不同MLST 型禽源空腸彎曲菌致病性研究

呂嘉敏，黃 武，張宗堯，王 媚，羅開健

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642）

空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）是一種廣泛分布于自然界引起腸道功能紊亂的常見人獸共患病原菌?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)該菌除引起牛和綿羊流產(chǎn)，火雞的肝炎和藍(lán)冠病，童子雞和雛雞壞死性肝炎，雛雞、犢牛、仔豬的腹瀉等多種疾病外，還可引起人類急性腸炎和格蘭－巴雷（Guillain－Barre）綜合征［1－2］。家禽是人和動(dòng)物感染彎曲菌的主要儲(chǔ)存宿主，該菌對(duì)禽產(chǎn)品的安全、人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。

人彎曲菌感染90%以上是由空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌引起的［3］。由于缺乏適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)?zāi)Ｐ停壳皩?duì)空腸彎曲菌的毒力因子和致病機(jī)理了解甚少。近幾年的研究顯示，彎曲菌的毒力因素主要包括黏附、定植、侵入、產(chǎn)毒素、分子模擬等［4］。本試驗(yàn)挑取6個(gè)不同分離地區(qū)和9種不同MLST 分型的空腸彎曲菌代表菌株進(jìn)行致病性試驗(yàn)，以了解廣東地區(qū)禽源空腸彎曲菌菌株致病性特點(diǎn)、致病性與毒力因素的相互關(guān)系，為空腸彎曲菌致病機(jī)制的分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株、實(shí) 驗(yàn) 動(dòng) 物、細(xì) 胞 系 10 株9 種 不 同MLST 分型（多位點(diǎn)序列分型）的空腸彎曲菌、Vero細(xì)胞、Hela細(xì)胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部新獸藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存（表1）；菌株NCTC11168由美國(guó)菌種保藏中心提供；1日齡SPF 雞由廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 改良CCD 瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂均購(gòu)于青島海博有限責(zé)任公司；脫纖維綿羊血 購(gòu)自廣州蕊特生物技術(shù)公司；Triton－100，購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、EDTA胰酶和胎牛血清為美國(guó)Life Technologies公司產(chǎn)品；慶大霉素為美國(guó)Amerso公司產(chǎn)品；焦性沒食子酸、無水碳酸鈉，購(gòu)自廣州叢源生物儀器有限公司。

1.1.3 器材與設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板、移液管為Nest公司產(chǎn)品；微量可調(diào)移液器為法國(guó)Gilson公司產(chǎn)品；Elix100超純水器為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；LRH－250Ⅱ型生化培養(yǎng)箱為廣東省醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；JY200電子天平為上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠產(chǎn)品；YJ－1450 型超凈工作臺(tái)為蘇州凈化設(shè)備廠產(chǎn)品；AvantiTMJ－20型高速低溫離心機(jī)為美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品；GSP－9160MBE 隔水式恒溫培養(yǎng)箱為上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；手提式蒸汽高壓滅菌鍋為上海醫(yī)用核子儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 空腸彎曲菌的復(fù)蘇及培養(yǎng) 無菌條件下，挑取少許－80℃脫脂牛奶冷凍保存的空腸彎曲菌接種于哥倫比亞血瓊脂上，42℃微需氧條件（5%O2、10%CO2、85%N2）下培養(yǎng)48h。再擴(kuò)增培養(yǎng)2代，待菌株活力處于最佳狀態(tài)，用于下一步試驗(yàn)。

1.2.2 SPF雛雞致病性試驗(yàn) 用pH7.2的PBS收集在哥倫比亞血瓊脂平板上培養(yǎng)48h的空腸彎曲菌，將菌液3 000r／min離心10min，然后用PBS重懸細(xì)菌，稀釋至紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)600nm 測(cè)OD值約0.6，通過活菌計(jì)數(shù)確認(rèn)劑量約2×107CFU／mL，置于冰中，盡快進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

