吉非替尼敏感性不同的非小細(xì)胞肺癌中miRNA-7表達(dá)的差異及臨床意義

劉思文， 曹海霞， 吳建中， 馬 蓉， 井昶雯， 王 卓， 馮繼鋒

論 著

吉非替尼敏感性不同的非小細(xì)胞肺癌中miRNA-7表達(dá)的差異及臨床意義

劉思文， 曹海霞， 吳建中， 馬 蓉， 井昶雯， 王 卓， 馮繼鋒

目的 檢測(cè)吉非替尼敏感性不同的非小細(xì)胞肺癌中miR-7的表達(dá)差異，并探討其臨床意義。方法 采用吉非替尼(Gefitinib)藥物大劑量沖擊法誘導(dǎo)H827，建立耐吉非替尼肺癌細(xì)胞亞系H827-7/GR，有限稀釋法將H827-7/GR細(xì)胞單克隆化，CCK-8法檢測(cè)耐藥前后細(xì)胞株及各單克隆細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性；RT-PCR方法檢測(cè)H827、H827-7/GR和耐藥單克隆細(xì)胞株以及其他對(duì)吉非替尼敏感性不同的肺癌細(xì)胞株A549、H358、H1299、H1650和H1975中miR-7的表達(dá)差異。結(jié)果 H827/GR耐藥指數(shù)大于100；獲得的6株耐藥單克隆細(xì)胞株對(duì)吉非替尼的半生長(zhǎng)抑制濃度(the half growth inhibition concentration, IC50)值不同；和吉非替尼敏感株H827相比，誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株H827/GR、耐藥單克隆細(xì)胞株和吉非替尼耐藥株A549、H358、H1299、H1650和H1975中miR-7的相對(duì)表達(dá)水平均降低(P<0.05)。結(jié)論 在非小細(xì)胞肺癌中，耐藥細(xì)胞中miR-7的相對(duì)表達(dá)水平均較敏感細(xì)胞系降低，提示miR-7的低表達(dá)可能與非小細(xì)胞肺癌耐藥性相關(guān)，其可能是潛在的肺癌藥物敏感性預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物。

吉非替尼； 敏感性； microRNA-7； 非小細(xì)胞肺癌

肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤之一，在女性癌癥死因中肺癌占26%，男性癌癥死因中占28%[1]。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌的80%以上，肺腺癌又是NSCLC的主要病理類型。近年來(lái)以表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)為代表的靶向藥物已作為晚期NSCLC患者(存在EGFR敏感突變)的一線治療藥物，但大部分治療有效的肺癌患者1年左右會(huì)出現(xiàn)EGFR-TKI繼發(fā)耐藥。

微小RNAs(microRNAs, miRNAs)是一類長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸的小的單鏈的非編碼調(diào)控RNA，通過(guò)識(shí)別特定的靶mRNA，導(dǎo)致mRNA的降解和(或)翻譯抑制，從而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用，其不僅參與細(xì)胞增殖、分化、代謝及凋亡等一系列重要生物學(xué)進(jìn)程[2]，而且miRNA還可以通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵的癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，甚至對(duì)腫瘤的化療耐藥也具有調(diào)控作用。本研究用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)NSCLC細(xì)胞株H827、H827/GR和耐藥單克隆細(xì)胞株以及其他對(duì)EGFR-TKI敏感性不同的肺癌細(xì)胞株A549、H358、H1299、H1650和H1975中miR-7的表達(dá)差異。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

人肺腺癌細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；胰蛋白酶購(gòu)自凱基科技生物發(fā)展有限公司；吉非替尼(粉劑)購(gòu)自阿斯利康公司；CCK-8購(gòu)自日本同仁；高速冷凍離心機(jī)； NanoDropND-1000紫外分光度計(jì)(NanoDrop)；7300Real-time PCR System(Applied Biosystems公司)、9700 Thermocycler反應(yīng)儀；Recover All Total Nucleic Acid Isolation Kit(Applied Biosystems公司)；has-miRNA-7-5p引物、內(nèi)參RNU6B引物(RiboBio公司)；Real-time逆轉(zhuǎn)錄試劑盒( RR037A)(TakaRa公司)；SYBR?Select Master Mix試劑盒(Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 耐藥細(xì)胞株的建立 H827細(xì)胞株置于含10%胎牛血清(Gibco)、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用大劑量間斷沖擊法[3](吉非替尼濃度為0.08～0.2 uM)誘導(dǎo)建立人NSCLC吉非替尼耐藥細(xì)胞株，5個(gè)月后，細(xì)胞可在含10-7uM吉非替尼的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)增殖，將該細(xì)胞亞系命名為H827-7/GR。實(shí)驗(yàn)前2周撤去藥物，以正常的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，用于實(shí)驗(yàn)以及后續(xù)的檢測(cè)。

