托氟沙星納米乳的體內外抗菌作用研究

高 嫻，歐陽五慶＊，楊鳴琦＊，王波臻，鄭 寅，李夢云，劉 岳

（1.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌712100；2.石河子大學動物科技學院，新疆石河子832003；3.河南科技大學動物科技學院，河南洛陽471003）

托氟沙星（tosufloxacin，T－3262）又名妥舒沙星、托磺沙星，化學名為（±）－7－（3－氨基－1－吡咯烷基）－1－（2，4－二氟苯基）－6－氟－4－氧代－1，8－萘啶－3－羧酸，是日本富山化學工業(yè)公司綜合研究所首先研制成功的一種廣譜、高效的新型氟喹諾酮類抗菌藥物。托氟沙星除具有氟喹諾酮類藥物的共同特點，即對需氧革蘭陰性桿菌包括綠膿桿菌抗菌活性高，對細胞、組織穿透力強，吸收后在體內分布廣泛，組織液藥物濃度高，不良反應輕微等外，與已上市的同類藥品相比，它還具有對葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬等需氧革蘭陽性菌以及厭氧菌抵抗活性增強的優(yōu)點。但托氟沙星難溶于水，現(xiàn)有的片劑和膠囊，只能采取拌料方式為畜禽用藥，不易拌勻，可能造成畜禽中毒或對疾病無效的情況，嚴重影響其在養(yǎng)殖行業(yè)的推廣應用。

本實驗室自行研制的托氟沙星納米乳（以下簡稱為TFLX－NE）易溶于水，可兌水給予患病畜禽，成功解決了托氟沙星在臨床應用中存在的問題。本試驗首次對托氟沙星納米乳的體外抑菌活性和體內藥效作用進行考察，以期對獸醫(yī)臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑 托氟沙星，河南天耀科技有限公司產品；鹽酸左氧氟沙星，西安市臨澤科技有限公司產品；二甲基亞砜（DMSO）、磷酸氫二鉀，天津市博迪化工有限公司產品；蛋白胨、瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司產品；氯化鈉，成都市科龍化工試劑廠產品；牛肉膏，北京奧博星生物技術有限公司產品；聚氧乙烯醚（40）氫化蓖麻油（RH－40），天津市恒興化學試劑有限公司產品；乳酸，天津市天力化學試劑有限公司產品；牛至油，江西吉安中香天然植物有限公司產品；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司產品。

1.1.2 試驗菌株 無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、多殺巴氏桿菌（Pasteurella multocida）、大腸埃希菌O 78（Escherichia coli）、痢疾志賀菌（Shigella dysenteriae）、鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium），由西北農林科技大學動物醫(yī)學院微生物實驗室惠贈；甲型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi－A），分離自患病的賽鴿；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。

1.1.3 主要儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司產品；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司產品；AUY220電子天平，日本島津公司產品。

1.1.4 試驗用動物 1日齡海蘭褐雛雞200只，購自陜西省武功鎮(zhèn)友民種雞場。試驗雞喂給無抗生素的全價雛雞飼料，自由飲水和采食，雞只按組分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境經嚴格滅菌消毒，無病原微生物。

1.1.5 病料 病料采自陜西西安某賽鴿公棚。剖檢病死賽鴿，無菌采取肝臟、脾臟等器官。

1.2 方法

1.2.1 TFLX－NE及空白納米乳的制備

1.2.1.1 TFLX－NE的制備 TFLX－NE由本實驗室研發(fā)。室溫下，按照TFLX－NE的配方，精確稱取托氟沙星（0.136g／kg）溶于牛至油（0.324g／kg）中，再加入乳酸（0.260g／kg），充分攪拌使托氟沙星全部溶解，然后加入RH－40（2.598g／kg）混勻，最后邊攪拌邊逐滴加入蒸餾水（6.682g／kg），即可制得淡黃色澄清透明的TFLX－NE。

本組甲狀腺癌單發(fā)占70.0%，多發(fā)占比30.0%；甲狀腺良性結節(jié)單發(fā)占比37.5%，多發(fā)占比62.5%。甲狀腺癌與甲狀腺良性結節(jié)的數目比較，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。