每組菌經(jīng)口接種6只1日齡SPF 雛雞，并分別設(shè)接種生理鹽水和NCTC1168 菌液對(duì)照組。每日觀察試驗(yàn)雞精神狀況、食欲、飲水、糞便等情況。在攻毒后第0、7、14天稱量每組試驗(yàn)雞平均體重；攻毒后第2、4、7、14、21天采集肛拭子，檢測(cè)帶菌情況，第21天處死并剖檢，觀察試驗(yàn)雞病變情況。

1.2.3 細(xì)胞致病性試驗(yàn)

1.2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存細(xì)胞取出，快速放入37℃水浴中，待細(xì)胞融化后立即取出，超凈臺(tái)上轉(zhuǎn)至細(xì)胞瓶中，然后緩慢加入培養(yǎng)基，邊加邊搖動(dòng)細(xì)胞瓶，最后加100mL／L血清。復(fù)蘇1h～2h，待細(xì)胞貼壁后，緩慢倒出培養(yǎng)液，加入血清（100 mL／L）新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)36h后觀察細(xì)胞狀態(tài)。

細(xì)胞來源于人子宮頸癌細(xì)胞（Hela）和非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）。在DMEM 培養(yǎng)基中添加100 mL／L的胎牛血清（Gibco）。細(xì)胞在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)傳代。

1.2.3.2 Vero、Hela細(xì)胞黏附試驗(yàn) 將培養(yǎng)好的Vero或Hela細(xì)胞消化后，接種于24 孔（濃度1×105／mL）細(xì)胞培養(yǎng)板，24h長(zhǎng)成單層（每孔約3×105個(gè)細(xì)胞）；DMEM 培養(yǎng)液洗滌，各組每孔分別加入0.9mL DMEM 培養(yǎng)液（含10 mL／L 胎牛血清）和0.1mL PBS菌懸液（2×107CFU／mL）；37℃孵育2h；吸去菌液，PBS漂洗3次；各孔加入1mL 含0.1 mL／L TritonX－100 的PBS 裂解單層細(xì)胞；吸出各孔懸液，混勻，經(jīng)1：100 稀釋后各取100μL 涂布于改良CCD 培養(yǎng)基，48h計(jì)數(shù)菌落。試驗(yàn)中有彎曲菌代表株試驗(yàn)組10 組、空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11168陽性對(duì)照組，共11個(gè)組每個(gè)樣本重復(fù)3次，每次做3個(gè)平行。

1.2.3.3 Vero、Hela細(xì)胞入侵試驗(yàn) 分組、單層細(xì)胞培養(yǎng)、加入菌懸液共培養(yǎng)等均同黏附試驗(yàn)；吸去菌液，PBS洗滌3次，每孔加入1mL含100μg／mL慶大霉素的培養(yǎng)液，殺死細(xì)胞外的空腸彎曲菌（此處理不影響細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌存活）；繼續(xù)孵育2h，吸去菌液，PBS 漂洗3次，加入1 mL 裂解液，裂解單層細(xì)胞；吸出各孔懸液，1∶100 稀釋，各取100μL 涂布于改良CCD 培養(yǎng)基，48h 培養(yǎng)計(jì)數(shù)菌落數(shù)，侵襲力用入侵細(xì)菌數(shù)比黏附細(xì)菌數(shù)百分率表示（即慶大霉素處理后存活細(xì)菌與黏附細(xì)菌數(shù)的百分率）。試驗(yàn)中彎曲菌代表株試驗(yàn)組10 組、空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11168陽性對(duì)照組，共11個(gè)組每個(gè)樣本重復(fù)3次，每次做3個(gè)平行。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 用g／w 記錄SPF雛雞的增重情況數(shù)據(jù)，黏附能力用黏附細(xì)菌數(shù)log10CFU／mL 值表示，入侵能力用百分比的換算方式表示［5］。使用Microsoft Excel 2007中的數(shù)據(jù)分析功能，對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)的t－test，以分析其中的差異顯著性。若P＜0.05，則判斷數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上有顯著差異，反之則判斷數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上無顯著差異［6］。

