蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠基底動(dòng)脈及血漿eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α的表達(dá)變化

吳 雷 郭 華 高子云 胡尚偉 沈曉黎 祝新根

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西 南昌 330006)

蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠基底動(dòng)脈及血漿eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α的表達(dá)變化

吳 雷 郭 華 高子云 胡尚偉 沈曉黎 祝新根

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西 南昌 330006)

目的 探討eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α在蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后不同時(shí)間點(diǎn)基底動(dòng)脈、血漿表達(dá)情況及其與腦血管痙攣的關(guān)系。方法 SD大鼠 42只，隨機(jī)分成:對(duì)照組(n=6)、假注血組(n=18)、SAH 組(n=18)。假注血組及SAH 組進(jìn)一步按時(shí)間隨機(jī)分為術(shù)后1、7、11 d 3個(gè)亞組，每組 6 只。采用枕大池二次注血法建立大鼠 SAH 模型。二次注血后在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液標(biāo)本,處死動(dòng)物,取腦組織及基底動(dòng)脈，測(cè)定基底動(dòng)脈橫截面積判斷有無(wú)腦血管痙攣;應(yīng)用RT-PCR分別觀察eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α在基底動(dòng)脈中的表達(dá)情況;應(yīng)用ELISA檢測(cè)eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α在血漿中的表達(dá)情況;原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)法檢測(cè)顳葉神經(jīng)元凋亡情況。結(jié)果 枕大池二次注血法成功制作 SAH 模型，基底動(dòng)脈發(fā)生了不同程度的血管痙攣。SAH組與對(duì)照組和假注血組相比大鼠基底動(dòng)脈橫截面積明顯減少。RT-PCR及ELISA觀察到ICAM-1、TN-C和PGF2α在SAH組高表達(dá)。而eNOS在SAH組中低表達(dá),第7天表達(dá)水平最低。eNOS濃度降低，皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡指數(shù)升高，ICAM-1、TN-C和PGF2α濃度升高，皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡指數(shù)升高。結(jié)論 SAH 后eNOS,ICAM-1,TN-C,PGF2α表達(dá)水平的變化與腦血管痙攣發(fā)展的時(shí)相性具有一定的一致性，eNOS,ICAM-1,TN-C,PGF2α可能參與SAH后腦血管痙攣的發(fā)生。

蛛網(wǎng)膜下腔出血;eNOS;ICAM-1;TN-C;PGF2α;RT-PCR;腦血管痙攣

腦血管痙攣(CVS)是蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是引起高致殘率、致死率的重要原因。SAH后CVS的病因和機(jī)制仍不清楚。有研究顯示CVS與血管內(nèi)及周圍一氧化氮(NO)含量下降有關(guān)，外源性NO難以應(yīng)用于CVS，有效的NO供體成為研究熱點(diǎn)。本研究觀察內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1、肌糖蛋白 C(TN-C)、前列腺素(PGF)F2α等因子在SAH后CVS發(fā)生時(shí)的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 雄性SD大鼠42只，體重290～350 g，由南昌大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，自由進(jìn)食，晝夜節(jié)律喂養(yǎng)。主要實(shí)驗(yàn)試劑Trizol-A、cDNA 合成試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒、ELISA試劑盒。對(duì)照組6只：不作任何處理；假注血組18只：48 h內(nèi)兩次枕大池穿刺注入生理鹽水0.3 ml；SAH組18只：48 h內(nèi)兩次枕大池穿刺注入自體動(dòng)脈血0.3 ml。假注血組及SAH組分為1 d、7 d、11 d 3個(gè)亞組，每組 6只。