1.2.1.2 空白納米乳的制備 精確稱取TFLX－NE配方量的牛至油、乳酸、RH－40、蒸餾水，按照“1.2.1.1”所述方法即可制得淡黃色澄清透明的空白納米乳。

1.2.2 甲型副傷寒沙門菌的分離鑒定 無菌操作采集患病賽鴿的肝臟、脾臟，將剪切面涂抹麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。挑取白色菌落，革蘭染色，光學顯微鏡下觀察；該菌落的另一半接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基增殖。將菌懸液接種于各種生化發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)48h，觀察發(fā)酵管的顏色變化、有無氣泡產生。

1.2.3 TFLX－NE的MIC測定 采用美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）M7－A6推薦的肉湯稀釋法［1］測定不同藥物對無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、多殺巴氏桿菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌、鼠傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌的最低抑菌濃度。

1.2.3.1 培養(yǎng)基的配制 參照《微生物培養(yǎng)基的制造與應用》，分別配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血清瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和緩沖肉湯培養(yǎng)基，121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。

1.2.3.2 菌懸液的制備 分別將金黃色葡萄球菌、多殺巴氏桿菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌、鼠傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，無乳鏈球菌劃線接種于血清瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24h活化。挑單個菌落，將無乳鏈球菌接種于緩沖肉湯，其他菌株接種于營養(yǎng)肉湯，37 ℃培養(yǎng)16h。根據不同濃度菌液在600nm 處吸光值的不同，用生理鹽水調節(jié)菌液濃度為2×105CFU／mL。

1.2.3.3 藥物儲備液的制備 將托氟沙星溶解于DMSO，配成質量濃度為1 280μg／mL 的溶液，參考CLSI的M27－T方案，用各種菌株的培養(yǎng)液稀釋藥物濃度為256μg／mL［2］。將TFLX－NE、空白納米乳、鹽酸左氧氟沙星用蒸餾水分別配制濃度為256μg／mL的溶液。所有藥液均用0.22μm 濾器過濾除菌，備用。

1.2.3.4 接種和培養(yǎng) 采用96孔微量培養(yǎng)板，取100μL配制好的肉湯培養(yǎng)液加入第1～12孔，再向第1孔加入100μL配置好的TFLX－NE儲備液，混合均勻后，吸出100μL液體加入第2孔中，以此類推，直至第10孔，從第10孔吸出100μL液體棄去。經過二倍稀釋后，向第1～11孔中各加入5μL金黃色葡萄球菌懸液，第12孔加入5μL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，混合均勻。此時，第1～10孔，含有TFLX－NE濃度為128.00 μg／mL～0.25μg／mL，每孔體積為105μL。第11孔未加TFLX－NE，作為陽性對照；第12孔只含有營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，作為陰性對照。培養(yǎng)板的第1～4行分別對應4種藥物，依次為TFLX－NE、托氟沙星原料藥、鹽酸左氧氟沙星原料藥、空白納米乳。將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h～24h。當陰性對照孔澄清透亮（無細菌生長），陽性對照孔明顯渾濁（細菌生長良好）時，較澄清透亮的試驗孔對應的最低濃度為藥物的最低抑菌濃度（MIC）。

按照上述方法，分別接種無乳鏈球菌、多殺巴氏桿菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌、鼠傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌，其中無乳鏈球菌的培養(yǎng)液為緩沖肉湯培養(yǎng)基。每種藥品儲備液的MIC測定試驗平行操作3次。

1.2.4 TFLX－NE 的MBC 測定 將藥物的MIC 對應孔及前面試驗孔的液體用微量移液器分別移至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，其中無乳鏈球菌對應的液體移至血清瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，以菌落數少于5個的平皿對應的最低藥物濃度為該待測藥物的最低殺菌濃度（MBC）值［3］。

1.2.5 TFLX－NE的體內藥效試驗 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)的鼠傷寒沙門菌感染14日齡雛雞，雞只出現(xiàn)明顯的臨床癥狀后，用TFLX－NE 進行治療性預試驗，找出TFLX－NE對鼠傷寒沙門菌感染雛雞的治療窗，在該劑量范圍內擬定由低到高的3個劑量組，進行體內藥效試驗［4］。