1.2.2 單克隆細(xì)胞株的建立與鑒定 有限稀釋法篩選出耐藥細(xì)胞HCC827-7/GR單克隆細(xì)胞株，穩(wěn)定傳2代后收集單克隆細(xì)胞株的DNA，命名為H827-7-n(n為細(xì)胞先后克隆出的序號(hào))，基因測(cè)序法檢測(cè)各單克隆細(xì)胞株有無(wú)繼發(fā)基因突變，擴(kuò)增細(xì)胞并凍存各單克隆細(xì)胞株。

1.2.3 CCK8法檢測(cè)藥物對(duì)耐藥細(xì)胞單克隆細(xì)胞株增殖抑制率 取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞按5 000個(gè)/孔接種于96孔板：?jiǎn)嗡幖翘婺峤M終濃度分別是20 μM、10 μM、5 μM、2.5 μM、1.25 μM，一組空白對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)48h后，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書操作，計(jì)算半生長(zhǎng)抑制濃度值(the half growth inhibition concentration, IC50)及耐藥指數(shù)(RI=耐藥細(xì)胞株的IC50/敏感細(xì)胞株的IC50)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Real time-PCR檢測(cè)各肺癌細(xì)胞株miR-7表達(dá)變化 取各細(xì)胞株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化，制備單細(xì)胞懸液，接種于6孔板中(2 ml/孔)，貼壁后更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后收集貼壁細(xì)胞，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；RNU6B為內(nèi)參基因，以cDNA作為模板進(jìn)行SYBR-Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),反應(yīng)體系：SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 10 μl，上游引物(5 μM)0.8 μl，下游引物(5 μM)0.8 μl， cDNA 2 μl，加DEPC水至20 μl。將反應(yīng)管置7300 Real-time PCR反應(yīng)儀(Applied Biosystem)中，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min后，按下述條件擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采用 2-△△Ct法進(jìn)行分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 耐藥細(xì)胞株的誘導(dǎo)與鑒定，單克隆細(xì)胞株的建立與鑒定

大劑量間斷沖擊法誘導(dǎo)建立耐藥細(xì)胞株H827-7GR，有限稀釋法篩選出6株H827-7GR耐藥單克隆細(xì)胞株，根據(jù)挑出的時(shí)間先后分別命名為H827-7-1、H827-7-2、H827-7-3、H827-7-4、H827-7-6、H827-7-7，且均無(wú)繼發(fā)型基因突變。

2.2 CCK8法檢測(cè)藥物耐藥細(xì)胞單克隆細(xì)胞株增殖抑制率

H827對(duì)吉非替尼48 h IC50值為(0.308±0.03) μM，肺癌A549、H358、H1299、H1650和H1975均為吉非替尼耐藥株。不同濃度(1.25 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM、20 μM)的吉非替尼分別處理耐藥細(xì)胞株H827-7及各單克隆細(xì)胞株48h后，細(xì)胞存活率均降低，其中H827-7/GR耐藥指數(shù)(RI)大于100，各單克隆細(xì)胞株對(duì)吉非替尼的IC50值不同，除H827-7-3為(6.396 ± 0.33)μM外，其余克隆株均大于10 μM(見表1、圖1)。

