水貂IFN－α、IFN－β及IFN－γmRNA 熒光定量RT－PCR 檢測方法的建立及應(yīng)用

王 洋，胡 博，張海玲，魯榮光，呂 爽，劉 昊，孫彥剛，馬凡舒，趙建軍，張 蕾，薛向紅，史 寧，白 雪，徐淑娟，范思寧，凌明玉，李欣彤，閆喜軍＊

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病研究室，吉林長春130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118）

干擾素（interferon，IFN）是機(jī)體抗病毒感染的主要細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤等多種作用，是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分［1］。根據(jù)基因序列、染色體定位和受體特異性可以將IFN 分為3種類型，IFN－α和IFN－β屬于Ⅰ型干擾素，是機(jī)體抗病毒感染的主要細(xì)胞因子，具有抑制病毒復(fù)制和間接的防護(hù)病毒感染的作用［2－3］。IFN－γ屬于Ⅱ型干擾素，又稱免疫干擾素，主要由活化的T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞分泌，在病毒感染過程中具有活化免疫細(xì)胞的功能，即在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［4－5］。Ⅲ型干擾素是2003年發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞因子，稱為IFN－λ，其抗病毒機(jī)制與Ⅰ型IFN 相類似［6］。IFN 是機(jī)體內(nèi)各種抗病毒因子的潛在活化劑，可在較短時(shí)間內(nèi)使機(jī)體處于抗病毒狀態(tài)，使機(jī)體對病毒的感染作出快速抵抗［7］。因此，對機(jī)體內(nèi)IFN 進(jìn)行定量分析，不僅對免疫機(jī)制研究、免疫功能分析、疫苗免疫效果評估、器官移植、過敏反應(yīng)，而且對多種胞內(nèi)病原感染的診斷等方面都具有極其重要的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime PCR）具有靈敏度高、特異性好和操作簡便等特點(diǎn)，已成為核酸定量檢測的常用手段，該技術(shù)在犬細(xì)胞因子的檢測中也有應(yīng)用［8］。本研究擬建立一種用于檢測水貂IFN－α、IFN－β和IFN－γ mRNA 的熒光定量RT－PCR 方法，對水貂IFN－α、IFN－β和IFN－γ等細(xì)胞因子的表達(dá)水平作出評價(jià)，為水貂細(xì)胞因子的定量檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和毒種 水貂由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地提供；水貂腸炎病毒強(qiáng)毒株（SMVP－11）由本課題組分離和保存，病毒效價(jià)為5×106TCID50／mL。

1.1.2 主要試劑和儀器 淋巴細(xì)胞分離液，天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；Axy Prep Multisource Tota RNA Miniprep Kit、Axy Prep DNA Gel Extraction Kit和Axy Prep Plasmid Miniprep Kit，杭州AXYGEN 公司；一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；SYBR Premix?Ex TaqTMⅡ和pMD18－T，大 連TaKaRa 公 司；Light Cycler?96熒光定量PCR 儀，羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank已發(fā)表的MiGAPDH、MiIFN－α、MiIFN－β和MiIFN－γ基因的核苷酸序列（登錄號分別為：EF392835.1、EU863613.1、EF581890.1和KJ888148.1）［9］，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物（表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 淋巴細(xì)胞總RNA 提取與cDNA 制備 采集水貂新鮮血液2.5mL置于肝素抗凝管，加入等體積生理鹽水。取5mL淋巴細(xì)胞分離液加入無菌離心管中，將5mL稀釋后的血液緩慢加入分離液的液面上，低速冷凍水平離心機(jī)400r／min離心20min。用吸管小心吸取中間層淋巴細(xì)胞，加入5mL生理鹽水中，充分混勻，400r／min離心20min。棄去上清液，沉淀用5mL生理鹽水洗2次，獲得淋巴細(xì)胞。按RNA 提取試劑盒和一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明獲得cDNA，置－20℃保存。

表1 MiGAPDH、MiIFN－α、MiIFN－β和MiIFN－γ引物Table 1 The primers of MiGAPDH，MiIFN－α，MiIFN－βand MiIFN－γ

1.2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以獲得的cDNA 為模板，常規(guī)PCR 擴(kuò)增MiGAPDH、MiIFN－α、MiIFN－β和MiIFN－γ基因。反應(yīng)體系為10×ExTaq buffer 3 μL，dNTP Mixture 1.2 μL，TaKaRa ExTaq 0.6μL，上、下 游 引 物 各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 補(bǔ)足30μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃4min；95℃25s，55℃30s，72℃1min，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。15g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，凝膠回收產(chǎn)物連接于pMD18－T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)并挑取單克隆菌落于液體LB 培養(yǎng)基37℃搖振培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒經(jīng)鑒定正確后，紫外線分光光度計(jì)測定OD 值，換算成拷貝數(shù)并進(jìn)行倍比稀釋。

