰性但Ki-67陽性的有5例(6.2%)，RECQ1和Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)(r= 0.768，P<0.01)。結(jié)論 RECQ1和Ki-67的表達(dá)隨著腦膠質(zhì)瘤組織惡性程度的增高而升高，且兩者正相關(guān)。

腦膠質(zhì)瘤；解旋酶RECQ1；Ki-67；相關(guān)性

腦膠質(zhì)瘤多發(fā)于中青年人群，我國腦膠質(zhì)瘤患者的發(fā)病率為每年3～6人/10萬人，并且以每年1.2%的增長率逐年上升，死亡人數(shù)每年可達(dá)3萬人〔1〕。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采取手術(shù)、放療、化療等療法〔2〕，但由于本病生長部位特殊，很難根除，而且極易復(fù)發(fā)，預(yù)后并不理想。研究發(fā)現(xiàn)，解旋酶RECQ1存在于多種腫瘤中，而缺乏RECQ1基因的腫瘤細(xì)胞增殖、分化受到抑制〔3〕。有報道稱，向小鼠腫瘤部位注射對RECQ1起沉默作用的RNA，可以明顯抑制小鼠腫瘤的生長，RECQ1可以作為治療腦膠質(zhì)瘤的新靶點進(jìn)行研究〔4〕。筆者通過觀察腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中RECQ1、Ki-67表達(dá)情況以及兩者的相關(guān)性等指標(biāo)，探索腦膠質(zhì)瘤治療的新靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2014年1月于我院以腦膠質(zhì)瘤為診斷而收入院進(jìn)行手術(shù)治療的患者80例，男42例，女38例，平均年齡(45.3±5.3)歲，患者均未采用放療、化療等手段治療，無其他惡性腫瘤性疾病。術(shù)中取得的膠質(zhì)瘤組織，依照世界衛(wèi)生組織2010年的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)分級〔5〕，其中Ⅰ～Ⅱ級44例，Ⅲ～Ⅳ級36例；正常腦組織20例，取自腦外傷進(jìn)行減壓術(shù)的患者，男13例，女7例，平均年齡(42.7±6.1)歲。兩組患者的一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?；颊呒凹覍僮栽竻⑴c本實驗，并簽署知情同意書。方案獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)并全過程跟蹤。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人RECQ1多克隆抗體(GeneTex)；兔抗人Ki-67單克隆抗體(上海領(lǐng)成)；二抗免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉)；PBS、多聚甲醛溶液(自配)；自動包埋機(湖北慧達(dá))；切片機(無錫華寶)；細(xì)胞培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱(上海佳航)；光學(xué)顯微鏡(德國Leica)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本制備 每例分別取1 cm×1 cm×0.5 cm大小的膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織，置于40 g/L多聚甲醛溶液中2 h進(jìn)行固定，之后采用95%乙醇脫水，經(jīng)2 h浸蠟，用自動包埋機制成蠟塊，切片機制成厚度為4 μm的切片〔6〕。

1.3.2 免疫組化染色法 按照抗體說明書進(jìn)行操作，將制備好的切片置入恒溫干燥箱中1 h，設(shè)置溫度為60℃；分別利用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟15 min；利用不同梯度乙醇(無水、95%、80%乙醇)逐級脫水：蒸餾水水化；利用3%過氧化氫液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，在室溫下孵育30 min左右；用PBS液浸泡2次，5 min/次；切片浸入200 ml抗原修復(fù)液中修復(fù)，高壓加熱3 min，冷卻至室溫；擦凈組織表面液體，加入血清工作液，置入溫箱中1 h，溫度為37°，中和非特異性反應(yīng)；擦凈玻片，分別加入兔抗人RECQ1抗體、ki-67抗體(RECQ1濃度稀釋至1∶750，Ki-67濃度稀釋至1∶100)，置于4℃過夜；復(fù)溫后用PBS液浸泡2次，5 min/次；滴加生物素化二抗工作液，37℃孵育30 min；利用DAB染色；蘇木輕度復(fù)染3 min；之后利用不同濃度酒精(80%、95%、無水乙醇)脫水；封片采用中性樹膠。

1.3.3 鏡下觀察 由兩名病理醫(yī)師分別在高倍鏡(×400)下觀察各標(biāo)本，根據(jù)染色強度以及陽性細(xì)胞數(shù)評定RECQ1和 Ki-67的表達(dá)情況，兩位醫(yī)師的觀察結(jié)果對比后作為最終結(jié)果。陽性細(xì)胞著色為淡黃色至棕褐色顆粒，顏色越深、范圍越大，陽性率越強。根據(jù)染色程度評定標(biāo)準(zhǔn)〔7〕，1分：無染色或淡黃顆粒；2分：中等量棕黃顆粒；3分，棕色顆粒量大色深。根據(jù)陽性細(xì)胞計數(shù)，1分：陽性細(xì)胞少于5%；2分：存在5%～30%陽性細(xì)胞；3分：存在30%～65%陽性細(xì)胞；4分：存在65%以上的陽性細(xì)胞。染色程度得分×陽性細(xì)胞計數(shù)得分≤1分為陰性，2～6分屬于低表達(dá)(+)，>7分者屬高表達(dá)()。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗、χ2檢驗和秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化結(jié)果 染色呈淡黃色至棕褐色顆粒，為陽性；RECQ1、Ki-67在正常腦組織中表達(dá)呈陰性，在膠質(zhì)瘤組織表達(dá)呈陽性；RECQ1、Ki-67在Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤組織中多為低表達(dá)，在Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中多為高表達(dá)，見圖1。