1.2 模型制作 取SD大鼠麻醉后，后頸部及右側(cè)股動(dòng)脈區(qū)備皮、消毒后；大鼠仰臥位，鈍性分離右側(cè)股動(dòng)脈抽取股動(dòng)脈血0.3 ml留以備用，改俯臥位后鈍性分離枕部肌肉暴露枕骨，用1 ml針管穿刺入枕大池，在2 min內(nèi)將0.3 ml動(dòng)脈血注入枕大池，縫合傷口。48 h后同法取左側(cè)股動(dòng)脈血0.3 ml注入枕大池，制成大鼠SAH動(dòng)物模型。假注血組2次注入枕大池為生理鹽水。

1.3 標(biāo)本采集及測(cè)定 不同時(shí)間點(diǎn)抽取動(dòng)物血液標(biāo)本放入含100 g/L依地酸二鈉60 μl試管中混勻,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清e(cuò)NOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。分別于建模后第1、7、11天處死大鼠，剝離其腦組織對(duì)顳葉皮質(zhì)切片進(jìn)行染色，按試劑盒操作，觀察顳葉皮質(zhì)切片中神經(jīng)元凋亡情況：所有受試動(dòng)物進(jìn)行顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡監(jiān)測(cè)，凋亡指數(shù)為顳葉皮質(zhì)切片1 000個(gè)神經(jīng)元中的TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞。剝離其基底動(dòng)脈組織部分行石蠟包埋后行HE染色檢查，光鏡下觀察并測(cè)量基底動(dòng)脈血管內(nèi)徑，橫截面積(面積采用顯微鏡計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量基底動(dòng)脈橫截面積)，血管舒張度(D/T值：指動(dòng)脈血管內(nèi)徑與管壁厚度之間的比值)。另一部分凍存于-80℃冰箱中，統(tǒng)一行eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α檢測(cè)，將eNOS、ICAM-1、TN-C、PGF2α和管家基因(β-actin)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR。反應(yīng)條件:95℃變性2 min，40個(gè)循環(huán)94℃變性20 s,58℃(eNOS)、61℃(ICAM-1)、56℃(TN-C)、55℃(PGF2α)退火20 s,72℃延伸30 s,74℃讀板。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)脂糖凝膠電泳后，用內(nèi)參照β-actin光密度值標(biāo)化eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α mRNA的吸光度值，得到eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α mRNA表達(dá)的相對(duì)含量。eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF-2α及β-actin序列如下:eNOS正義引物:5'-CCGGCTGCCACCTGATCCTA-3',反義引物:5'-AACATGTGTCCTTGCTCGAGG CA-3'。ICAM-1正義引物:5'- AGACACAAGCAAGAGAAGAA-3',反義引物:5'- GAGAAGCCCAAACCCGTATG-3'。TN-C正義引物:5'-TCCTGCTGACTGTCACAATC-3',反義引物:5'-TGCTCACATACACATTTGCC-3'。PGF2α正義引物:5'-ACTGGCATGCTCCCCAGCGGA-3',反義引物:5'-GTGCCGTTAGTCTCTGAGGCG-3'。β-actin正義引物:5'-TACAACCTCCTTGCAGCTCC-3',反義引物:5'-GGATC TTCATGAGGTAGTCATTC-3'。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。

2 結(jié) 果

2.1 基底動(dòng)脈標(biāo)本觀察 對(duì)照組和假注血組腦干腹側(cè)基底動(dòng)脈周圍無(wú)血凝塊，基底動(dòng)脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整血管管腔較大，內(nèi)膜平滑肌呈扁平狀，無(wú)卷曲；SAH組見(jiàn)基底動(dòng)脈周圍可見(jiàn)明顯的凝血塊，但隨著時(shí)間的推移，周圍凝血塊大小和范圍逐漸減少，基底動(dòng)脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)排列紊亂，內(nèi)徑減小，內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂，卷曲皺折，厚薄不均，細(xì)胞外間質(zhì)增多，7 d達(dá)到最明顯改變，11 d上述改變明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠基底動(dòng)脈組織學(xué)形態(tài)(HE，×100)

