炔雌醚對(duì)小鼠附睪與副性腺肥大細(xì)胞數(shù)量和分布的影響

李 健，陳耀星，陳福寧，王子旭，曹 靜，董玉蘭，陳樹林

（1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽471003；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193；3.北京昌平區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京102208；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

肥大細(xì)胞（mast cells，MC）來源于造血干細(xì)胞，廣泛分布于結(jié)締組織、黏膜組織及血管周圍，是一類廣泛分布于全身組織和器官的非特異性免疫細(xì)胞，易接觸病原體和變應(yīng)原等物質(zhì)從而參與過敏反應(yīng)的病理過程［1－4］。自1878年發(fā)現(xiàn)MC以來，人們對(duì)MC在疾病中的作用進(jìn)行了廣泛而深入的研究。MC脫顆粒是機(jī)體的一種防御反應(yīng)，也是速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（I型超敏反應(yīng)）和炎癥等病理反應(yīng)的基礎(chǔ)。肥大細(xì)胞胞質(zhì)顆粒內(nèi)含有多種生物活性物質(zhì)，如組織胺、5－羥色胺、蛋白多糖、中性蛋白酶、白三烯、前列腺素、血小板活化因子及多種白細(xì)胞介素（IL）等。肥大細(xì)胞受刺激時(shí)，以胞吐方式大量釋放顆粒內(nèi)的物質(zhì)（常稱為脫顆粒）［5－7］。肥大細(xì)胞通過脫顆粒釋放胞漿中生物胺、蛋白多糖及中性蛋白酶等生物活性物質(zhì)，參與多種抗病過程，如抗腫瘤發(fā)生、抗寄生蟲感染等。MC在慢性炎癥和纖 維化的發(fā)病機(jī)制中起重要作用［8－9］。肥大細(xì)胞存在于健康動(dòng)物的睪丸中，在不育動(dòng)物睪丸中數(shù)量增加，如在睪丸萎縮、精索靜脈曲張?jiān)斐傻那?xì)精管硬化和纖維化疾病動(dòng)物［10］。在生精異常的動(dòng)物睪丸間質(zhì)和曲細(xì)精管管周肥大細(xì)胞數(shù)量顯著增加［11］。研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞可通過釋放物如前列腺素、干擾素及腫瘤壞死因子等影響精子發(fā)生過程，降低精液品質(zhì)及生育能力［12－13］。睪丸中有MC的分布，并在睪丸生精過程中發(fā)揮著重要的作用，隨著睪丸內(nèi)環(huán)境改變，MC數(shù)量和分布均發(fā)生改變［14－15］。本研究將探討炔雌醚對(duì)成年小鼠附睪與副性腺M(fèi)C的形態(tài)、數(shù)量、分布的影響，旨在揭示MC在雌激素樣環(huán)境內(nèi)分泌干擾誘發(fā)生精異常過程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性小鼠18只，平均體重30g±2g，自由采食、飲水，在每天14h光照，10h黑暗的條件下進(jìn)行飼喂。

1.1.2 改良的TB染液 8g／L甲苯胺藍(lán)，6g／L高錳酸鉀，蒸餾水煮沸配制而成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理 經(jīng)7d適應(yīng)后，炔雌醚處理。隨機(jī)分為3組（每組6只），分別皮下注射50μL 含0、0.1、1mg／kg炔雌醚的橄欖油，每天1次，連續(xù)2周。動(dòng)物處理過程中，每天稱重；處理結(jié)束后，將小鼠麻醉，稱重。取雙側(cè)附睪、精囊腺及前列腺，多聚甲醛固定，制作石蠟切片。

1.2.2 肥大細(xì)胞染色 附睪、精囊腺及前列腺切片常規(guī)脫蠟至蒸餾水后，入改良的TB染液（8g／L甲苯胺藍(lán)，6g／L高錳酸鉀，蒸餾水煮沸配制）中浸染約5 min，蒸餾水洗2次后，用5mL／L鹽酸酒精分色（顯微鏡下控制），1 000mL／L酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，分別計(jì)數(shù)對(duì)照組與試驗(yàn)組附睪被膜和間質(zhì)中肥大細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 以上數(shù)據(jù)用SPSS12軟件包進(jìn)行單因素方差分析（One Way ANOVA），數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差±SD）表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)附睪肥大細(xì)胞數(shù)量和分布的影響

