青蒿多糖對免疫抑制小鼠免疫器官的影響

帥學(xué)宏，施 君，陳吉軒，黃慶洲，伍 莉，胡庭?。?/p>

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶402460；2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005）

多糖具有免疫調(diào)節(jié)，降血脂，抗腫瘤，抗氧化，抗衰老，抗病毒等多種生物活性［1－5］。作為免疫調(diào)節(jié)劑，它可以通過多種途徑調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能［6－12］。本試驗選用環(huán)磷酰胺建立免疫功能抑制小鼠模型，用青蒿多糖對模型小鼠進(jìn)行處理，從組織形態(tài)學(xué)上觀察胸腺與脾臟的結(jié)構(gòu)變化，探討青蒿多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明種小鼠60只，SPF級，體重為18g～22g，健康，雌雄各半，購自于廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

1.1.2 主要試劑及藥品 注射用環(huán)磷酰胺，上海恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。生理鹽水、甲醛、冰醋酸均為國產(chǎn)分析純。青蒿多糖，由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理研究室提供。

1.1.3 主要儀器及設(shè)備 AB104－L 分析天平，瑞士梅特勒公司產(chǎn)品；DK－98－Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋、尼康YS100生物顯微鏡，購自天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物處理及采樣 將60只昆明種小鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，雌雄各半。待小鼠適應(yīng)3d后進(jìn)行正式實驗。Ⅰ組為生理鹽水組，上午每只注射0.5mL生理鹽水，下午注射等量生理鹽水；Ⅱ組為免疫抑制組，上午每只注射0.5mL 生理鹽水，下午注射等量環(huán)磷酰胺使其終劑量達(dá)到40mg／kg；Ⅲ組到Ⅵ組為免疫抑制加不同劑量青蒿多糖組，上午每只均注射0.5 mL 青蒿多糖，使多糖的終劑量分別為25、50、100、150 mg／kg，下午注射等量環(huán)磷酰胺使其終劑量達(dá)到40 mg／kg，以上處理均為腹腔注射，連續(xù)處理7d。于末次給藥后次日，對所有小鼠進(jìn)行稱重。頸椎脫臼處死小鼠，取胸腺和脾臟稱重，并計算臟器指數(shù)。將胸腺、脾臟浸泡在波恩固定液中固定，制作石蠟切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2 結(jié)果處理 小鼠的臟器指數(shù)的計算［13］：胸腺指數(shù)＝胸腺重量（mg）／小鼠體重（g）；脾臟指數(shù)＝脾臟重量（mg）／小鼠體重（g）。用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，試驗所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析檢驗差異顯著性。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。用顯微鏡觀察組織切片的形態(tài)變化。

2 結(jié)果

與對照組相比，環(huán)磷酰胺可極顯著降低小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)（P＜0.01）。與免疫抑制模型組相比，使用青蒿多糖的各組對環(huán)磷酰胺降低的胸腺指數(shù)均無明顯的升高作用；而50、100、150mg／kg劑量青蒿多糖可對環(huán)磷酰胺降低的脾臟指數(shù)有不同程度的升高作用（P＜0.05或P＜0.01）（表1）。

表1 青蒿多糖對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響Table 1 Effects of HAAP on thymus and spleen indexes in mice

空白對照組胸腺的皮質(zhì)與髓質(zhì)分界清楚（圖1A）；環(huán)磷酰胺組的胸腺分葉模糊、皮質(zhì)與髓質(zhì)分界不清楚、皮質(zhì)變?。▓D1B）；Cy和25mg／kg多糖聯(lián)用組胸腺分葉不明顯，皮質(zhì)與髓質(zhì)分界清晰，間質(zhì)與空白對照組類似，皮質(zhì)變厚（圖1C）；Cy和50mg／kg多糖聯(lián)用組胸腺分葉不明顯，皮質(zhì)與髓質(zhì)分界較模型組清晰（圖1D 中白色箭頭），皮質(zhì)略有萎縮，間質(zhì)較空白對照組增寬但不及模型組（圖1D 中黑色箭頭）；Cy和100mg／kg、150mg／kg多糖聯(lián)用組胸腺分葉不明顯，間質(zhì)未明顯增寬（圖1E，圖1F）。

圖2中空白對照組皮質(zhì)部胸腺細(xì)胞密集（圖2A中白色箭頭），髓質(zhì)部有較多胸腺細(xì)胞（圖2A 中黑色箭頭）。環(huán)磷酰胺組胸腺細(xì)胞稀疏（圖2B 中白色箭頭）。Cy和25mg／kg多糖聯(lián)用組皮質(zhì)部胸腺細(xì)胞密集（圖2C中白色箭頭），髓質(zhì)部可見較多的胸腺細(xì)胞（圖2C中黑色箭頭）。Cy和50mg／kg多糖聯(lián)用組皮質(zhì)多見胸腺細(xì)胞（圖2D 中白色箭頭），髓質(zhì)胸腺細(xì)胞也增多（圖2D 中黑色箭頭）。Cy和100mg／kg、150mg／kg多糖聯(lián)用組皮質(zhì)胸腺細(xì)胞（圖2E 和圖2F中白色箭頭）和髓質(zhì)胸腺細(xì)胞（圖2E 和圖2F中黑色箭頭）均較免疫抑制組的多。

