炎癥因子對心肌間質(zhì)的影響及缺血后處理對其保護(hù)作用

宋 娟 李寶紅 盧彥珍 宋曉亮 王 佳 冀菁荃

(長治醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，山西 長治 046000)

炎癥因子對心肌間質(zhì)的影響及缺血后處理對其保護(hù)作用

宋 娟 李寶紅 盧彥珍 宋曉亮1王 佳2冀菁荃

(長治醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，山西 長治 046000)

目的 探討缺血后處理對大鼠心臟缺血-再灌注損傷中腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-6的影響，及其對心肌間質(zhì)和心臟功能的保護(hù)作用。方法 將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組，假手術(shù)對照組(SC組，n=8)、缺血-再灌注組(I/R組，n=8)和缺血后處理組(IPTC組，n=8)，結(jié)扎左冠狀動脈前降支造成缺血-再灌注損傷動物模型。通過心室內(nèi)插管、多導(dǎo)生理記錄儀監(jiān)測左室血流動力學(xué)變化，計(jì)算心肌組織中膠原含量變化，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測血漿中TNF-α和IL-6濃度改變，Western印跡檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2表達(dá)情況。結(jié)果 與SC組比較I/R組血漿TNF-α和IL-6濃度升高，同時心肌MMP-2蛋白明顯升高，而心肌膠原含量下降并伴隨左室心功能下降；IPTC組在血漿TNF-α和IL-6濃度明顯降低的同時，心肌MMP-2蛋白也明顯降低，而心肌膠原含量、左室舒縮功能明顯高于I/R組。結(jié)論 IPTC對缺血-再灌注損傷心肌有保護(hù)作用，機(jī)制可能與其減少炎性介質(zhì)TNF-α和IL-6的釋放以抑制MMP-2的表達(dá)，從而減輕心肌間質(zhì)的損傷有關(guān)。

缺血后處理；缺血-再灌注損傷；基質(zhì)金屬蛋白酶；白細(xì)胞介素-6；腫瘤壞死因子-α

缺血-再灌注(I/R)損傷不但損傷心肌細(xì)胞本身，同時嚴(yán)重?fù)p傷心肌間質(zhì)，并引起組織的無菌性炎癥反應(yīng)〔1〕。I/R損傷的病理生理機(jī)制極為復(fù)雜，目前認(rèn)為造成心肌I/R損傷的機(jī)制之一是炎癥因子的過度表達(dá)〔2〕。細(xì)胞因子尤其是腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6作為重要的炎性介質(zhì)在心肌I/R損傷的病理生理過程中起著重要的作用。因此防治心肌I/R損傷的有效辦法除盡快恢復(fù)心肌血流的再灌注外，如何拮抗炎癥因子的過度表達(dá)所造成的心肌損傷是目前研究的主要方向。有研究表明缺血后處理(IPTC)可通過抑制炎癥因子釋放發(fā)揮抗炎效應(yīng)和心肌保護(hù)作用〔3〕，但目前的研究基本集中在對心肌細(xì)胞的保護(hù)上，前期研究結(jié)果顯示，IPTC對心肌間質(zhì)有保護(hù)作用〔4〕，具體是通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2的活性和表達(dá)減少心肌間質(zhì)的降解發(fā)揮保護(hù)作用的。但I(xiàn)PTC是否可通過抑制炎性反應(yīng)影響心肌間質(zhì)產(chǎn)生心肌保護(hù)作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)探討IPTC減輕炎性反應(yīng)對心肌間質(zhì)的影響并觀察其與心肌間質(zhì)和心功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器 羊抗鼠MMP-2多克隆抗體、鼠抗小鼠β-action單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗IgG購自Santa Cruz公司， TNF-a、IL-6 ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.2 動物分組 健康成年雄性SD大鼠24只，體重(250±30)g，20%的烏拉坦(1 g/kg ip)麻醉，隨機(jī)分為三組：①假手術(shù)對照組(SC)；②缺血-再灌注組(I/R)；③缺血后處理組(IPTC)，每組8只。