表1 菌株的來源、ST 序列型及攻毒的SPF雞的周增重與死亡情況Table 1 Source and MLST of CJ strains and the week weight gain and mortality of challenged SPF chickens

2 結(jié)果

2.1 SPF雛雞致病性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 試驗(yàn)雞攻毒后不同時(shí)間內(nèi)肛拭子帶菌、增重及死亡情況 試驗(yàn)雞感染雞源或鴨源空腸彎曲菌分離菌株后，都隨著時(shí)間的推移，排菌比例增加。到達(dá)攻毒后的第21天，除CJ006和CJ030組的試驗(yàn)雞肛門拭子帶菌率為83%外，其余組均為100%。其中雞源株CJ079攻毒組分別在第6、8、9天死亡1只；在周體重增長(zhǎng)方面，CJ079組由于死亡超過50%未進(jìn)行體重稱量。CJ018 試驗(yàn)組對(duì)SPF 雛雞未見明顯體重變化，其他攻毒試驗(yàn)組對(duì)SPF雛雞體重增長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響，但相互之間差異不大（P＞0.05）。

2.1.2 雞攻毒后臨床癥狀和剖檢變化

2.1.2.1 臨床癥狀 攻毒后試驗(yàn)雞飲水量明顯減少，采食量未見異常，羽毛蓬亂無光澤，初期輕度腹瀉，后期腹瀉嚴(yán)重且?guī)в斜阊F(xiàn)象，肛門周圍污染糞便，昏睡或伏地不愿走動(dòng)，部分雞雞冠蒼白。感染CJ001株的臨床癥狀為盲腸輕微鼓氣和內(nèi)紅色內(nèi)容物（圖4、圖5），感染CJ004株的臨床癥狀為肝臟針尖狀出血、十二指腸膨大，盲腸膨大充滿氣泡，感染CJ013株的臨床癥狀為肝臟少量白色狀壞死灶（圖6）、盲腸輕微鼓氣和內(nèi)紅色內(nèi)容物，感染CJ030 株的臨床癥狀為盲腸輕微鼓氣和內(nèi)紅色內(nèi)容物，感染CJ035株的臨床癥狀為膽汁稀薄，肝臟針尖狀出血、盲腸內(nèi)紅色內(nèi)容物，感染CJ018株的臨床癥狀為肝臟少量針尖狀壞死灶、泄殖腔黏膜出血、盲腸膨大和內(nèi)紅色內(nèi)容物，感染CJ050株的臨床癥狀為盲腸輕微鼓氣和內(nèi)紅色內(nèi)容物，感染CJ079株的臨床癥狀為試驗(yàn)雞消瘦、死亡、膽囊破裂、腸壁變薄、盲腸內(nèi)水樣糞便，感染CJ044株的臨床癥狀為盲腸內(nèi)壁有出血點(diǎn)（圖1）、充滿紅色內(nèi)容物，感染CJ041株的臨床癥狀為病雞心臟有出血點(diǎn)、盲腸乳頭狀壞死，充滿內(nèi)容物，感染空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11168的臨床癥狀為小腸壁出血（圖2）、腸壁白色壞死（圖3）、盲腸內(nèi)壁有出血點(diǎn)、充滿紅色內(nèi)容物，空白對(duì)照無異常。

2.1.2.2 剖檢變化 腸壁充血出血（圖1、圖2）、變薄或出現(xiàn)白色壞死（圖3）；盲腸內(nèi)充滿紅色內(nèi)容物（圖4）或水樣糞便、有的膨大充滿氣泡（圖5）；泄殖腔黏膜出血；心臟外膜有出血點(diǎn)；肝臟針尖狀出血、可見白色狀壞死灶（圖6），膽汁稀??；脾臟充血腫大。

