燒傷患者亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌耐藥情況和耐藥基因研究

眭 陽，王 瀅，于 文，王瑩超，尹 娟

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.感染管理科，江蘇蘇州 215008)

燒傷是一種常見的外科創(chuàng)傷，其能破壞皮膚的屏障功能并導(dǎo)致患者體內(nèi)水分、電解質(zhì)、蛋白質(zhì)的丟失，且燒傷創(chuàng)面為開放創(chuàng)面,容易發(fā)生污染和細(xì)菌定植，導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生，甚至導(dǎo)致死亡[1-2]。研究表明，細(xì)菌感染是燒傷患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[3-4]。但隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，各種耐藥菌株也在不斷增加，尤其是亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌的出現(xiàn)，給臨床上治療帶來了較大的難度，而研究探討細(xì)菌耐藥的機(jī)制并尋找有效的治療方法對(duì)于提高患者的預(yù)后具有重要的意義。為了進(jìn)一步探討分析燒傷患者亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌耐藥情況和耐藥基因，本研究對(duì)本院燒傷科收集的31株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)，旨在為臨床上提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年2月至2017年2月在本院治療的燒傷患者31例，收集其臨床標(biāo)本中分離出的亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌31株(剔除同一患者同一部位標(biāo)本中獲得的重復(fù)菌株)，其中男22例，女9例；年齡2～70歲，中位年齡46歲；標(biāo)本來源：創(chuàng)面13例，導(dǎo)管1例，呼吸道15例，血液1例，中段尿1例。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行藥敏檢測(cè)，哌拉西林、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和氨曲南抗菌藥物紙片均為Oxoid公司產(chǎn)品，具體檢測(cè)步驟按照說明書進(jìn)行操作。

1.2.2PCR檢測(cè) 將菌株置于LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，取約2 g培養(yǎng)物利用DNA提取試劑盒提取DNA，在聚合酶的作用下進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：94 ℃、5 min后以94 ℃、30 s進(jìn)行變性，55 ℃、60 s進(jìn)行退火，72 ℃、1 min后延伸2 min，此為1個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，取PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相，以雙蒸水為陰性對(duì)照，出現(xiàn)目的基因色帶即為陽性。

1.2.3氰氯苯腙對(duì)主動(dòng)外排系統(tǒng)的檢測(cè) 采用倍比稀釋法制成含不同濃度亞胺培南的M-H瓊脂平皿，將待測(cè)菌落分別接種于含氰氯苯腙(濃度為5 mg/L)的瓊脂平皿和普通瓊脂平皿上，再將平皿均置于35 ℃孵箱中培養(yǎng)16～18 h。各取兩種平皿上生長(zhǎng)的銅綠假單胞菌落制成0.5麥?zhǔn)蠞舛染?，均勻涂布在已配制好的含不同濃度亞胺培南的平皿表面，最后再?5 ℃恒溫箱培養(yǎng)20 h，觀察氰氯苯腙對(duì)亞胺培南的最小抑菌濃度(MIC)的逆轉(zhuǎn)作用。若發(fā)現(xiàn)從含氰氯苯腙瓊脂平皿挑取的菌落的亞胺培南MIC值降至普通瓊脂上菌落MIC值的1/4以下時(shí)，則表示此菌株存在主動(dòng)外排系統(tǒng)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié) 果

2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果 亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌對(duì)慶大霉素、頭孢哌酮、頭孢吡肟、氨曲南耐藥率較高，耐藥率均大于60.00%，見表1。

表1 31株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌藥敏結(jié)果[n(%)]

2.2耐藥基因檢測(cè) 31株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌中，IMP基因陽性6株，陽性率為19.35%；VIM基因陽性3株，陽性率為9.68%；OprD2基因缺失5株，陽性率為16.13%；OXA-10和GES耐藥基因未檢測(cè)到。

2.3主動(dòng)外排系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果 在31株細(xì)菌中，氰氯苯腙的存在使亞胺培南的MIC值下降1/4的有5株，占16.13%，其余26株無變化，提示有16.13%的菌株存在主動(dòng)外排的耐藥機(jī)制。