1.3 模型制備 動物仰臥位固定于手術(shù)臺上。小動物人工呼吸機(jī)維持通氣，行胸骨正中切開，以左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，在左心耳根部下方2 mm處進(jìn)針結(jié)扎，以阻斷左冠狀動脈前降支，結(jié)扎20 min，然后恢復(fù)血液灌流40 min，假手術(shù)對照組除不結(jié)扎冠狀動脈外，其余同I/R組。缺血后處理動物模型按Zhao等〔5〕的方法復(fù)制，即缺血完畢，灌注30 s、缺血30 s，連續(xù)3個循環(huán)，然后再灌注40 min結(jié)束實(shí)驗(yàn)。復(fù)制模型的可靠性用連續(xù)監(jiān)視心電圖Ⅱ?qū)?lián)的變化來判斷，結(jié)扎后心電圖ST段抬高，解除結(jié)扎血管復(fù)通后ST段下降1/2以上為模型成功。

1.4 方法

1.4.1 左室功能測定 20%烏拉坦(1 g/kg ip)麻醉動物，固定，頸正中切口，暴露氣管及動脈，從右頸總動脈插入內(nèi)充37℃肝素生理鹽水PE-50軟質(zhì)塑料導(dǎo)管至左心室，接壓力傳感器，連接多導(dǎo)生理記錄儀，穩(wěn)定后計(jì)算機(jī)程序處理，輸出左心室壓力(LVP)信號，記錄左心室峰壓(LVSP)、左室內(nèi)壓上升及下降最大速率(±dp/dtmax)及Ⅱ?qū)碾妶D。

1.4.2 心肌中膠原含量測定 按文獻(xiàn)方法〔6〕，稱取凍存左室心肌約100 mg，脫水、脫脂、烘干、稱重，加入6 mol/L HCl 3 ml，105℃烘箱烤16 h。冷卻后調(diào)pH為6，加去離子水至10 ml，5 600 r/min離心，取上清2 ml作檢測。按要求配制標(biāo)準(zhǔn)管和空白管，用Beckman紫外分光光度計(jì)，波長550 nm，1 cm光徑，水調(diào)零，測各管A值，計(jì)算出羥脯氨酸含量。由于羥脯氨酸在膠原中占13.4%，心肌膠原含量(mg/g干重心肌)=羥脯氨酸含量×7.46。

1.4.3 血漿血清TNF-α、IL-6測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死動物前，經(jīng)股動脈抽血4 ml左右，離心后收集血清貯存于-70℃冰箱內(nèi)備用。嚴(yán)格按說明書應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測定血清TNF-α、IL-6的濃度。

1.4.4 Western印跡測定MMP-2蛋白 取液氮凍存心肌組織勻漿、離心，分離上清得MMP-2 提取液，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，以20 μg蛋白/泳道上樣于8%SDS 聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。室溫封閉3 h，加一抗，室溫孵育2 h，洗滌后，加二抗，室溫孵育2 h，洗滌后，顯色，待蛋白條帶顯色清晰時，拍攝照片，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS14.0軟件包進(jìn)行單因素方差分析及q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 IPTC對心肌I/R損傷時心臟動力學(xué)參數(shù)的影響 與SC組相比較，I/R組LVSP、±dp/dtmax均下降，兩者相比有顯著差異(P<0.01)；IPTC組三項(xiàng)指標(biāo)顯著改善(P<0.05)。見表1。

表1 IPTC對心肌I/R損傷大鼠心臟動力學(xué)參數(shù)的影響

與SC組比較：1)P<0.01；與I/R組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

2.2 大鼠心肌膠原含量和血漿TNF-α、IL-6含量的變化 與SC組相比較，I/R組血漿TNF-α、IL-6含量顯著升高，心肌膠原含量明顯減少(P<0.01)。與I/R組相比，IPTC組心肌膠原含量明顯升高，而血漿TNF-α、IL-6含量明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組心肌膠原含量和血漿TNF-α、IL-6含量的變化

與SC組比較：1)P<0.01；與I/R組比較：2)P<0.01

2.3 Western印跡測定MMP-2表達(dá)結(jié)果 如圖1所示，在SC組，MMP-2有一定程度的表達(dá)，缺血20 min再灌注40 min后，心肌組織中MMP-2表達(dá)較SC組明顯升高。而缺血后，灌注30 s、缺血30 s，連續(xù)3個循環(huán)，然后再灌注40 min的IPTC組MMP-2的表達(dá)較I/R組明顯降低。