1.2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化 在其他條件不變的情況下，通過比較Ct值、熒光強(qiáng)度及熔解曲線是否有引物二聚體峰來確定最佳退火溫度。在優(yōu)化的退火溫度條件下，對引物濃度（5mmol／L～20mmol／L）進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以10倍梯度稀釋已知拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒，熒光定量PCR 檢測，反應(yīng)完成后，應(yīng)用Light Cycler 96 熒光定量PCR 儀自帶分析軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 熒光定量PCR 敏感性、重復(fù)性和特異性試驗(yàn) 將101拷貝／μL～107拷貝／μL 的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行熒光定量PCR 檢測，確定反應(yīng)的靈敏性。將4種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成3個(gè)濃度梯度，進(jìn)行組內(nèi)、組間重復(fù)檢測，每個(gè)稀釋度3 個(gè)重復(fù)。按1.2.2的方法進(jìn)行總RNA 的提取和cDNA 的合成，用MiGAPDH、MiIFN－α、MiIFN－β 和MiIFN－γ 的各自引物進(jìn)行熒光定量RT－PCR 檢測，并對熒光定量PCR 產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。

1.2.7 臨床樣品檢測 選取細(xì)小病毒抗體陰性水貂18只，隨機(jī)選取15只水貂，口服接種水貂腸炎病毒（濃度5×106TCID50／mL），10 mL／只。其余3只水貂作為正常對照，口服正常細(xì)胞培養(yǎng)液。在不同的攻毒時(shí)間采集水貂血液，按照1.2.2進(jìn)行RNA提取及cDNA 合成。采用建立的檢測方法，對Mi－IFN－α、MiIFN－β及MiIFN－γmRNA 相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，并對結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

由水貂外周血淋巴細(xì)胞提取的總RNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，經(jīng)PCR 擴(kuò)增，獲得MiGAPDH（254 bp）、MiIFN－α（150bp）、MiIFN－β（170bp）和MiIFN－γ（104bp）基因的目的片段（圖1），經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、搖菌、提取質(zhì)粒、酶切及測序鑒定，證實(shí)成功構(gòu)建出帶有目標(biāo)片段的重組質(zhì)粒，濃度依次為11μg／mL、3.5μg／mL、15.7μg／mL和20μg／mL，換算成拷貝數(shù)分別為3.4×1010拷貝／μL、1.12×1010拷貝／μL、5.0×1010拷貝／μL和6.54×1010拷貝／μL。用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，制備成101拷貝／μL～107拷貝／μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，OD260nm／OD280nm 介于1.80～1.90 之間。

圖1 目的片段PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of target fragments

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。退火溫度55℃，引物濃度10pmol／μL，有最低的Ct值和最高的熒光強(qiáng)度，并且無二聚體。總體系20μL：SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ10 μL，上、下 游 引 物 各0.5μL，ddH2O 7μL，模板2μL。反應(yīng)在Light Cycler 96熒光定量PCR 儀中進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30s；95℃6s，55℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)，每一次循環(huán)結(jié)束后收集熒光。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以優(yōu)化好的條件和程序?qū)|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，經(jīng)Light Cycler 96 熒光定量PCR軟件分析得到MiGAPDH、MiIFN－α、MiIFN－β 和MiIFN－γ的動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線（圖2）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2均為1.00，各點(diǎn)間的線性關(guān)系良好，擴(kuò)增效率高，標(biāo)準(zhǔn)曲線符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 敏感性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)

圖2 細(xì)胞因子檢測基因動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線Fig.2 Dynamics curve of MiGAPDH，MiIFN－α，MiIFN－βand MiIFN－γmRNA detection

2.4.1 敏感性試驗(yàn) 結(jié)果表明，MiGAPDH、Mi IFN－α、MiIFN－β和MiIFN－γ 的重組質(zhì)?？截悢?shù)濃度在101～107拷貝／μL范圍內(nèi)擴(kuò)增效果良好，最小檢出下限為10 拷貝重組質(zhì)粒／μL，陰性對照組（NTC）無信號。

2.4.2 特異性試驗(yàn) 熔解曲線分析表明（圖4），MiGAPDH、MiIFN－α、MiIFN－β和MiIFN－γ的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品只出現(xiàn)特異性單峰，無非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的峰值出現(xiàn)，陰性對照組（NTC）沒有雜峰，表明所建立的方法具有較好的特異性。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 從MiGAPDH、MiIFN－α、Mi－IFN－β和MiIFN－γ質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中分別選取3個(gè)濃度梯度進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，變異系數(shù)（CV）均小于4.5%，表明該方法具有較好的重復(fù)性（表2）。

圖3 MiGAPDH，MiIFN－α，MiIFN－β和MiIFN－γ實(shí)時(shí)熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Real－time PCR standard curves of MiGAPDH，MiIFN－α，MiIFN－βand MiIFN－γ