1.2.5.1 動物分組和處理 試驗雛雞14日齡時，挑選體重相近者180羽，隨機分為6組，每組30羽，雌雄各半。試驗當天，A 組～E 組分別灌胃1.8×108CFU／mL的鼠傷寒沙門菌（1.2mL／羽），F(xiàn)組灌胃同樣劑量的生理鹽水作為陰性對照。感染鼠傷寒沙門菌后第2天，雛雞群出現(xiàn)不同程度的禽副傷寒臨床癥狀。此時，A 組～C組雛雞分別給予含TFLX－NE的飲水（80、60、40mg／L），D組雛雞按中劑量TFLX－NE（60mg／L）的用藥量拌料給予托氟沙星原藥，連續(xù)用藥5d。E組不給藥，作為陽性對照，所有試驗雛雞的其他飼養(yǎng)條件均一致。仔細觀察并記錄各組雛雞的臨床癥狀、死亡情況等，剖檢死亡雛雞，觀察病理變化，用肝臟組織塊涂抹營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離鑒定感染菌株，連續(xù)觀察7d。試驗最后1d將所有雛雞空腹稱重，并解剖觀察病理變化，記錄各組雛雞平均增重、平均增重率和死亡率。

1.2.5.2 數據處理 數據用“平均值±標準差”表示，試驗前、后的雛雞體重及平均增重運用SPSS17.0軟件進行鄧肯多重比較（Duncan）分析，死亡率應用卡方檢驗（chi－square test）分析。

2 結果

2.1 甲型副傷寒沙門菌分離鑒定

該菌在麥康凱培養(yǎng)基上為白色、表面光滑濕潤、邊緣整齊的小菌落，革蘭染色后，光學顯微鏡下觀察為革蘭陰性、兩端鈍圓的短桿菌，其生化反應結果見表1，參照《人及動物病原細菌學》［5］判斷，該細菌為甲型副傷寒沙門菌。

表1 分離細菌生化試驗結果Table 1 The biochemical test results of bacteria isolated

2.2 TFLX－NE的MIC測定

每次試驗均以金黃色葡萄球菌ATCC6538 作為質控菌株，鹽酸左氧氟沙星對該菌的MIC 為2μg／mL，符合CLSI規(guī)定的標準范圍（0.50μg／mL～2μg／mL），說明本試驗結果準確可靠。TFLXNE對無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、多殺巴氏桿菌、鼠傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌的MIC 為0.25μg／mL～2μg／mL，托氟沙 星 對 這7 種 菌 株 的MIC 為0.5 μg／mL～4μg／mL，表明托氟沙星經納米化后可提高體外抗菌效果。鹽酸左氧氟沙星對這些菌株的MIC 為2μg／mL～4μg／mL，抗菌作用較托氟沙星差或相當，但明顯弱于TFLX－NE（表2）。

表2 各試驗藥物對不同細菌的MIC值Table 2 The MICs of test drugs against various bacteria μg／mL

2.3 TFLX－NE的MBC測定

TFLX－NE對無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、多殺巴斯得菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌、鼠傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌的體外殺菌效果明顯優(yōu)于托氟沙星和鹽酸左氧氟沙星（表3）。

2.4 TFLX－NE的體內藥效試驗

灌胃給予14日齡雛雞鼠傷寒沙門菌，12h內雞只陸續(xù)出現(xiàn)禽副傷寒臨床癥狀［6］，表現(xiàn)為畏冷喜扎堆，閉目，垂翅，松毛，厭食，水樣下痢，肛門黏結糞便，或有眼結膜炎等。剖檢死亡雞只，肝臟腫大，表面有灰白色如“雪花樣”的壞死灶（圖1）；肺臟發(fā)生灶性壞死；脾臟腫大，表面有點狀出血灶；腎臟腫大；心包炎、心肌炎等（圖2）。給藥后第3天，B組雛雞的臨床癥狀明顯減輕，其他給藥組雛雞的臨床癥狀稍減輕；第5天B組雛雞的臨床癥狀完全消失，其他組雛雞的臨床癥狀明顯減輕。試驗期間，TFLX－NE 給藥組的平均增重極顯著大于感染對照組（P＜0.01），表明TFLXNE能夠抑制鼠傷寒沙門菌在雛雞體內的增殖，減少感染雛雞的體重損失。同時，雛雞的存活率可由 56.67%提高至93.33%（表4和表5）。

