維生素D受體基因多態(tài)性與Graves病易感性的關(guān)系

龍 雄 吳文飛 胡卓清 周智明

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院急診科，廣東 中山 528415)

維生素D受體基因多態(tài)性與Graves病易感性的關(guān)系

龍 雄 吳文飛 胡卓清 周智明

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院急診科，廣東 中山 528415)

目的 探討維生素D受體(VDR)基因ApaI(rs7975232)單核苷酸多態(tài)性與漢族人群Graves病的關(guān)系。方法 選取Graves病患者260例和對(duì)照組221例，收集相關(guān)資料，檢測(cè)甲狀腺相關(guān)激素及25羥維生素D〔25(OH)D〕水平。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)對(duì)樣本基因分型。分析基因多態(tài)性與Graves病、25(OH)D與促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)滴度之間的相關(guān)性，25(OH)D及TRAb水平在不同基因型者之間的差異。結(jié)果 (1)Graves病組C等位基因及CC基因型分布頻率高于對(duì)照組(C vs.A：57.1% vs.47.3%，χ2=9.260，P=0.002；CC vs.AA：χ2=7.912，P=0.005)；相對(duì)于基因型AA者，CC基因型增加Graves病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.003，95%CI：1.235～3.246)。(2)Graves病初發(fā)組中，血清25(OH)D水平較對(duì)照組顯著降低〔(14.74±3.10)vs(20.98±2.82)ng/ml，F(xiàn)=50.9，P<0.001〕；25(OH)D與TRAb水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.264，P=0.035)；AA基因型者25(OH)D水平較CC+AC基因型者高〔(16.12±3.28)vs(14.16±2.86)ng/ml，F(xiàn)=2.975，P=0.039〕，而TRAb值較低〔(11.65±3.90)vs(18.12±8.63)IU/L，F(xiàn)=3.244，P=0.028〕。結(jié)論 VDR基因ApaI(rs7975232)多態(tài)性可能與漢族人群 Graves病及其25(OH)D、TRAb水平相關(guān)；Graves病初發(fā)組患者伴隨低25(OH)D，且與TRAb負(fù)相關(guān)。

Graves?。痪S生素D受體；基因多態(tài)性

Graves 病是針對(duì)甲狀腺自身組織產(chǎn)生特異性抗體為特征的自身免疫復(fù)雜性疾病，確切病因仍不清楚。維生素D活化的關(guān)鍵酶及其受體是調(diào)節(jié)固有及適應(yīng)性免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要環(huán)節(jié)〔1，2〕。維生素D水平及其受體(VDR)的表達(dá)異?？赡苁侵翯raves病的免疫機(jī)制之一。研究表明多種自身免疫性疾病包括Graves病伴隨低維生素D水平及異常VDR表達(dá)〔3〕，在自身免疫疾病中研究較多的為FokI(rs10735810)，TaqI(rs731236)，BsmI(rs1544410)和 ApaI(rs7975232)多態(tài)性。Feng等〔4〕分析表明ApaI(rs7975232)多態(tài)性與Graves病易感性不相關(guān)，而在日本人群中發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性不僅與Graves病相關(guān)，它還可能通過(guò)影響促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)表達(dá)而參與Graves病的發(fā)生及發(fā)展〔5〕。本研究將探討漢族人群中ApaI(rs7975232)與Graves病遺傳易感性的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象與分組 病例組入選標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)內(nèi)科學(xué)Graves病的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕，且排除Graves病以外伴(或)曾患其他免疫性疾病者。收集2012年1月至2014年12月在中山市小欖人民醫(yī)院和廣東醫(yī)附院內(nèi)分泌科門診就診或住院的Graves病患者260例(男65例，女195例)，平均年齡(37.92±16.22)歲。健康對(duì)照組選取同期體檢中心健康者221例(男61例，女160例)，平均年齡(36.00±14.46)，排除有免疫性疾病史和(或)有家族史者。為比較25羥維生素D〔25(OH)D〕水平在病例組與對(duì)照組中的區(qū)別，選取病例組中初發(fā)者64例(男16例，女48例)，平均年齡(32.95±14.52)歲，匹配年齡及性別后選定健康對(duì)照組中71例(男22例，女49例)，平均年齡(28.82±15.42)歲。其中初發(fā)者為未用藥治療而首次診斷為Graves病者。以上所有入選者均獲知情同意，無(wú)任何血緣關(guān)系，漢族，祖籍中山和湛江地區(qū)。

1.2 主要試劑與儀器 DNA提取用天根生化科技有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒，上海生工公司提供引物合成，寶生物公司提供引物合成及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)試劑盒。甲狀腺相關(guān)檢測(cè)項(xiàng)目：激離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺素(TSH)、TRAb及25(OH)D的檢測(cè)儀器為Roche Cobas e 601免疫分析儀，試劑盒為德國(guó)羅氏診斷有限公司配套試劑盒。正常參考范圍：FT3：3.1～6.8 pmo1/L；FT4：12～22 pmol/L；TSH：0.27～4.2 μIU/ml；TRAb：0～1.75 IU/L；25(OH)D≥18 ng/ml。