圖1 盲腸出血Fig.1 Caecum hemorrhage

圖2 小腸出血Fig.2 Small intestine hemorrhage

圖3 小腸壁白色壞死灶Fig.3 Small intestine with white caseation

圖4 盲腸紅色內(nèi)容物Fig.4 Caecum with red contents

圖5 盲腸鼓氣Fig.5 Caecum flatulence

圖6 肝臟白色壞死灶Fig.6 Liver with white caseation

2.2 空腸彎曲菌代表株黏附入侵試驗(yàn)結(jié)果

11株彎曲菌中10株（9株實(shí)驗(yàn)室分離的空腸彎曲菌代表株、1 株空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)株）同時(shí)具有黏附、侵襲能力，CJ013對(duì)Vero細(xì)胞沒有黏附入侵能力。黏附力、侵襲力結(jié)果顯示：黏附力的log值變化范圍為4.32～5.51，侵襲率的變化范圍為0.24～71.4；試 驗(yàn) 中CJ079 入 侵 力 最 高，CJ030、CJ050、CJ004入侵力較高。Hela細(xì)胞黏附入侵試驗(yàn)：11株彎曲菌中8 株同時(shí)具有黏附、侵襲能力，CJ004、CJ079、C對(duì)Hela細(xì)胞無黏附入侵能力。黏附力、侵襲力結(jié)果顯示：黏附力的變化范圍為3.3～4.97，侵襲率的變化范圍為1.06～6.41；從圖3～圖6可以看出彎曲菌對(duì)Vero細(xì)胞的黏附入侵能力整體高于Hela細(xì)胞，雞源分離株略低于于鴨源分離株（CJ042和CJ040）的黏附力和侵襲力。將9株代表株分別與人源標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11168進(jìn)行比較，可發(fā)現(xiàn)半數(shù)以上（60%）的菌株對(duì)Vero細(xì)胞的入侵和對(duì)Hela的入侵能力均低于從腹瀉病人分離得到人源標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11168（P＜0.001）。而黏附情況則和標(biāo)準(zhǔn)株無明顯差異（P＞0.05）。

表2 菌株對(duì)Vero、Hela細(xì)胞的黏附、入侵情況Table 2 Adherence and invasiveness of CJ strains to Vero and Hela cells

3 討論

本研究挑取廣東省6個(gè)地區(qū)分離到的9種不同MLST 分型的10株彎曲菌代表株，對(duì)SPF 雛雞和細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，不同MLST 分型的空腸彎曲菌對(duì)SPF雞進(jìn)行攻毒試驗(yàn)后，試驗(yàn)雞肛拭子帶菌率比較高（83%以 上），結(jié)果與Konkel M E 等［7－8］的研究相似。但不同組別的SPF 試驗(yàn)雞體重增長(zhǎng)差異不大（P＞0.05）。其中，菌株CJ079（ST51）攻毒SPF雞后死亡超過50%，菌株CJ（ST6501）和CJ（ST50）均為17%，其余組別沒有出現(xiàn)死亡。另外，大多數(shù)菌株對(duì)Vero細(xì)胞的入侵力和對(duì)Hela的入侵能力均低于從腹瀉病人分離得到人源標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11168（P ＜0.001）。Newell D G 等［9］從環(huán)境中分離得到的空腸彎曲菌，侵襲Hela細(xì)胞的能力遠(yuǎn)不如從腹瀉病人中分離得到的細(xì)菌。Everest P H等［10］研究發(fā)現(xiàn)從患有腸炎病人分離的空腸彎曲菌與從無腹瀉癥狀病人分離的空腸彎曲菌，在侵襲水平上具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。雞源CJ079株對(duì)Vero細(xì)胞的侵襲力高于NCTC11168，這些具有高侵襲力的禽源分離株有可能對(duì)人類存在一定的威脅性，在公共衛(wèi)生上具有重要意義。

