鹿舍環(huán)境氣載內(nèi)毒素與革蘭陰性菌檢測

孟 凱，孫文靜，柴同杰，劉建柱＊，馬澤芳

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安271018；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109）

細(xì)菌的內(nèi)毒素（endotoxin）是來自于革蘭陰性細(xì)菌外膜上的脂多糖蛋白復(fù)合物（lipopolysaccharide－protein complex，LPS），在特定的環(huán)境中內(nèi)毒素能夠引起機(jī)體產(chǎn)生支氣管炎癥、發(fā)熱及肺功能的下降［1－3］。許多研究已經(jīng)證明，細(xì)菌內(nèi)毒素可以引起畜禽呼吸道疾病的發(fā)病率上升，繼而引發(fā)畜禽的支氣管炎、肺炎、肺功能下降等［4－5］，如果長時(shí)間的暴露在高濃度的內(nèi)毒素環(huán)境中，其工作人員患呼吸道及肺部疾病的概率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通人群的患病率［6］。環(huán)境中的內(nèi)毒素可以與塵埃等微粒結(jié)合，在空氣中懸浮很長時(shí)間，并有增加積聚的可能性，可對動(dòng)物機(jī)體和工作人員產(chǎn)生許多危害，如白細(xì)胞減少癥、Shwartzman反應(yīng)和休克等［7］，這些都說明了檢測動(dòng)物舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素的必要性和重要性。在細(xì)菌氣溶膠中，雖然革蘭陰性菌僅僅占了很小的比例，但大多數(shù)的革蘭陰性菌為致病菌和條件致病菌。檢測畜禽舍中氣載革蘭陰性菌濃度和組分對于評估動(dòng)物舍環(huán)境質(zhì)量具有重要意義。

近年來，國內(nèi)外的學(xué)者已經(jīng)對豬舍、牛舍、犢牛舍、兔舍舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素和革蘭陰性菌的含量進(jìn)行了檢測與研究［8－9］，而對特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物舍內(nèi)微生物氣溶膠的檢測還非常少，特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的養(yǎng)殖環(huán)境問題應(yīng)當(dāng)更加受到重視。因?yàn)樘胤N經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)具有高投入、高產(chǎn)出和高風(fēng)險(xiǎn)的特點(diǎn)，一旦暴發(fā)傳染病，其損失要比一般的畜禽養(yǎng)殖戶大得多，所以對其環(huán)境中微生物氣溶膠的含量和組成成分的分析顯得非常重要。本試驗(yàn)通過對5個(gè)特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物鹿舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素、氣載革蘭陰性菌和需氧菌濃度的檢測來客觀評估其對鹿舍環(huán)境的污染及對飼養(yǎng)員和動(dòng)物體健康的危害，從而對鹿舍的環(huán)境狀況作出客觀評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 A 鹿場位于山東省泰安市郊，遠(yuǎn)離公路，飼養(yǎng)方式為半封閉圈養(yǎng)，主要養(yǎng)殖梅花鹿?？偣诧曫B(yǎng)120頭，鹿舍規(guī)格為200m×20m×3.5m。自然通風(fēng)，每天清糞1次。采樣時(shí)基本的氣象條件為：溫度25℃，濕度65%，風(fēng)速1.5m／s。采樣時(shí)間為2015年5月5日。

B鹿場位于山東省濟(jì)寧市郊，遠(yuǎn)離公路，周圍無居民區(qū)，無噪音源，飼養(yǎng)方式為半封閉圈養(yǎng)，主要養(yǎng)殖梅花鹿，總共飼養(yǎng)95 頭，鹿舍規(guī)格為180 m×15m×3.5 m。自然通風(fēng)，每天清糞一次。采樣時(shí)基本的氣象條件為：溫度26℃，濕度62%，風(fēng)速0.8 m／s。采樣時(shí)間為2015年5月12日。

