我國(guó)部分省市牛副結(jié)核病的血清學(xué)調(diào)查與分析

孫 雨，馬世春，董 浩，王曉英

（中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京102600）

牛副結(jié)核?。˙ovine paratuberculosis）是由副結(jié)核分支桿菌引起的以牛慢性增生性、頑固性腸炎和進(jìn)行性消瘦為特征的人畜共患傳染?。?］。牛副結(jié)核病的主要臨床癥狀與病理變化是頑固性腹瀉、漸進(jìn)性消瘦、腸黏膜增厚并形成皺褶、慢性肉芽腫性回腸炎。本病給養(yǎng)牛業(yè)造成很大的損失［2］。由于本病潛伏期長(zhǎng)，傳播快，加之人工培養(yǎng)副結(jié)核分支桿菌難度又高，因此加強(qiáng)對(duì)該病的流行病學(xué)調(diào)查與實(shí)驗(yàn)室診斷研究對(duì)其綜合防控具有十分重要的意義［3］。除常規(guī)的臨床診斷外，牛副結(jié)核病的確診依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)室診斷方法，主要是血清學(xué)診斷和病原學(xué)診斷方法［4］。由于我國(guó)大部分省市的牛均未進(jìn)行副結(jié)核疫苗免疫，因此血清抗體陽(yáng)性則表明其已經(jīng)感染［5－8］。為了更全面、準(zhǔn)確掌握我國(guó)部分省市牛副結(jié)核病的流行和分布情況，并進(jìn)行相應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)分析和科學(xué)防控，本研究使用法國(guó)ID－VET 公司生產(chǎn)的牛副結(jié)核病抗體ELISA 試劑盒對(duì)我國(guó)河北、山西、青海、新疆、西藏、湖北、重慶6個(gè)省市2014年－2015年收集的3 600頭牛血清樣品進(jìn)行了牛副結(jié)核病感染調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 牛副結(jié)核病抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自法國(guó)ID－VET 公司。

1.1.2 血清樣品 2014年－2015年采自河北、山西、青海、新疆、西藏、湖北、重慶6 個(gè)省市的規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)、種畜場(chǎng)、散養(yǎng)戶(hù)牛血清樣品共3 600份。按照樣品來(lái)源省份分，其中河北800份、山西800份、青海200份、新疆1 000 份、西藏200 份、湖北200份、重慶400份。按照樣品來(lái)源分，規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)牛血清1 000份，種畜場(chǎng)牛血清600份，集貿(mào)市場(chǎng)400份，散養(yǎng)戶(hù)牛血清1 600份。按照動(dòng)物品種分，奶牛血清2 400份，肉牛血清600份，牦牛血清400份。

1.2 方法

1.2.1 牛副結(jié)核病抗體檢測(cè) 在ELISA 抗原包被反應(yīng)孔中加入稀釋好的血清樣本110μL，振蕩10s，充分混勻，置21℃溫育45 min。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次后拍干，加入酶標(biāo)記物100μL，置21℃溫育30min后，棄去液體，洗滌3次后拍干，加入底物100μL，振蕩混勻，21℃避光反應(yīng)15min后，加入終止液100μL，振蕩10s，5min～30min 內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定其光密度值，檢測(cè)每批血樣均設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽(yáng)性和空白對(duì)照。具體操作見(jiàn)牛副結(jié)核病抗體（Ig G）檢測(cè)試劑盒（ELISA 方法）。

1.2.2 結(jié) 果 判 定 陽(yáng) 性 樣 本OD 值（OD 陽(yáng) 性）＞0.35；陽(yáng)性樣本OD 值（OD 陽(yáng)性）與陰性樣本OD值（OD 陰性）的比值＞3 的條件下檢測(cè)的結(jié)果有效，否則試驗(yàn)不成立，需重新做。