2.3 吉非替尼敏感性不同的細(xì)胞間miR-7的表達(dá)差異

經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)，設(shè)定miR-7在吉非替尼敏感細(xì)胞株H827中的表達(dá)水平為1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)吉非替尼原發(fā)耐藥的肺癌細(xì)胞(A549、H358、H1299、H1650和H1975)之間，miR-7的表達(dá)有差異，均較H827細(xì)胞降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A549、H358、H1650vsH827，P<0.05； H1299、H1975vsH827，P<0.01)(圖2)；吉非替尼繼發(fā)耐藥細(xì)胞及其單克隆細(xì)胞間miR-7的表達(dá)較吉非替尼敏感細(xì)胞H827降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(vsH827，P<0.05)(圖3)。

表1 肺腺癌耐藥細(xì)胞株H827-7/GR及其單克隆細(xì)胞株對(duì)吉非替尼的IC50值

圖1 各單克隆細(xì)胞株對(duì)吉非替尼的敏感性

圖2 MiR-7在吉非替尼原發(fā)耐藥與繼發(fā)耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)量，vsH827,*P<0.05，**P<0.01。

圖3 MiR-7在吉非替尼繼發(fā)耐藥及其單克隆細(xì)胞中的表達(dá)量，vsH827，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，每年因肺癌死亡人數(shù)達(dá)560 000，其中一半來(lái)自中國(guó)[6]。因起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已達(dá)晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳手術(shù)治療機(jī)會(huì)。近年來(lái)，隨著治療方案的不斷優(yōu)化，尤以靶向藥物的應(yīng)用使得肺癌的治療向前邁進(jìn)了一大步。然而在用藥過(guò)程中出現(xiàn)吉非替尼繼發(fā)性耐藥使得肺癌治療再次陷入困境。在臨床腫瘤治療中，絕大多數(shù)是屬于獲得性耐藥，即起初對(duì)治療敏感，但用藥治療幾周期后，腫瘤開始對(duì)藥物耐受并出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。采用大劑量藥物間斷沖擊法誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥細(xì)胞株，與臨床腫瘤患者出現(xiàn)耐藥的機(jī)制相似，故本研究采用此方法，歷時(shí)5個(gè)月，成功誘導(dǎo)建立人非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞系H827-7/GR，通過(guò)CCK-8法證實(shí)該耐藥細(xì)胞系的耐藥指數(shù)大于100。

miRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中。它的生物合成需要復(fù)雜的蛋白系統(tǒng)，包括Argonaute 家族成員、RNA 聚合酶Ⅱ以及屬于RNA聚合酶Ⅲ家族的Drosha和Dicer。在細(xì)胞核內(nèi)，長(zhǎng)鏈pri-miRNA在Drosha/DGCR8作用下剪去7-甲基鳥苷酸帽及多聚(A)尾，形成約70個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的發(fā)夾結(jié)構(gòu)miRNA前體(pre-miRNA)[7]，后者轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，Dicer/TRBP特異性PZA域識(shí)別Drosha剪切產(chǎn)物末端，在此將pre-miRNA剪切為約22nt的雙鏈miRNA(miRNA-miRNA)，其中一條miRNA結(jié)合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，然后通過(guò)堿基互補(bǔ)作用結(jié)合到靶基因mRNA上，從而調(diào)控基因表達(dá)[8]。miRNA具有組織特異性，與肺組織相關(guān)的包括let-7a、miR-21、miR-31、miR-34、miR-143等40余種[9]，它們?cè)诜伟┙M織表達(dá)的降低或升高，以癌基因或抑癌基因樣作用，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄翻譯，促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。文獻(xiàn)[10]報(bào)道，miR-7的靶基因多為原癌基因，包括IRS1、IRS2、EGFR和PAK1(p21/CDC42/RAC1-活化激酶1)，在多個(gè)腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用。2008年有研究[11]報(bào)道m(xù)iR-7的基因序列與EGFR基因3’-UTR區(qū)存在至少3個(gè)區(qū)域的不完全互補(bǔ)，這種廣泛性的序列互補(bǔ)將成為膠質(zhì)瘤等特定基因靶向治療的候選之一。次年有研究[12]發(fā)現(xiàn)在肺癌、乳腺癌等細(xì)胞中miR-7均有下調(diào)EGFR mRNA及蛋白表達(dá)的作用，同時(shí)miR-7減弱蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)的活性，后兩者是EGFR信號(hào)的關(guān)鍵效應(yīng)因子。進(jìn)一步證實(shí)在一些與EGFR有關(guān)的腫瘤中上調(diào)miR-7的表達(dá)可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。那么我們推測(cè)在吉非替尼繼發(fā)耐藥的肺癌細(xì)胞中miR-7的表達(dá)也會(huì)相應(yīng)降低。