C鹿場位于山東省濰坊市郊，遠(yuǎn)離村莊，無噪音源，飼養(yǎng)方式為半封閉圈養(yǎng)，共養(yǎng)殖梅花鹿110頭，鹿舍規(guī)格為200m×20m×3m。采用自然通風(fēng)方式，每天清糞一次。采樣時(shí)基本的氣象條件為：溫度23℃，濕度58%，風(fēng)速1.2 m／s。采樣時(shí)間為2015年5月18日。

D 鹿場位于山東省東營市郊，飼養(yǎng)方式為半封閉圈養(yǎng)，以養(yǎng)殖梅花鹿為主，共135頭，鹿舍規(guī)格為220m×25 m×3.5 m。自然通風(fēng)，每天清糞一次。采樣時(shí)基本的氣象條件為：溫度235℃，濕度63%，風(fēng)速2.3m／s。采樣時(shí)間為2015年5月25日。

E鹿場位于山東省聊城市郊，遠(yuǎn)離村莊，飼養(yǎng)方式為半封閉圈養(yǎng)，共養(yǎng)殖梅花鹿86頭，鹿舍規(guī)格為180m×15m×3m。自然通風(fēng)，每天清糞一次。采樣時(shí)基本氣象條件為：溫度28℃，濕度55%，風(fēng)速1.5m／s。采樣時(shí)間為2015年6月12日。

1.1.2 主要試劑和儀器 無熱源內(nèi)毒素檢查用水，無熱源的鹽酸和氫氧化鈉溶液，細(xì)菌內(nèi)毒素檢測無熱源槍頭均購自湛江博康海洋生物有限公司；LAL試劑（QLC－100Bio Whittaker，Walkersile，MD），國際標(biāo)準(zhǔn)的AGI－30 空氣微生物收集器（All Glass Impinger，AGI－30），Andersen－6級撞擊式空氣微生物采樣器，DH4000型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司；無菌超凈工作臺（AIR TECH），蘇凈集團(tuán)安泰公司制造；微量移液器（GILSON），F(xiàn)rance公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH－6），國華電器制造廠；全自動(dòng)高壓蒸汽消毒鍋，酶標(biāo)儀（TECAN），Austria公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 鹿舍環(huán)境空氣內(nèi)毒素的檢測 鹿舍內(nèi)空氣中內(nèi)毒素的含量通過國際標(biāo)準(zhǔn)的AGI－30液體沖擊式收集器和LAL 試劑測得。將AGI－30 空氣微生物收集器放在鹿舍中，每隔10 m 放置一個(gè)AGI－30空氣微生物收集器，放置高度為80cm，采樣介質(zhì)為50 mL 內(nèi)毒素檢查用水（湛江博康海洋生物制品廠），采樣時(shí)氣流速度為12.5L／min，采樣時(shí)間為30 min，每個(gè)鹿舍同時(shí)收集6個(gè)空氣樣品，樣品收集在正常的工作時(shí)間進(jìn)行，盡量不影響鹿群的正常生理活動(dòng)。將采集到的氣載內(nèi)毒素樣本立刻放在0℃～4℃的冰盒內(nèi)保存，返回實(shí)驗(yàn)室后立即放在4℃的冰箱中保存。首先利用無熱源的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)樣本的pH 至7～8之間。最后，根據(jù)采樣時(shí)間和氣流速度得出鹿舍環(huán)境氣載內(nèi)毒素的含量（EU／m3）。鹿舍內(nèi)每m3空氣中內(nèi)毒素的計(jì)算公式為：