圖4 MiGAPDH，MiIFN－α，MiIFN－β和MiIFN－γ實(shí)時(shí)熒光定量PCR 熔解曲線Fig.4 Real－time PCR melting curves of MiGAPDH，MiIFN－α，MiIFN－βand MiIFN－γ

2.5 臨床樣品檢測

采集水貂感染腸炎病毒后不同時(shí)間點(diǎn)的血液樣品，檢測水貂感染腸炎病毒后不同時(shí)間外周血淋巴細(xì)胞 中MiIFN－α、MiIFN－β 及MiIFN－γ 的mRNA水平（圖5）。結(jié)果表明，MiIFN－α、MiIFN－β和Mi－IFN－γmRNA 水平均在感染6d 達(dá)到最高峰值，MiIFN－α的量要比MiIFN－β和MiIFN－γ高兩個(gè)數(shù)量級，并且在感染期（4d～6d）MiIFN－αmRNA 水平明顯提高，MiIFN－α mRNA 量在2d 為1.73×102拷貝／μL，在6d 時(shí)MiIFN－α 相對表達(dá)量高達(dá)2.38×103拷貝／μL。

3 討論

干擾素（IFN）是由受到病毒或其他干擾素誘生劑刺激巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及體細(xì)胞等而產(chǎn)生的一種具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)活性等多方面的生物學(xué)功能的糖蛋白［10－11］?？蒲腥藛T從作用機(jī)理、功能結(jié)構(gòu)和醫(yī)療作用等方面對干擾素展開了長期深入的研究［12］。隨著人用干擾素制劑的廣泛使用，獸用干擾素的相關(guān)研究也逐漸開展。謝麗君等［13］研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）體外感染豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）對其產(chǎn)生Ⅰ型干擾素mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果PRRSV 可導(dǎo)致PAMs產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素mRNA 轉(zhuǎn)錄水平降低，從而使宿主細(xì)胞及機(jī)體非特異性免疫功能受到抑制。Zhang H 等［14］研究證實(shí)，MiIFN－α抑制水泡性口炎病毒在WISH 細(xì)胞上的生長，并且MiIFN－α2可抑制犬瘟熱病毒在Vero細(xì)胞上的生長。因此，對干擾素相對表達(dá)量的檢測，可間接的對動(dòng)物感染病毒性疾病的狀態(tài)和機(jī)體的免疫活性做出初步評價(jià)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR重復(fù)性試驗(yàn)Table 2 Inter－assay and intra－assay reproducibilities of the real－time RT－PCR

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)MiIFN－α、MiIFN－β和MiIFN－γmRNA 的動(dòng)態(tài)表達(dá)Fig.5 Dynamic expression of MiIFN－α，MiIFN－βand MiIFN－γat different times

本研究以GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 檢測MiIFN－α、Mi－IFN－β和MiIFN－γ 基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，建立了檢測水貂MiIFN－α、MiIFN－β和MiIFN－γmRNA實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR 檢測方法。結(jié)果4 種基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均在0.995～1.000之間，擴(kuò)增效率較高，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系；由熔解曲線可以看出，無非特異性產(chǎn)物和引物二聚體出現(xiàn)，表明所用的擴(kuò)增4個(gè)基因的引物具有較好的特異性；擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)較好的S 型，檢出下限為10 拷貝重組質(zhì)粒／μL，敏感性良好；組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗(yàn)顯示變異系數(shù)均小于4.5%，具有較好的重復(fù)性。應(yīng)用本研究建立的檢測方法，對水貂感染腸炎病毒后不同時(shí)間外周血淋巴細(xì)胞中IFN 的相對變化進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，病毒感染后6d3種IFN 的mRNA水平均達(dá)到最高峰值，而感染后4d到6d正是水貂腸炎病毒在水貂體內(nèi)表達(dá)量達(dá)到峰值的時(shí)段［15］，表明IFN mRNA 水平的改變與病毒感染有著密切的關(guān)系，體現(xiàn)出IFN 直接或間接的對病毒感染的抑制作用［16］。經(jīng)過檢測MiIFN－α相對表達(dá)量較MiIFNβ和MiIFN－γ高兩個(gè)數(shù)量級，且在病毒感染期（4d～6d）MiIFN－α相對表達(dá)量明顯提高，MiIFN－β和MiIFN－γ在病毒感染初期（2d）及感染期（4d～6d）均有兩個(gè)峰值，綜上說明MiIFN 與機(jī)體抗病毒感染過程有一定的相關(guān)性。

本研究建立的水貂MiIFN－α、MiIFN－β和Mi－IFN－γ3種細(xì)胞因子實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測方法，可以對IFN 在水貂機(jī)體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化水平進(jìn)行初步評價(jià)，也可以為了解水貂病毒性疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸情況及其機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)動(dòng)態(tài)規(guī)律提供支持，為水貂IFN mRNA 的定量分析提供了有效工具。

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