2.2 各組基底動(dòng)脈橫截面積及管壁比較 基底動(dòng)脈行 HE 染色后，對(duì)照組和假注血組基底動(dòng)脈無(wú)明顯痙攣：SAH組第1、7和11天基底動(dòng)脈橫截面積、血管內(nèi)徑和D/T值均明顯低于對(duì)照組和假注血組(P<0.05)。對(duì)照組和假注血組基底動(dòng)脈橫截面積、血管內(nèi)徑和D/T值差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠基底動(dòng)脈橫截面積、血管內(nèi)徑和D/T值

與對(duì)照組比較：1)P<0.05;與同時(shí)段假注血組比較：2)P<0.05

2.3 顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡指數(shù)比較 對(duì)照組和假注血組第1、7和11天大鼠顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)緊湊，數(shù)目正常，排列整齊；對(duì)照組顳葉神經(jīng)元凋亡指數(shù)為(1.7±1.0)%，假注血組1、7、11 d顳葉神經(jīng)元凋亡指數(shù)為(1.8±1.0)%、(2.0±1.1)%、(2.1±0.9)%。SAH組大鼠顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)松散，數(shù)目減少，排列紊亂，顳葉神經(jīng)元凋亡指數(shù)SAH組1 d明顯升高〔(17.6±2.4)%〕，7 d顳葉神經(jīng)元凋亡指數(shù)升高最明顯〔(32.0±4.4)%〕，SAH組11 d后指數(shù)逐漸降低〔(28.7±4.0)%〕(P<0.05)。

2.4 血清e(cuò)NOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α濃度 SAH組各eNOS表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組及同時(shí)間點(diǎn)假注血組，以7 d降低最明顯(P<0.05)。SAH組ICAM-1、TN-C表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組及同時(shí)間點(diǎn)假注血組(P<0.05)。SAH組PGF2α表達(dá)在1 d及7 d組水平明顯高于對(duì)照組及同時(shí)間點(diǎn)假注血組(P<0.05)，且隨時(shí)間逐漸降低，7 d和11 d表達(dá)水平明顯低于1 d。見(jiàn)表2。

2.5 各組大鼠基底動(dòng)脈eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α mRNA表達(dá)情況 SAH組大鼠基底動(dòng)脈eNOS表達(dá)明顯低于對(duì)照組和同期假注血組，ICAM-1、TN-C、PGF2α表達(dá)明顯高于對(duì)照組和同期假注血組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.6 eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α在SAH大鼠血清中表達(dá)與神經(jīng)元凋亡指數(shù)的相關(guān)性分析 大鼠SAH組7 d eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α各血清值變化最為明顯，通過(guò)顳葉神經(jīng)元凋亡指數(shù)與eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α表達(dá)相關(guān)分析結(jié)果顯示，eNOS表達(dá)與顳葉神經(jīng)元凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.586,P=0.01)，ICAM-1、TN-C與PGF2α表達(dá)與顳葉神經(jīng)元凋亡指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.652,P=0.02;r=0.696,P=0.03;r=0.784,P=0.02,P<0.05)。

表2 各組大鼠血清e(cuò)NOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α表達(dá)水平

與對(duì)照組比較：1)P<0.05;與同期假注血組比較：2)P<0.05;與SAH組1 d比較：3)P<0.05，下表同

表3 各組大鼠基底動(dòng)脈eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α mRNA表達(dá)水平