本研究選取6種EGFR突變狀態(tài)不一的對(duì)吉非替尼敏感性不同的人NSCLC細(xì)胞株：A549、H358、H1299(EGFR野生型，吉非替尼耐藥)、H827(EGFR E746-A750缺失突變，吉非替尼敏感)、H1650(EGFR E746-A750缺失突變，吉非替尼耐藥)、H1975(EGFR L858R、T790M突變，吉非替尼耐藥)，同時(shí)對(duì)誘導(dǎo)建立的繼發(fā)耐藥細(xì)胞株H827-7/GR單克隆化，采用RT-PCR方法對(duì)上述肺癌細(xì)胞中miR-7表達(dá)量的差異性進(jìn)行分析，結(jié)果提示各原發(fā)吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞株(A549、H358、H1299、H1650、H1975)miR-7的表達(dá)水平較吉非替尼敏感細(xì)胞株(H827)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，吉非替尼敏感細(xì)胞株H827誘導(dǎo)耐藥后miR-7的表達(dá)水平較耐藥前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示，對(duì)于人NSCLC，無(wú)論是吉非替尼原發(fā)耐藥還是繼發(fā)耐藥，肺癌細(xì)胞中miR-7的表達(dá)較敏感細(xì)胞均降低，從另一面間接證實(shí)了若在與EGFR有關(guān)的肺癌中上調(diào)miR-7的表達(dá)可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

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Difference of miRNA-7 expression in the non-small cell lung cancer with different sensitivity to gefitinib and their clinical significance

LIUSiwen,CAOHaixia,WUJianzhong,MARong,JINGChangwen,WANGZuo,FENGJifeng.

(DepartmentofMedicalOncology,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China)

FENGJifeng,E-mail：fjif@vip.sina.com

Objective To detect the difference of miRNA-7 expression in the non-small cell lung cancer with different sensitivity to gefitinib and explore their clinical significance.Methods The gefitinib resistant lung cancer cell line H827-7/GR was established from H827 by a method of repeated treatment with high dose of gefitinib for a short period. The H827-7/GR cells were monocloned through the method of limiting dilution. CCK-8 was used to test the sensitivity of H827, H827-7/GR and the monoclonal cells to gefitinib. RT-PCR was used to detect the difference of miRNA-7 expression in H827, H827-7/GR and the monoclonal cells, and other lung cancer cell lines with different sensitivity to gefitinib, such as A549, H358, H1299, H1650 and H1975.Results The drug resistance index of H827/GR was larger than 100. The half growth inhibition concentrations (IC50) of the six resistant monoclonal cell lines were different. The miRNA-7 expression of H827/GR, resistant monoclonal cell lines, and gefitinib resistant cell lines such as A549, H358, H1299, H1650 and H1975 were all lower than that of the gefitinib sensitive cell line H827 (P<0.05). Conclusions The miRNA-7 expression of gefitinib resistant cell lines is lower than that of gefitinib sensitive cell lines in the non small cell lung cancer. This suggests that the drug resistance of the non small cell lung cancer may be associated with the low expression of miRNA-7 and it may be a potential molecular marker of the sensitivity of lung cancer to the drugs.

gefitinib; sensitivity; miRNA-7; non-small cell lung cancer

國(guó)家自然科學(xué)基金(81372396)，江蘇省自然科學(xué)基金(BK20141016)

210009 江蘇 南京，南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇省腫瘤醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科

劉思文，女，碩士研究生，研究方向：腫瘤內(nèi)科治療及分子靶向治療，E-mail：siwenliu1989@126.com

馮繼鋒，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤內(nèi)科治療及分子靶向治療， E-mail：fjif@vip.sina.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2015.02.002

1674-4136(2015)02-00074-05

2015-01-13][本文編輯：李筱蕾]