經(jīng)炔雌醚處理后，成年雄性小鼠附睪的肥大細(xì)胞數(shù)量有增多趨勢(shì)，但在不同的部位其增長(zhǎng)幅度有所區(qū)別（圖1）。在附睪頭被膜，對(duì)照組每1mm2視野中肥大細(xì)胞數(shù)為40.32個(gè)，在0.1mg／kg、1mg／kg試驗(yàn)組分別增加到47.25個(gè)／mm2和59.38個(gè)／mm2，差異極顯著（P＜0.01）；在附睪頭間質(zhì)，即附睪頭附睪管管周，對(duì)照組肥大細(xì)胞數(shù)為36.25個(gè)，在0.1mg／kg和1mg／kg試驗(yàn)組分別增加到41.65個(gè)／mm2和49.45個(gè)／mm2，差異極顯著（P＜0.01）；而在附睪尾被膜，對(duì)照組肥大細(xì)胞數(shù)為42.42 個(gè)／mm2，在0.1 mg／kg、1mg／kg試驗(yàn)組分別增加到51.82個(gè)／mm2（P＜0.05）和57.47個(gè)／mm2（P＜0.01）；在附睪尾間質(zhì)，即附睪尾附睪管管周，對(duì)照組肥大細(xì)胞數(shù)為37.58個(gè)／mm2，在0.1mg／kg、1mg／kg試驗(yàn)組分別增加到44.43個(gè)／mm2（P＜0.05）和56.46個(gè)／mm2（P＜0.01）。

2.2 對(duì)精囊腺及前列腺肥大細(xì)胞數(shù)量和分布的影響

在精囊腺被膜，對(duì)照組每1mm2視野中肥大細(xì)胞數(shù)為45.55 個(gè)，0.1 mg／kg 劑 量 組 肥 大 細(xì) 胞 數(shù) 量（57.38個(gè)／mm2）變化不明顯，在1mg／kg試驗(yàn)組分別增加到62.35個(gè)／mm2，差異極顯著（P＜0.01）；在精囊腺間質(zhì)，對(duì)照組肥大細(xì)胞數(shù)為44.60個(gè)／mm2，0.1 mg／kg肥 大 細(xì) 胞 數(shù) 量 無 明 顯 變 化，1 mg／kg 組 每1mm2分別增加到61.38個(gè)，差異極顯著（P＜0.01）。而在前列腺被膜，對(duì)照組肥大細(xì)胞數(shù)為52.73 個(gè)／mm2，在0.1 mg／kg、1 mg／kg試驗(yàn)組分別為56.52個(gè)／mm2（P＞0.05）、64.75個(gè)／mm2（P＜0.05）；在前列腺間質(zhì)，對(duì)照組肥大細(xì)胞數(shù)為53.55個(gè)／mm2，1mg／kg組每1mm2分別增加到82.47個(gè)，差異極顯著（P＜0.01），0.1 mg／kg組無明顯變化（圖2 和表2）。同時(shí)，炔雌醚高劑量組的精囊腺及前列腺管壁間間隙明顯增大，結(jié)締組織顯著增生。

圖1 不同劑量炔雌醚處理后成年小鼠附睪肥大細(xì)胞數(shù)量和分布的變化Fig.1 Changes of number and distribution of mast cells in epididymidis after treatment with quinestrol

圖2 不同劑量炔雌醚處理后成年小鼠精囊腺、前列腺肥大細(xì)胞數(shù)量和分布的變化Fig.2 Changes of number and distribution of mast cells in seminal vesicle and prostate after treatment with quinestrol

表1 不同劑量炔雌醚對(duì)小鼠附睪肥大細(xì)胞數(shù)量的影響（細(xì)胞／mm2）Table 1 Effects of quinestrol on number of mast cells in epididymis in adult male mice

表2 不同劑量炔雌醚對(duì)小鼠精囊腺與前列腺肥大細(xì)胞數(shù)量的影響（細(xì)胞／mm2）Table 2 Effects of quinestrol on number of mast cells in seminal vesicle and prostate