按照以下S／P 百分值計(jì)算判定每個(gè)樣品的結(jié)果：S／P＝（OD 樣本－OD 陰性）／（OD 陽(yáng)性－OD陰性）×100%；當(dāng)S／P≤60%時(shí)結(jié)果判為陰性；S／P≥70%時(shí)結(jié)果判為陽(yáng)性；60%＜S／P＜70%時(shí)結(jié)果判為可疑。

2 結(jié)果

2.1 2014－2015年我國(guó)部分省市牛副結(jié)核病抗體檢測(cè)結(jié)果

本次共調(diào)查牛血清樣品3 600份，檢出牛副結(jié)核病抗體陽(yáng)性樣品共82份，平均陽(yáng)性率為2.29%。各省市的牛血清均有陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率從0.5%～3.75%不等。按照省份區(qū)分，重慶的陽(yáng)性率最低為0.5%，山西的陽(yáng)性率最高為3.75%，新疆陽(yáng)性率為2.2%、河北陽(yáng)性率為2%、青海陽(yáng)性率為1.5%、重慶陽(yáng)性率為0.75%、湖北陽(yáng)性率為0.5%（圖1）。

圖1 2014－2015年我國(guó)部分省市牛副結(jié)核病抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The test results of bovine paratuberculosis antibodies in some provinces of China from 2014to 2015

2.2 不同來(lái)源的牛血清中副結(jié)核病抗體檢測(cè)結(jié)果

對(duì)2014－2015年不同來(lái)源的3600份牛血清通過(guò)ELISA 方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，采集于各省市散養(yǎng)戶(hù)、種畜場(chǎng)、規(guī)模場(chǎng)和集貿(mào)市場(chǎng)的牛血清均能檢測(cè)出副結(jié)核抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率從0.17%～3.06%不等。按照樣品來(lái)源分，散養(yǎng)戶(hù)的牛陽(yáng)性率最高為3.06%，其次是集貿(mào)市場(chǎng)的牛陽(yáng)性率為2.75%，規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的牛陽(yáng)性率為2.1%，最后是種牛場(chǎng)的牛陽(yáng)性率為0.17%（圖2）。

2.3 不同品種來(lái)源牛血清中副結(jié)核抗體檢測(cè)結(jié)果

各省市的奶牛、牦牛和肉牛的血清中均能檢測(cè)出副結(jié)核抗體，陽(yáng)性率從0.83%～2.79%不等。按照動(dòng)物品種來(lái)源分，牦牛血清的陽(yáng)性率最高為2.79%，其次是奶牛血清的陽(yáng)性率為2.5%，最后是肉牛血清的陽(yáng)性率為0.83%（圖3）。

圖2 不同來(lái)源的牛血清中副結(jié)核抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The detection results of paratuberculosis antibodies in bovine sera from different sources

圖3 不同品種的牛血清中副結(jié)核抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The detection results of paratuberculosis antibodies in bovine sera from different varieties