每m3空氣中氣載內(nèi)毒素的含量＝（樣本中內(nèi)毒素的濃度×采樣介質(zhì)體積）／（AGI－30氣流速度×采樣時(shí)間）

1.2.2 鹿舍環(huán)境氣載革蘭陰性菌的檢測 利用Andersen－6級收集器收集氣載革蘭陰性菌，采樣介質(zhì)為5%的綿羊血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，將收集器置于鹿舍內(nèi)，每次采集6 個(gè)空氣樣品，每個(gè)收集器間隔10m，收集器放置高度為80cm，采樣時(shí)氣流速度為28.3L／min，驅(qū)動(dòng)時(shí)間根據(jù)鹿舍內(nèi)空氣質(zhì)量情況設(shè)置為5min～10min，保證6節(jié)平皿上都能采到菌，菌落數(shù)以30個(gè)～300個(gè)為宜。各點(diǎn)采樣同時(shí)進(jìn)行。采樣結(jié)束后將培養(yǎng)皿置于恒溫箱中37℃需氧培養(yǎng)24h～48h，記錄各血瓊脂平板上的需氧菌數(shù)。經(jīng)Andersen校正表校正后，得到氣載需氧菌含量（CFU／m3）。然后對氣載需氧菌進(jìn)行革蘭染色和鏡檢，純分離培養(yǎng)后，進(jìn)行API－20E（Bio Merieux，Marcy－I’Etoile，F(xiàn)rance）試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，確定其含量（CFU／m3）。

1.2.3 鹿舍環(huán)境中氣載真菌的檢測 鹿舍內(nèi)氣載真菌的濃度通過Andersen－6 級空氣微生物收集器進(jìn)行檢測，將收集器置于鹿舍中央，放置高度為80 cm，樣品采集時(shí)的空氣流速為28.3L／min，采樣介質(zhì)為沙保弱培養(yǎng)基，收集器的驅(qū)動(dòng)時(shí)間為3 min～5min。采樣結(jié)束后25℃條件下培養(yǎng)5d～7d進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每個(gè)平板上的菌落數(shù)以30個(gè)～300個(gè)為宜。最后，按照Andersen校正表校正后，獲得鹿舍內(nèi)氣載真菌的濃度（CFU／m3）。

1.2.4 鹿舍內(nèi)糞便和飼料樣品的處理 在5個(gè)鹿舍內(nèi)分別采集糞便和飼料樣本，在鹿舍內(nèi)的不同地方采集6個(gè)糞便樣本和6個(gè)飼料樣本，將采集到的糞便和飼料樣本立即放在0℃～4℃保溫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室。首先用無熱源的檢查用水分別將糞便和飼料樣本進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，之后通過LAL 試驗(yàn)測定糞便和飼料中內(nèi)毒素的含量；同時(shí)將一部分的糞便和飼料樣本定量涂于5%綿羊血培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋梯度涂3個(gè)平板，根據(jù)以上方法確定糞便和飼料樣本中革蘭陰性菌的含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 鹿場舍內(nèi)環(huán)境氣載內(nèi)毒素、細(xì)菌濃度和真菌濃度采用了中間值表示，用最大值與最小值反映數(shù)值的波動(dòng)范圍，減少數(shù)據(jù)的誤差。

2 結(jié)果

2.1 鹿場環(huán)境舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素的濃度

5個(gè)鹿場舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素的濃度介于0.085×103EU／m3～1.380×103EU／m3之間。5個(gè)鹿場舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素的濃度均未超出能引起肺炎的標(biāo)準(zhǔn)（2 000EU／m3），但都部分超出了對人體無影響的標(biāo)準(zhǔn)（100EU／m3）［10］。雖然目前還沒有針對特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物鹿舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)范圍，但是也不能忽視其對舍內(nèi)環(huán)境的影響（表1）。

表1 鹿舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素濃度Table 1 Concentrations of airborne endotoxin in deer houses