1.3 方法

1.3.1 受試者的資料采集 對(duì)受試者進(jìn)行基本資料的采集：包括年齡、性別、家族史、是否復(fù)發(fā)、治療情況、甲狀腺腫大情況及等級(jí)、是否突眼、家族史情況等。

1.3.2 DNA的提取 取受試者的外周抗凝靜脈血1 000 μl，用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA 100 μl，-80℃保存待測(cè)。

1.3.3 PCR擴(kuò)增目的片段 運(yùn)用Primer-Blast設(shè)計(jì)PCR引物，上游引物：5′GGGCACGGGGATAGAGAAGA3′，下游引物：5′CAGTGGTATCACCGGTCAGC3′。PCR產(chǎn)物大小144 bp，反應(yīng)體系25 μl：ExTaq 0.125 μl，10×Ex Taq Buffer 2.5 μl，MgCl22 μl，dNTP mixture 2 μl，上下游引物各0.5 μl，DNA模板1 μl，剩余高壓滅菌水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3 min，94°C變性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，終末72℃延伸10 min。取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物與1 μl 10×Loading buffer混合，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳(100 V，30 min)，觀察結(jié)果并拍照，只出現(xiàn)一條目的條帶者進(jìn)入下一步酶切實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 基因分型 取產(chǎn)物10 μl，ApaI 1 μl，buffer 2 μl，BSA 2 μl，高壓滅菌水補(bǔ)足至20 μl，在37°C水浴箱反應(yīng)4 ～6 h。反應(yīng)后取酶切產(chǎn)物5 μl與1 μl 10×Loading buffer混合，2%的瓊脂糖凝膠電泳(100 V，30 min)。直接在紫外儀下判斷基因型并拍照，結(jié)果為其他實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行盲法判讀。

2 結(jié) 果

2.1 分型結(jié)果 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)電泳圖中只出現(xiàn)一條144 bp條帶者為AA基因型，有144 bp、103 bp和41 bp 3條帶者為AC基因型，出現(xiàn)41 bp及103 bp兩條帶為CC基因型。見圖1。

1：AA基因型；2，4，6，7：CT基因型；3，5：CC基因型；M：Marker

2.2 正常對(duì)照組樣本基因型分布 經(jīng)檢驗(yàn)對(duì)照組P=0.065，符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3 Graves病組及對(duì)照組ApaI(rs7975232)多態(tài)性的分布 Graves病與對(duì)照組CC、AC和AA 3種基因型分布頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=8.185，P=0.017)，等位基因C、A頻率分布亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.260，P=0.002，OR=1.485，95%CI1.151～1.916)。采用基因遺傳的共性模型(CC vs.AC vs.AA)分析顯示，與AA基因型比較，CC個(gè)體有增加Graves病的患病風(fēng)險(xiǎn)(CC vs.AA：OR=2.003，95%CI：1.235～3.246，P=0.005)；CC vs.CA(χ2=3.370，P=0.066)及CA vs.AA(χ2=1.664，P=0.197)在兩組中的對(duì)比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義均P>0.05。見表1。

表1 兩組ApaI(rs7975232)多態(tài)性基因型與等位基因頻率比較〔n(%)〕

2.4 Graves病初發(fā)組與對(duì)照組血清25(OH)D水平比較 經(jīng)協(xié)方差分析校正年齡與性別后，血清25(OH)D水平在Graves病組的初發(fā)組與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異〔(14.74±3.10)vs.(20.98±2.82)ng/ml，F(xiàn)=50.9，P<0.001〕。

2.5 血清25(OH)D及TRAb水平在ApaI(rs7975232)多態(tài)性各基因型中的分布 協(xié)方差分析經(jīng)校正年齡與性別后在Graves病組的初發(fā)組中，3種不同基因型之間血清25(OH)D及TRAb水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)，與C等位基因攜帶者(CC+CA)相比，AA基因型的血清25(OH)D水平較高(F=2.975，P=0.039)，TRAb值較低(F=3.244，P=0.028)。見表2。

表2 ApaI(rs7975232)多態(tài)性與25(OH)D及TRAb的關(guān)系

與AA基因型比較：1)P<0.05；與AC基因型比較：2)P<0.05

2.6 Graves病初發(fā)組血清25(OH)D濃度與TRAb濃度的Spearman相關(guān)分析 Graves病組的初發(fā)組患者的血清25(OH)D濃度〔(14.74±3.10)ng/ml〕與TRAb濃度〔16.983±8.83)IU/L〕呈負(fù)相關(guān)(r=-0.264，P=0.035)。