由圖3可見空白對照組的脾小體較大，數(shù)量較多（圖3A 中白色箭頭），中央動脈周圍淋巴鞘面積較大（圖3A 中黑色箭頭）；環(huán)磷酰胺組脾臟白髓和紅髓分界不清晰，脾小體數(shù)量較少，體積較?。▓D3B）；給青蒿多糖的各組脾臟白髓和紅髓分界隨著多糖濃度的增多而變得清晰，脾小體保持完整，較免疫抑制組的大（圖3C～圖3F）。

圖1 小鼠胸腺組織顯微結(jié)構(gòu)（HE，40×）Fig.1 Thymus tissue microstructure of mice（HE，40×）

圖2 小鼠胸腺組織顯微結(jié)構(gòu)（HE，400×）Fig.2 Thymus tissue microstructure of mice（HE，400×）

圖4可見，空白組中央動脈周圍淋巴鞘的淋巴細(xì)胞密集（圖4A 中白色箭頭所示為中央動脈，黑色箭頭所示為中央動脈周圍淋巴鞘），環(huán)磷酰胺組的較對照組稀疏（圖4B 中白色箭頭所示為中央動脈，黑色箭頭所示為中央動脈周圍淋巴鞘）。給青蒿多糖的各組中央動脈周圍淋巴鞘的淋巴細(xì)胞較免疫抑制組的密集（圖4C～圖4F 中白色箭頭所示為中央動脈，黑色箭頭所示為中央動脈周圍淋巴鞘）。

圖3 小鼠脾臟組織顯微結(jié)構(gòu)（HE，40×）Fig.3 Spleen tissue microstructure of mice（HE，40×）

圖4 小鼠脾臟組織顯微結(jié)構(gòu)（HE，400×）Fig.4 Spleen tissue microstructure of mice（HE，400×）

3 討論

免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺等藥物可導(dǎo)致免疫器官發(fā)生萎縮使小鼠免疫器官指數(shù)降低，外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，從而使小鼠細(xì)胞免疫功能受到嚴(yán)重的抑制。環(huán)磷酰胺屬于細(xì)胞周期非特異性化療藥物，對增殖周期中各期血細(xì)胞均有殺滅作用，其在殺傷異常細(xì)胞的同時，可損傷機(jī)體的免疫器官，抑制機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫［14－15］。研究表明多糖可顯著增強(qiáng)免疫低下動物的免疫功能，促進(jìn)健康動物的免疫器官發(fā)育，增加其免疫器官指數(shù)［16－20］。本試驗采用環(huán)磷酰胺建立免疫抑制模型后，小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著降低。胸腺分葉模糊、皮質(zhì)與髓質(zhì)分界不清楚、皮質(zhì)變薄，胸腺細(xì)胞稀疏。脾臟的紅髓和白髓分界不清晰，脾小體數(shù)量較少，體積較小，中央動脈周圍淋巴鞘的淋巴細(xì)胞較空白組稀疏，表明環(huán)磷酰胺對小鼠脾臟和胸腺有抑制作用，成功建立了免疫抑制模型。25 mg／kg青蒿多糖可使免疫抑制組小鼠胸腺皮質(zhì)與髓質(zhì)分界清晰，間質(zhì)與空白對照組類似，皮質(zhì)變厚。皮質(zhì)部胸腺細(xì)胞密集。50 mg／kg青蒿多糖作用于免疫抑制組后，胸腺皮質(zhì)與髓質(zhì)分界較模型組清晰，間質(zhì)較空白對照組增寬但不及模型組，皮質(zhì)多胸腺細(xì)胞，髓質(zhì)胸腺細(xì)胞也增多。100mg／kg和150mg／kg青蒿多糖作用于免疫抑制組后，胸腺分葉不明顯，間質(zhì)未明顯增寬，皮質(zhì)胸腺細(xì)胞和髓質(zhì)胸腺細(xì)胞均較免疫抑制組的多。各種劑量青蒿多糖組的脾臟白髓和紅髓分界隨著多糖濃度的增多而變得清晰，脾小體保持完整，較免疫抑制組的大。中央動脈周圍淋巴鞘的淋巴細(xì)胞較免疫抑制組的密集。這與之前報道的有關(guān)多糖對免疫抑制小鼠免疫功能調(diào)節(jié)的研究結(jié)果相似［21－23］。結(jié)果提示，青蒿多糖對環(huán)磷酰胺造成的脾臟和胸腺免疫功能抑制有較好的改善作用，在一定程度上青蒿多糖能提高環(huán)磷酰胺所致免疫功能抑制小鼠的免疫功能。

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