2.2 鹿場環(huán)境舍內(nèi)氣載需氧菌、氣載革蘭陰性菌和氣載真菌的濃度

5 個(gè)鹿場舍內(nèi)的氣載需氧菌濃度介于0.45×104CFU／m3～5.24×104CFU／m3之間；氣載革蘭陰性菌的濃度介于0.01×103CFU／m3～1.58×103CFU／m3之間；氣載真菌濃度在0.12×103CFU／m3～2.08×103CFU／m3之間（表2）。其中，氣載內(nèi)毒素的濃度與氣載需氧菌的濃度存在弱的正相關(guān)（r＝0.26），氣載內(nèi)毒素的濃度依賴于氣載需氧菌的濃度通過下列回歸方程表示：y＝0.0062x＋399.99（y：氣載內(nèi)毒素濃度lgEU／m3；x：氣載需氧菌濃度lgCFU／m3）。氣載內(nèi)毒素的濃度與氣載革蘭陰性菌的濃度也存在弱的正相關(guān)（r＝0.22），氣載內(nèi)毒素的濃度依賴于氣載革蘭陰性菌的濃度通過下列回歸方程表示：y＝－0.2297x＋785.43（y：氣載內(nèi)毒素濃度lgEU／m3；x：氣載革蘭陰性菌濃度lgCFU／m3）。因此，不能通過氣載需氧菌和氣載革蘭陰性菌總數(shù)來估計(jì)氣載內(nèi)毒素的含量。

2.3 鹿場舍內(nèi)糞便和飼料中革蘭陰性菌濃度和內(nèi)毒素濃度

5 個(gè)鹿場舍內(nèi)糞便中革蘭陰性菌的濃度為0.87×106CFU／g～7.85×106CFU／g；糞便中內(nèi)毒素的濃度為0.52×105EU／g～6.48×105EU／g；飼料中革蘭陰性菌的濃度為0.27×105CFU／g～3.60×105CFU／g；飼料中內(nèi)毒素的濃度為1.58×103EU／g～6.25×103EU／g（表3和表4）。

2.4 鹿場舍內(nèi)氣載需氧菌在Andersen－6級空氣微生物采樣器各層上的分布比例

5個(gè)鹿場舍內(nèi)氣載需氧菌在Andersen－6級空氣微生物采樣器6個(gè)層級上的分布情況為：1（＞7μm）層占20%；2（4.7μm～7μm）層占18%；3（3.3μm～4.7μm）層占26%；4（2.1μm～3.3μm）層占16%；5（1.1μm～2.1μm）層占12%；6（0.6μm～1.1μm）層僅占8%。

表2 鹿舍內(nèi)氣載需氧菌、氣載革蘭陰性菌和氣載真菌濃度Table 2 Concentrations of airborne aerobic bacteria，airborne Gram－negative bacteria and aerobic fungi in deer houses

表3 鹿場舍內(nèi)糞便中革蘭陰性菌和內(nèi)毒素濃度Table 3 Concentrations of the Gram－negative bacteria and endotoxin of faeces in deer houses

表4 鹿場舍內(nèi)飼料中革蘭陰性菌濃度和內(nèi)毒素濃度Table 4 Concentrations of the Gram－negative bacteria and endotoxin of feed in deer houses

2.5 鹿場舍內(nèi)氣載革蘭陰性菌在Andersen－6級空氣微生物采樣器各層上的分布比例

5 個(gè)鹿場舍內(nèi)氣載革蘭陰性菌在Andersen－6級空氣微生物采樣器6 個(gè)層級上的分布情況為：1（＞7μm）層占21%，2（4.7μm～7μm）層占16%，3（3.3μm～4.7μm）層占28%，4（2.1μm～3.3μm）層占20%，只有15%的革蘭陰性菌分布在5（1.1μm～2.1μm）、6（0.6μm～1.1μm）層上。