3 討 論

1，25-二羥維生素D3屬于類固醇類激素超家族，VDR包括一類功能多樣的甲狀腺激素/維甲酸核受體家族成員及細(xì)胞膜受體。研究發(fā)現(xiàn)維生素D活化的關(guān)鍵酶1α羥化酶、(CYP27B1)及VDR的表達(dá)均十分廣泛，除表達(dá)于小腸、腎和骨細(xì)胞這些常見的組織細(xì)胞外，許多免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞及T/B淋巴細(xì)胞均表達(dá)1α羥化酶及VDR，其中VDR還可表達(dá)于甲狀腺細(xì)胞〔2〕。關(guān)鍵活化酶及受體的廣泛表達(dá)提示VDR信號(hào)通路非僅調(diào)節(jié)鈣磷代謝，還參與到多種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、免疫反應(yīng)及代謝等〔6，7〕。

已有多項(xiàng)研究表明維生素D表達(dá)和(或)VDR的異常與多種自身免疫性疾病包括Graves病密切相關(guān)〔4，5〕?；蚨鄳B(tài)性可影響VDR表達(dá)的結(jié)構(gòu)與功能，VDR的表達(dá)改變對(duì)靶細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)具有重要的意義。CD40-1C/T多態(tài)性可能與漢族人群Graves病發(fā)病相關(guān)。據(jù)估計(jì)位于染色體12q12-q14上的VDR基因序列存在超過(guò)30個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，而FokI(rs10735810)，TaqI(rs731236)，BsmI(rs1544410)和 ApaI(rs7975232)多態(tài)性是目前研究骨代謝及自身免疫疾病的熱點(diǎn)。TaqI(rs731236)，BsmI(rs1544410)和 ApaI(rs7975232)均為位于內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)非改變VDR編碼蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)，但研究顯示該3個(gè)位點(diǎn)彼此連鎖不平衡，被認(rèn)為可修飾VDR表達(dá)與功能的特殊內(nèi)含子多態(tài)性位點(diǎn)。ApaI(rs7975232)多態(tài)性與VDR mRNA轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性相關(guān)，可能影響下游VDR蛋白的翻譯與修飾。Inoue等〔5〕發(fā)現(xiàn)ApaI與日本人群Graves病發(fā)病相關(guān)，然而Feng等〔4〕meta分析亦顯示該多態(tài)性與高加索人Graves病遺傳易感性無(wú)明顯相關(guān)?？禆|紅等〔8〕以天津地區(qū)為研究對(duì)象，認(rèn)為ApaI不能作為預(yù)測(cè)Graves病的危險(xiǎn)性遺傳標(biāo)志，但該研究對(duì)照組樣本基因型分布經(jīng)檢驗(yàn)不符合Hardy-Weinberg平衡，且其未解釋不平衡的原因。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)的類似研究報(bào)道少，需要更廣泛代表的數(shù)據(jù)予證實(shí)ApaI多態(tài)性與中國(guó)人群Graves病的相關(guān)性。

ApaI多態(tài)性與Graves病相關(guān)性可能通過(guò)調(diào)節(jié)維生素D及間接影響TRAb滴度有關(guān)，其機(jī)制可能是：(1)Graves病患者外周血淋巴細(xì)胞VDR的缺陷表達(dá)對(duì)維生素D自身下調(diào)，再通過(guò)體液免疫相關(guān)細(xì)胞因子上調(diào)或下調(diào)致TRAb異常表達(dá)；(2)VDR致低25(OH)D是由于自身免疫性疾病中存在高 1，25(OH)2D3滴度的負(fù)反饋性調(diào)節(jié)。由于本院暫時(shí)無(wú)法直接測(cè)定1，25(OH)2D3滴度而未進(jìn)一步分析其相關(guān)性，是本次研究的局限性。VDR通路參與免疫平衡的機(jī)制目前并不十分明確，其參與固有及適應(yīng)性免疫過(guò)程呈非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，如VDR信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子可抑制Th1/Th17細(xì)胞、樹突細(xì)胞等的成熟分化，相反地促進(jìn)Th2及相關(guān)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)表達(dá)〔9，10〕。維生素D表達(dá)的異常和(或)其發(fā)揮作用的整條通路或是通過(guò)以上淋巴細(xì)胞參與自身性免疫炎癥形成，打破甲狀腺自身免疫耐受不可缺少的一環(huán)。目前無(wú)法鑒別Graves病初發(fā)組中低25(OH)D水平究竟是病因還是結(jié)果，因?yàn)槟壳暗难芯看蠖嗍怯^察性研究。

綜上所述，本研究初步提示VDR基因 ApaI多態(tài)性與漢族人Graves病及其25(OH)D水平、TRAb抗體水平相關(guān)。Graves病初發(fā)患者伴隨低維生素D水平，且與TRAb抗體滴度呈負(fù)相關(guān)，VDR信號(hào)通路可能參與Graves病發(fā)生及發(fā)展。

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〔2014-09-21修回〕

(編輯 袁左鳴)

中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A1FC088)

龍 雄(1978-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌疾病研究。

R4

A

1005-9202(2015)12-3254-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.030