2.2 膠質(zhì)瘤組織、正常腦組織中RECQ1、Ki-67的表達(dá)率比較 RECQ1、Ki-67在正常腦組織組織中無表達(dá)，Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤組織表達(dá)率與Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織比較明顯降低(P<0.05)，見表1。

正常腦組織RECQ1

正常腦組織Ki-67

Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤RECQ1

Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤Ki-67

Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤RECQ1

Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤Ki-67

表1 膠質(zhì)瘤組織、正常腦組織中RECQ1、Ki-67的表達(dá)比較〔n(%)〕

組別nRECQ1陰性低表達(dá)高表達(dá)表達(dá)率Ki?67陰性低表達(dá)高表達(dá)表達(dá)率Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤363(8 3)6(16 7)27(75 00)33(91 7)5(13 9)7(19 4)24(66 7)31(86 1)Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤4413(29 5)26(59 1)5(11 4)31(70 5)1)11(25 0)25(56 8)8(18 2)33(75 0)1)正常腦組織2020(100 0)0(0)0(0)020(100 0)0(0)0(0)0

與Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織比較：1)P<0.05

2.3 膠質(zhì)瘤組織中RECQ1和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性 膠質(zhì)瘤組織中RECQ1和Ki-67表達(dá)均為陽性的有57例(71.3%)，均為陰性的有14例(17.5%)。RECQ1陽性但Ki-67陰性的有4例(5%)，RECQ1陰性但Ki-67陽性的有5例(6.2%)，RECQ1和Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.768，P<0.01)。

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤來源于神經(jīng)上皮細(xì)胞，其發(fā)生可能與遺傳因素、電離輻射、亞硝基化合物、病毒感染、空氣污染等導(dǎo)致的基因突變有關(guān)〔8〕，隨著社會的發(fā)展，環(huán)境污染的加重及人們生活方式的轉(zhuǎn)變，腦膠質(zhì)瘤發(fā)病率不斷上升。腦膠質(zhì)瘤多呈浸潤性生長，手術(shù)難度大，且對放療、化療等治療方式敏感性差，極易復(fù)發(fā)，這些特點使得其具有較高的死亡率，引起醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，近年來基因工程飛速發(fā)展，尋找新的治療靶點成為目前常見的研究方向。解旋酶RECQ1屬于解旋酶家族的一種，具有催化DNA、RNA鏈解旋的作用，能夠促進(jìn)DNA的復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄，在多種腫瘤組織中為高表達(dá)，對腫瘤組織的增殖分化起到重要作用。資料顯示，若RECQ1存在缺陷，腫瘤細(xì)胞的基因穩(wěn)定性受到影響，增殖減慢〔9〕。Ki-67是一種核抗原，其在腫瘤細(xì)胞中等的作用已被證實，它與細(xì)胞周期有關(guān)，在腫瘤細(xì)胞中具有高表達(dá)率，是反映惡性細(xì)胞增殖活躍程度的指標(biāo)〔10〕。

本研究結(jié)果提示RECQ1、Ki-67在膠質(zhì)瘤組織表達(dá)率越高，腫瘤組織惡性程度越高，細(xì)胞增殖越快；相關(guān)性分析結(jié)果顯示Ki-67的表達(dá)隨RECQ1表達(dá)增高而升高，受其調(diào)控。

1 許志強，徐倫山，蔣曉江，等.腦膠質(zhì)瘤的臨床治療進(jìn)展〔J〕.中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2010;8(4):431-5.

2 徐國政，袁先厚.腦膠質(zhì)瘤靶向治療新進(jìn)展〔J〕.中國臨床神經(jīng)外科雜志，2011;16(9):568-72.

3 熊曉鵬，胡超蘇.腦膠質(zhì)瘤的放射治療臨床研究進(jìn)展〔J〕.中國神經(jīng)腫瘤雜志，2006;4(3):173-9.

4 吳小璐，楊初蔚，張建生，等.腦膠質(zhì)瘤危險因素的病例-對照研究〔J〕.中國臨床神經(jīng)外科雜志，2008;13(7):400-1，405.

5 翟曉東.RECQ1解旋酶在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義〔D〕.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2013.

6 蘇鈺清，李蘭梅，高建洲，等.cyclinA和Ki-67在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013;22(3):229-30，238.

7 蘇鈺清，李蘭梅，王獻(xiàn)明，等.cyclinA及相關(guān)因子p27～(kip1)、Ki-67在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及相關(guān)分析〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013;24:2626-8.

8 朱 航，雷 迅，張 帆，等.腦膠質(zhì)瘤危險因素Meta分析及危險因素控制后發(fā)病率的變化趨勢〔J〕.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012;6:554-8.

9 任 華.RecQ解旋酶分子特性的研究〔D〕.華東師范大學(xué)，2010.

10 王獻(xiàn)明，蘇鈺清，李蘭梅.p27～(kip1)和Ki-67在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012；21(25):2739-40.

〔2014-11-16修回〕

(編輯 李相軍)

河北省衛(wèi)生廳科研基金項目(20130511)

焦保華(1954-)，男，主任醫(yī)師，主要從事膠質(zhì)瘤研究。

郭成永(1974-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事膠質(zhì)瘤研究。

R739.41

A

1005-9202(2015)12-3259-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.032

1 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科