3 討 論

燒傷一般是指由熱力(包括熱液、蒸汽、高溫氣體、火焰、電能、化學(xué)物質(zhì)、放射線，灼熱金屬液體或固體等)所引起的組織損害，主要是指皮膚或黏膜的損害，嚴(yán)重者也可傷及其他組織[5-7]。深度燒傷能破壞皮膚的屏障功能，導(dǎo)致體內(nèi)水分、電解質(zhì)、蛋白質(zhì)的丟失，而微生物也可經(jīng)燒傷創(chuàng)面侵入引起局部或全身感染，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[8]。細(xì)菌感染是燒傷患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，患者的皮膚屏障被破壞，且燒傷創(chuàng)面為開放創(chuàng)面，極易發(fā)生污染和細(xì)菌定植[9-10]。雖然新型抗菌藥物不斷被研發(fā)并使用于臨床，但細(xì)菌也在升級(jí)自己的耐藥系統(tǒng)與之抗衡，因此及時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性及其變化趨勢(shì)，對(duì)于抗菌藥物的合理應(yīng)用有著積極意義。

銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌，也是燒傷科感染常見的致病菌，其對(duì)多種抗菌藥物均具有天然耐藥和多重耐藥，給臨床上治療帶來了較大的難度[11-12]。碳青霉烯類抗菌藥物是一類新型的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，具有抗菌活性強(qiáng)、對(duì)酶穩(wěn)定性高、不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)，常被用于控制燒傷科重癥感染，尤其對(duì)多重耐藥革蘭陰性桿菌和銅綠假單胞菌感染的治療效果較好[13]。但臨床醫(yī)生對(duì)該類藥物的使用日益頻繁，銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率在逐年上升，且其耐藥性強(qiáng)、耐藥譜廣，極易在抗菌藥物的選擇壓力下產(chǎn)生獲得性耐藥，且多重耐藥現(xiàn)象比較普遍[14]，這與本研究的結(jié)果基本一致。本研究選取本院燒傷科收集的31株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌對(duì)慶大霉素、頭孢哌酮、頭孢吡肟、氨曲南耐藥率較高，耐藥率均大于60.00%，提示亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌對(duì)大部分抗菌藥物耐藥率較高，這無疑給臨床上治療帶來了極大的難度，而研究探討亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌耐藥的機(jī)制對(duì)于提高燒傷患者的治療效果具有重要的意義。

目前針對(duì)銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制的研究較多，發(fā)現(xiàn)其耐藥機(jī)制較為復(fù)雜多樣，可能與外膜孔道蛋白OprD2的缺失、主動(dòng)外排系統(tǒng)、金屬酶產(chǎn)生、青霉素結(jié)合蛋白改變和生物膜形成等有關(guān)，且可能單獨(dú)存在或是協(xié)同存在[15]。OprD2蛋白是一種微孔蛋白，也是亞胺培南進(jìn)入菌體內(nèi)的特異性通道，編碼基因OprD2的突變可能會(huì)使OprD2蛋白的表達(dá)減少甚至缺失，導(dǎo)致菌體外膜蛋白對(duì)亞胺培南的通透性降低，最終引起銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥。金屬β-內(nèi)酰胺酶能夠水解包括碳青酶烯類抗菌藥物在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，且耐藥基因能夠在菌種間轉(zhuǎn)移和傳播，從而給臨床的抗感染治療帶來了嚴(yán)重的威脅。本研究通過PCR檢測(cè)銅綠假單胞菌亞胺培南耐藥相關(guān)基因及外膜蛋白基因OprD2發(fā)現(xiàn)，31株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌中IMP基因陽性6株，VIM基因陽性3株，OprD2基因缺失5株，而OXA-10和GES耐藥基因未檢測(cè)到，提示其耐藥機(jī)制可能與細(xì)菌膜微孔蛋白基因OprD2缺失和細(xì)菌產(chǎn)IMP型金屬-內(nèi)酰胺酶等有關(guān)。

主動(dòng)外排主要是指細(xì)菌通過外排泵把進(jìn)入菌體內(nèi)的抗菌藥物排出體外，這也是銅綠假單胞菌多重耐藥的一個(gè)重要原因。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在31株細(xì)菌中，氰氯苯腙的存在使亞胺培南的MIC值下降1/4的有5株，提示有部分亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌菌株存在主動(dòng)外排的耐藥機(jī)制。但本研究限于研究樣本的不足，對(duì)于燒傷患者亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制的分析仍需作進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌對(duì)大部分抗菌藥物耐藥率較高，其耐藥機(jī)制與細(xì)菌膜微孔蛋白基因OprD2缺失、細(xì)菌產(chǎn)IMP型金屬-內(nèi)酰胺酶及細(xì)胞主動(dòng)外排機(jī)制有關(guān)；臨床上應(yīng)加強(qiáng)細(xì)菌耐藥的監(jiān)測(cè)以及抗菌藥物的合理應(yīng)用，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

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