3 討 論

CVS是SAH的常見(jiàn)并發(fā)癥，也是最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,其發(fā)病率為30%～90%，輕者可引起腦供血不足，嚴(yán)重可發(fā)生遲發(fā)性缺血障礙(DID)，導(dǎo)致腦梗死甚至死亡，是SAH后致殘和死亡的主要原因〔1,2〕。NO是由L-精氨酸與分子氧在NOS 的催化下生成的，作為一種可以通過(guò)生物膜擴(kuò)散的氣體自由基，其可調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫功能，且能快速?gòu)浬⑦M(jìn)入平滑肌細(xì)胞從而引起血管松弛,是維持腦血管張力的重要因子之一。eNOS作為NOS的異構(gòu)體，主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，可持續(xù)低量地合成、釋放NO，使血管處于舒張狀態(tài)〔3,4〕，是預(yù)測(cè)SAH后CVS的有用指標(biāo)之一〔5〕。張瓏等〔6〕通過(guò)血管內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的方法，來(lái)了解eNOS防治SAH后遲發(fā)性CVS的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在對(duì)以內(nèi)皮功能失常和內(nèi)皮依賴性舒血管作用降低為特點(diǎn)的OVS中，eNOS可作為一種特異性治療，可能對(duì)于SAH后遲發(fā)性CVS具有一定的療效。ICAM-1高表達(dá)可促進(jìn)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附,使氧自由基、蛋白溶酶、白三烯、血小板活化因子等與內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)，直接損傷內(nèi)皮或?qū)е聝?nèi)皮功能障礙，從而引起炎癥反應(yīng)〔7～10〕。TN-C是一種大分子量的細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白，在胚胎發(fā)育、炎性反應(yīng)以及傷口愈合的過(guò)程中可一過(guò)性的表達(dá)，其特征與纖維連接蛋白和層黏連蛋白有許多相似之處〔11〕。PGF2α〔12,13〕是通過(guò)參與其他自體活性物質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)和激素的調(diào)解而發(fā)揮作用的。在生理狀態(tài)下，主要作用于血管和平滑肌，參與血小板凝集、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)和細(xì)胞生長(zhǎng)等。PGF2α在細(xì)胞水平的具體作用機(jī)制因細(xì)胞種類不同，發(fā)揮的作用也不同。

本研究通過(guò)以二次注血法將自體動(dòng)脈血直接注入蛛網(wǎng)膜下腔造模，造模后可見(jiàn)基底動(dòng)脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)排列紊亂，卷曲皺折，厚薄不均，內(nèi)膜下及外膜可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管管徑變細(xì)，周圍可見(jiàn)明顯的凝血塊，但隨著時(shí)間的推移，周圍凝血塊大小和范圍逐漸減少，提示SAH后CVS造模成功〔14,15〕。各組基底動(dòng)脈橫截面積及管壁比較發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和假注血組基底動(dòng)脈橫截面積、血管內(nèi)徑和D/T值差異不明顯，而SAH組明顯低于對(duì)照組和假注血組。SAH組大鼠顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)松散，數(shù)目減少，排列紊亂，凋亡數(shù)量明顯高于對(duì)照組及假注血組,進(jìn)一步證實(shí)了SAH后CVS造模成功。

本實(shí)驗(yàn)表明eNOS表達(dá)下調(diào)，可能與SAH后血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能存在一定的關(guān)系，參與了SAH后CVS的發(fā)展，SAH后ICAM-1、TN-C、PGF2α影響血管內(nèi)皮功能的穩(wěn)定性，由此可引發(fā)的一系列病理反應(yīng)，導(dǎo)致SAH后CVS的形成。eNOS表達(dá)與顳葉神經(jīng)元凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，ICAM-1、TN-C與PGF表達(dá)與顳葉神經(jīng)元凋亡指數(shù)呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，eNOS表達(dá)可能對(duì)SAH后的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用；而ICAM-1、TN-C與PGF2α的高表達(dá)可誘發(fā)腦細(xì)胞的凋亡,人為改變SAH后eNOS、 ICAM-1、TN-C與PGF2α的表達(dá)可能阻斷SAH后的病理過(guò)程。

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〔2013-12-07修回〕

(編輯 趙慧玲/曹夢(mèng)園)

江西省科技廳科技支撐項(xiàng)目(20111BBG70022-4)

郭 華(1972-)，男，主任醫(yī)師，主要從事干細(xì)胞及腦血管病的研究。

吳 雷(1980-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事干細(xì)胞及腦血管病的研究。

R74

A

1005-9202(2015)12-3206-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.009