3 討論

本試驗(yàn)采用國際標(biāo)準(zhǔn)的Andersen－6級撞擊式空氣微生物采樣器和AGI－30液體沖擊式空氣微生物采樣器對山東省境內(nèi)不同地區(qū)的5處鹿場舍內(nèi)空氣微生物及內(nèi)毒素進(jìn)行檢測。本實(shí)驗(yàn)中，鹿舍中的氣載內(nèi)毒素含量介于0.085×103EU／m3～1.380×103EU／m3之間，雖然其含量都沒有超過引起人的肺炎的標(biāo)準(zhǔn)（2 000EU／m3），但測得的氣載內(nèi)毒素含量已經(jīng)超過了人類的推薦標(biāo)準(zhǔn)（2EU／m3），且部分濃度超出了人的無影響水平（100EU／m3）。值得注意的是，我們是在正常的工作時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的內(nèi)毒素的檢測，如果是在處理鹿舍內(nèi)糞便垃圾或鹿群出欄時(shí)，空氣中的氣載內(nèi)毒素含量可能會(huì)更高。因此，長時(shí)間暴露在這樣的環(huán)境下，會(huì)對飼養(yǎng)人員和鹿會(huì)造成潛在的危害。然而，舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素含量具體達(dá)到多少后會(huì)對飼養(yǎng)人員和鹿群的健康造成影響，目前還不得而知，還有待進(jìn)一步的研究。通過對鹿場舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素與需氧菌濃度和革蘭陰性菌濃度的相關(guān)性分析可知，兩者之間沒有必然的相關(guān)性，其r值分別為0.26和0.22。究其原因可能有以下幾點(diǎn)：一是內(nèi)毒素在空氣中可以附著在塵埃等微粒上懸浮于空中數(shù)月，其含量不斷的積聚；二是氣載革蘭陰性菌存活的時(shí)間很短，其活性會(huì)在采樣時(shí)部分喪失；三是通過本試驗(yàn)可知，鹿場舍內(nèi)的糞便和飼料中內(nèi)毒素的含量都非常高，糞便和飼料中的內(nèi)毒素很可能是氣載內(nèi)毒素的重要來源。因此，對鹿場舍內(nèi)氣載內(nèi)毒素水平的評估不能僅僅通過測量細(xì)菌氣溶膠的濃度來得出，而應(yīng)多方面結(jié)合起來進(jìn)行檢測。

國際標(biāo)準(zhǔn)的Andersen－6級撞擊式空氣微生物收集器可以采集到的粒徑范圍在0.6μm～20μm，能夠統(tǒng)計(jì)各種直徑粒子的數(shù)量，并估計(jì)粒子向外傳播的距離和進(jìn)入呼吸道的深度，間接地推斷其對人及動(dòng)物體能夠造成的危害程度。3層和4層所能采集到的粒徑范圍在2.1μm～4.7μm 之間，這些顆粒能夠進(jìn)入人和畜禽的支氣管，甚至能夠到達(dá)細(xì)支氣管［11］。本試驗(yàn)中，有42%的氣載需氧菌分布在3層和4層上；有48%的氣載革蘭陰性菌分布在3層和4層上。雖然它們的濃度不高，但在一定程度上也增加了飼養(yǎng)人員和動(dòng)物患呼吸道疾病的可能性的增加，一旦飼養(yǎng)人員和動(dòng)物的免疫力低下的時(shí)候，很容易引起疾病。5層和6層所能采集到的粒徑范圍在0.6μm～2.1μm 之間，雖然分布在這兩層級上的粒子占很小的一部分（本實(shí)驗(yàn)中，有20%的氣載需氧菌分布在5層和6層上；有15%的氣載革蘭陰性菌分布在5層和6層），但是這些粒子的空氣動(dòng)力學(xué)直徑很小，它們能夠進(jìn)入飼養(yǎng)人員和動(dòng)物的肺的更深部位，甚至能夠到達(dá)肺泡，對飼養(yǎng)人員及動(dòng)物的健康形成很大的威脅。

本試驗(yàn)中，鹿舍內(nèi)糞便中革蘭陰性菌的濃度介于0.87×106CFU／g～7.85×106CFU／g之間，內(nèi)毒素的含量介于0.52×105EU／g～6.48×105EU／g之間；飼料中革蘭陰性菌的濃度為0.27×105CFU／g～3.60×105CFU／g；飼料中內(nèi)毒素的濃度為1.58×103EU／g～6.25×103EU／g。革蘭陰性菌和內(nèi)毒素的含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)的高于空氣中兩者的含量，對飼養(yǎng)人員和動(dòng)物的健康存在很大的威脅。因此，在鹿場日常的飼養(yǎng)管理中，飼養(yǎng)人員應(yīng)該及時(shí)的清理鹿舍內(nèi)的糞便和剩余的飼料。

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