圖1 Western印跡檢測心肌MMP-2的表達(dá)

3 討 論

心臟功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)不僅依賴于心肌細(xì)胞，很大程度上也取決于組成心臟的非心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能的正常與否。構(gòu)成心臟的非心肌細(xì)胞占心臟細(xì)胞總數(shù)的60%以上，所以心臟功能障礙不僅表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的壞死、凋亡、肥大等，也與細(xì)胞外間質(zhì)的狀態(tài)密切相關(guān)。近年來，IPTC對心肌I/R損傷的保護(hù)作用越來越多地受到大家的關(guān)注，IPTC即于完全再灌注之前給予組織多次短暫I/R的過程，以提高組織的適應(yīng)性。但是對于IPTC保護(hù)心臟功能的機(jī)制研究多集中于心肌細(xì)胞本身，對細(xì)胞外基質(zhì)的研究較少。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，缺血20 min再灌注40 min使心肌羥脯氨酸含量明顯減少，而IPTC組心肌羥脯氨酸含量明顯升高。由于羥脯氨酸在膠原中占13.4%，組織羥脯氨酸含量的測定是衡量機(jī)體膠原代謝的重要指標(biāo)，從羥脯氨酸含量可推知膠原的含量。即IPTC組動物心肌膠原含量明顯升高。與此同時I/R組LVSP、±dp/dtmax均明顯低于SC組，而IPTC組三項(xiàng)指標(biāo)明顯改善，提示缺血后處理可能通過增加心肌間質(zhì)膠原含量發(fā)揮保護(hù)心肌、提高心功能的作用。

MMPs是一組降解細(xì)胞外基質(zhì)的鈣離子和鋅離子依賴的金屬蛋白內(nèi)切酶家族，對細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)有較高親和力，是ECM降解的主要介質(zhì)〔7〕。有研究表明， MMPs特別是MMP-2在I/R損傷導(dǎo)致的急性心功能障礙發(fā)生時能迅速影響心肌功能〔8〕， 在充血性心力衰竭患者血清中MMP-2濃度顯著升高，且隨著心衰程度的加重而升高〔9〕。正常心肌中，MMPs表達(dá)水平相對較低，在一些病理情況下，如炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的刺激下可誘導(dǎo)其基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，導(dǎo)致其表達(dá)增加〔10〕。在眾多的炎性介質(zhì)中， IL-6和TNF-α是較為公認(rèn)的促進(jìn)炎癥發(fā)展的細(xì)胞因子。且有研究證實(shí)IL-6能夠調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)〔11〕。本實(shí)驗(yàn)中觀察到，缺血20 min再灌注40 min后，血漿TNF-α、IL-6含量明顯升高的同時Western印跡結(jié)果提示在I/R過程中，有炎癥因子的大量釋放，導(dǎo)致心肌MMPs激活，從而降解心肌膠原蛋白導(dǎo)致心功能下降。IPTC的心肌保護(hù)作用可能在于影響了炎癥因子的釋放，減弱了MMPs的活化，從而減少了心肌ECM的降解以發(fā)揮保護(hù)心臟的功能。

本研究表明，IPTC在發(fā)揮保護(hù)心肌保護(hù)作用時，不僅是在心肌細(xì)胞層面，而且對細(xì)胞外基質(zhì)的保護(hù)也是其重要的機(jī)制之一。通過減少炎癥因子的釋放抑制MMP-2的活性，從而減輕心肌間質(zhì)的損傷，是IPTC發(fā)揮心肌保護(hù)作用的重要途徑之一。

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〔2014-03-17修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢園)

山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2009011055)；山西省2013年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2013083)

盧彥珍(1957-)，女，教授，主要從事心血管保護(hù)機(jī)制的研究。

宋 娟(1980-)，女，碩士，講師，主要從事心血管保護(hù)及炎癥發(fā)病機(jī)制的研究。

R541

A

1005-9202(2015)12-3209-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.010

1 長治醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 2 長治醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室