通過序列型與毒力之間的關(guān)系進(jìn)行分析，CJ001和CJ079 同屬于ST51 型，其中菌株CJ079對(duì)SPF雛雞、細(xì)胞黏附入侵力都較強(qiáng)，而菌株CJ001與其他MLST 分型的菌株相比并無明顯差異。這也顯示來源于不同環(huán)境中同一種序列型中的不同菌株也可能具備不同的毒力特征，MLST 型與毒力特征之間不存在某種確定的關(guān)系。多數(shù)禽源空腸彎曲菌對(duì)雞致死率較低［11］，因此也沒有引起國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)的重視。然而，世界衛(wèi)生組織已將該病列為最常見的食源性傳染病之一，中國(guó)國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)已于2003 年將彎曲菌病列入監(jiān)測(cè)體系中［12］。此外，空腸彎曲菌感染還可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的繼發(fā)病格林－巴利綜合征（GBS），該病屬于脫髓鞘障礙導(dǎo)致急性神經(jīng)肌肉麻痹，可對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。由于該菌在禽類的高帶菌率，特別是禽源彎曲菌是造成人感染彎曲菌的主要來源，只有控制彎曲菌在禽類的感染發(fā)病，才能杜絕動(dòng)物源彎曲菌感染人的問題。因此，對(duì)于養(yǎng)禽業(yè)者和獸醫(yī)工作者來說要重視解決這一問題。

［1］ Dasti J I，Tareen A M，Lugert R，et al.Campylobacter jejuni：a brief overview on pathogenicity－associated factors and disease－mediating mechanisms［J］.Int J Med Microbiol，2010，300：205－211.

［2］ van Doorn P A，Ruts L，Jacobs B C.Clinical features，pathogenesis，and treatment of Guillain－Barre syndrome［J］.Lancet Neurol，2008，7：939－950.

［3］ Tauxe R V.Emerging foodborne diseases：an evolving public health challenge［J］.Emerg Infect Dis，1997，3：425－434.

［4］ Muller J，Schulze F，Muller W，et al.PCR detection of virulence－associated genes in Campylobacter jejuni strains with differential ability to invade Caco－2cells and to colonize the chick gut［J］.Vet Microbiol，2006，113：123－129.

［5］ Louwen R，Heikema A，van Belkum A，et al.The sialylated lipooligosaccharide outer core in Campylobacter jejuni is an important determinant for epithelial cell invasion［J］.Infect Immun，2008，76：4431－4438.

［6］ Asakura H，Taguchi M，Ekawa T.Continued widespread dissemination and increased poultry host fitness of Campylobacter jejuni ST－4526and ST－4253in Japan［J］.J Appl Microbiol，2013，114（5）：1529－1538.

［7］ Konkel M E，Christensen J E，Dhillon A S，et al.Campylobacter jejuni strains compete for colonization in broiler chicks［J］.Appl Environ Microbiol，2007，73：2297－2305.

［8］ Hanel I，Muller J，Muller W，et al.Correlation between invasion of Caco－2eukaryotic cells and colonization ability in the chick gut in Campylobacter jejuni［J］.Vet Microbiol，2004，101：75－82.

［9］ Newell D G，Shreeve J E，Toszeghy M，et al.Changes in the carriage of Campylobacter strains by poultry carcasses during processing in abattoirs［J］.Appl Environ Microbiol，2001，67：2636－2640.

［10］ Everest P H，Goossens H，Sibbons P，et al.Pathological changes in the rabbit ileal loop model caused by Campylobacter jejuni from human colitis［J］.J Med Microbiol，1993，38：316－321.

［11］ Hardy C G，Lackey L G，Cannon J，et al.Prevalence of potentially neuropathic Campylobacter jejuni strains on commercial broiler chicken products［J］.Int J Food Microbiol，2011，145：395－399.

［12］ 吳蜀豫，張立實(shí)，冉 陸.彎曲菌及彎曲菌病的流行現(xiàn)狀［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2004（1）：58－61.