3 討論

采用法國(guó)ID－VET 公司生產(chǎn)的牛副結(jié)核病抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒對(duì)我國(guó)河北、山西、青海、新疆、西藏、湖北、重慶6個(gè)省市采集的3 600份牛血清樣品進(jìn)行了牛副結(jié)核病抗體檢測(cè)，從樣品來(lái)源地、養(yǎng)殖方式與采樣動(dòng)物品種上進(jìn)行了一次初步的調(diào)查，樣品來(lái)源覆蓋面較大，涉及到全國(guó)6個(gè)省市的規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)、種畜場(chǎng)、散養(yǎng)戶(hù)的奶牛、肉牛和與牦牛。各省市 的牛血 清 均 有 陽(yáng) 性，陽(yáng) 性 率 從0.5%～3.75%不等，但是山西、河北、新疆等北方地區(qū)牛副結(jié)核病的陽(yáng)性率一定程度上高于湖北與重慶等南方地區(qū)，說(shuō)明牛副結(jié)核病在北方地區(qū)的流行情況要高于南方地區(qū)。按照樣品來(lái)源分，散養(yǎng)戶(hù)的牛陽(yáng)性率最高為3.06%，其次是集貿(mào)市場(chǎng)為2.75%，規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)為2.1%，最后是種牛場(chǎng)為0.17%。說(shuō)明養(yǎng)殖方式對(duì)該病的流行也有一定的影響。被副結(jié)核分支桿菌污染的周?chē)h(huán)境、水源、糞便等是副結(jié)核病的主要傳染來(lái)源。大型的規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)與管理嚴(yán)格的種牛場(chǎng)消毒衛(wèi)生條件較好，人員、動(dòng)物出入管理嚴(yán)格，飼養(yǎng)方式相對(duì)科學(xué)，感染率要小于養(yǎng)殖方式較為落后的農(nóng)村散養(yǎng)戶(hù)。按照動(dòng)物品種來(lái)源分，奶牛血清的陽(yáng)性率最高為2.79%，其次是牦牛血清的陽(yáng)性率為2.5%，最后是肉牛血清的陽(yáng)性率為0.83%。從結(jié)果上可以分析出奶牛對(duì)副結(jié)核分支桿菌最為易感，副結(jié)核病給奶牛業(yè)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失也最大，其中牛奶是副結(jié)核病的主要感染源，被副結(jié)核分支桿菌污染的牛奶極易將病原傳染給犢牛與人類(lèi)造成公共衛(wèi)生安全隱患。牦牛的血清陽(yáng)性率明顯高于肉牛，可能原因是大部分高原牦牛采取散養(yǎng)的飼養(yǎng)方式，衛(wèi)生條件較差，管理較為混亂，被副結(jié)核分支桿菌污染的糞便隨意排放到草原上嚴(yán)重污染了飼養(yǎng)環(huán)境。牦牛在放養(yǎng)食草過(guò)程中很容易采食到被病原菌污染的牧草，從而造成腸道感染，而肉牛養(yǎng)殖大多采取規(guī)范化的規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)或養(yǎng)殖小區(qū)進(jìn)行飼養(yǎng)，飼喂方式與衛(wèi)生環(huán)境明顯好于在高山草原放養(yǎng)的牦牛。牛副結(jié)核病對(duì)肉牛與牦牛的生產(chǎn)性能危害也較大，該病容易引起牛慢性增生性、頑固性腸炎和進(jìn)行性消瘦，嚴(yán)重影響肉牛的產(chǎn)肉性能，所以牦牛與肉牛的副結(jié)核病同樣需要引起獸醫(yī)公共衛(wèi)生方面的高度重視。

［1］ 田克恭.人與動(dòng)物共患?。跰］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2013.

［2］ 楊 倩，王全凱，宋戰(zhàn)昀，等.結(jié)核分支桿菌核酸適配體研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，31（12）：122－126.

［3］ Tripathi B N，Stevenson K.Detection of Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis in formalin－fixed，paraffin embedded tissues of goats by IS900polymerase chain reaction［J］.Aust Vet J，2012，102（1）：84－88.

［4］ 付喜愛(ài)，張德顯，周 維，等.細(xì)菌λRed重組技術(shù)的應(yīng)用及其影響因素［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，36（1）：91－95.

［5］ Lavers C J，Dohoo I R，McKenna S L，et al.Sensitivity and specificity of repeated test results from a commercial milk enzyme－linked immunosorbent assay for detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in dairy cattle［J］.J Am Vet Med Assoc，2015，246（2）：236－244.

［6］ Piras C，Soggiu A，Bonizzi L，et al.Identification of immunoreactive proteins of Mycobacterium aviumsubsp.paratuberculosis［J］.Proteomics，2015，15（4）：813－823.

［7］ Sztevn J，Wiszniewska A，Smolińska A.Evaluation of methods for Mycobacterium avium ssp.paratuberculosis detection in milk samples from the cattle herd showing low seroprevalence of Johne＇s disease［J］.Pol J Vet Sci，2014，17（3）：459－463.

［8］ 張?jiān)词纾g.瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)盒檢測(cè)綿羊副結(jié)核分支桿菌抗體效果的評(píng)價(jià)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，1999，29（1）：60－61.