表3 各試驗藥物對不同細菌的MBC值Table 3 The MBCs of test drugs against various bacteria μg／mL

圖1 感染雛雞肝臟表面有“雪花樣”壞死灶Fig.1 The liver surface snowflake－like necrosis in infected chicks

圖2 正常雛雞臟器（后排）與感染雛雞臟器（前排）Fig.2 Organs of normal chicks（back row）and organs of infected chicks（front row）

表4 各試驗組雛雞的存活情況Table 4 The survival rate of chicks in each test group

3 討論

納米乳作為一種理想的新型藥物載體，乳滴的比表面積遠大于其他劑型，有著顯著的表面效應和小尺寸效應，可以增強藥物的穩(wěn)定性，促進藥物在體內的吸收與分布，提高藥物的生物利用度。Cilek A 等［7］研究了重組人胰島素納米乳制劑對糖尿病大鼠的降糖作用，灌胃給藥后，大鼠血糖濃度降低約30%，降糖作用維持90min，與皮下注射溶液劑降糖效果相似。納米乳出眾的劑型優(yōu)勢，使其在21世紀越來越多的受到醫(yī)藥研究領域的關注［8］。托氟沙星為氟喹諾酮類抗菌藥物，主要用于治療呼吸道、泌尿道、腸道、口腔等感染。托氟沙星通過抑制細菌DNA 回旋酶，干擾DNA的正常轉錄與復制，同時抑制拓撲異構酶Ⅱ，干擾復制的DNA 分配到子代細胞中去，使細菌死亡。將托氟沙星制成納米乳，其體外抑菌活性較托氟沙星原藥提高2倍～4倍，且TFLX－NE的最低抑菌濃度與最低殺菌濃度相差較小，顯著提高了托氟沙星的抗菌性能，獸醫(yī)臨床應用中可降低用藥量，減少藥物使用帶來的毒副作用，縮短畜禽上市前的休藥期。TFLX－NE的這種低濃度抑菌優(yōu)勢，可能由于納米級的粒徑更易穿透細菌細胞壁，導致大量載藥納米乳滴進入細菌細胞內發(fā)揮抗菌作用；另一方面，納米乳中的藥物成分包被在乳滴內相，外相基質可以很好的保護藥物，避免其被細菌細胞內的物質分解，從而延長藥物的作用時間，提高藥物的抗菌作用。

表5 各試驗組雛雞的體重變化情況Table 5 The weight change of chicks in each test group

用鼠傷寒沙門菌肉湯培養(yǎng)物灌胃雛雞，模擬雛雞自然條件下感染禽副傷寒沙門菌的途徑，建立人工染病模型。灌胃給予鼠傷寒沙門菌后第2天，雛雞均表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，如垂翅，閉目，厭食，畏冷，水樣下痢，肛門黏結糞便等，與文獻報道相符［9］，表明本試驗成功建立禽副傷寒沙門菌病模型。試驗前各組雛雞的體重無顯著性差異，說明組間差異較小，分組合理。臨床用藥結果表明，TFLX－NE中劑量組的治療效果比低劑量組、高劑量組以及托氟沙星原藥拌料組的效果好。雛雞感染禽副傷寒后厭食甚至食欲廢絕，但是飲欲增加［10］，O／W 型TFLX－NE可飲水給藥，將藥物溶于飲水，使患病雛雞攝入更多的治療藥物；另外，不溶于水的托氟沙星包被于納米乳的內核中，口服給藥，載藥納米乳進入胃內，胃酸分解的主要是納米乳的外相物質，托氟沙星順利進入腸道發(fā)揮抗菌作用。

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