3 討論

近50年來世界男性的精液品質(zhì)急劇下降，隱睪、睪丸腫瘤、尿道下裂、前列腺癌等生殖道疾病發(fā)生率快速增加［15－16］。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物及植物不育劑對(duì)雄性生殖功能損傷的研究大多集中在睪丸精子發(fā)生和精液品質(zhì)等環(huán)節(jié)［17－18］。肥大細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞，也是結(jié)締組織的基本細(xì)胞成分，廣泛地分布于全身各部。胞質(zhì)顆粒內(nèi)含有多種生物活性物質(zhì)，如組織胺、白三烯、前列腺素、血小板活化因子及多種白細(xì)胞介素（IL）等。肥大細(xì)胞受刺激時(shí)，以胞吐方式大量釋放顆粒內(nèi)的物質(zhì)（常稱為脫顆粒），在人類及動(dòng)物的健康與疾病過程中發(fā)揮重要的作用。肥大細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)（如類花生酸類物質(zhì)、蛋白多糖、蛋白酶）和趨化因子能促進(jìn)細(xì)胞凋亡［19］。生物化學(xué)研究表明肥大細(xì)胞的成分，如胰蛋白酶、前列腺素及干擾素等能抑制精子發(fā)生過程。此外，肥大細(xì)胞含有組織胺、血清素等，后者還能調(diào)節(jié)維持正常生精過程的重要激素－睪酮的合成［20］。本研究結(jié)果表明，炔雌醚處理后成年小鼠附睪、精囊腺、前列腺肥大細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并伴有精囊腺、前列腺腺體管壁間明顯的結(jié)締組織增生。石嵩山等發(fā)現(xiàn)新生鼠雌激素注射后曲精小管有明顯萎縮，而且睪丸肥大細(xì)胞數(shù)量也顯著增多［14］。Meineke V 等［21］研究 認(rèn) 為，生 育 功 能 障 礙 者肥大細(xì)胞含有纖維蛋白溶酶，肥大細(xì)胞數(shù)量增多、分布改變，而且，肥大細(xì)胞能誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)增生。本研究發(fā)現(xiàn)炔雌醚處理后誘導(dǎo)成年小鼠附睪、精囊腺、前列腺也出現(xiàn)相似的形態(tài)變化，肥大細(xì)胞數(shù)量增多，常伴行于附睪管間質(zhì)、被膜附近，說明肥大細(xì)胞不但對(duì)睪丸中生精細(xì)胞的發(fā)育有影響，可能對(duì)附睪中生精細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)育成熟也有影響。因此，肥大細(xì)胞可能參與了炔雌醚影響正常生精功能的過程，它在附睪、精囊腺、前列腺中的數(shù)量和分布的改變表明其參與了附睪中精子進(jìn)一步成熟的調(diào)節(jié)，是炔雌醚誘發(fā)成年小鼠生精異常和附睪精子數(shù)量減少的原因之一。

［1］ Franceschini B，Ceva－Grimaldi G，Russo C，et al.The complex functions of mast cells in chronic human liver diseases［J］.Digest Dis，2006，51：2248－2256.

［2］ 莊 玉，呼格吉樂圖，趙風(fēng)華.肥大細(xì)胞研究概述［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（9）：109－112.

［3］ 張紅梅.TGA 對(duì)蟾蜍免疫器官指數(shù)及肥大細(xì)胞數(shù)量的影響［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（9）：37－40.

［4］ 姚紅艷，李秀富，李詩舉，等.小鼠空腸肥大細(xì)胞組織化學(xué)及超微結(jié)構(gòu)研究［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（1）：41－43.

［5］ 劉彥威，劉 娜，劉利強(qiáng)，等.熱應(yīng)激對(duì)雞小腸肥大細(xì)胞和組胺的影響［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（4）：129－132.

［6］ 姚紅艷，李秀富，李詩舉，等.小鼠空腸肥大細(xì)胞組織化學(xué)及超微結(jié)構(gòu)研究［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（1）：41－43.

［7］ 汪仁莉，張珠明.犬皮膚肥大細(xì)胞瘤的組織病理學(xué)診斷［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（2）：216－218.

［8］ Yakanaka K，F(xiàn)ujisawa M，Tanaka H，et al.Significance of human testicular mast cells and their subtypes in male infertility［J］.Human Reprod，2000，15：1543－1547.

［9］ Kim H H，Park S B，Lee S，et al.Inhibitory effect of putranjivain A on allergic inflammation through suppression of mast cell activation［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2014，274（3）：455－461.

［10］ Welter H，Kohn F M，Mayerhofer A.Mast cells in human testicular biopsies from patients with mixed atrophy：increased numbers，heterogeneity，and expression of cyclooxygenase 2and prostaglandin D2synthase［J］.Fertil Steril，2011，96：309－313.

［11］ Apa D D，Cayan S，Polat A，et al.Mast cells and fibrosis on testicular biopsies in male infertility［J］.Arch Androl，2002，48：337－344.

［12］ Meineke V，F(xiàn)rungieri M B，Jessberger B，et al.Human testicular mast cells contain tryptase：increased mast cell number and altered distribution in the testesof infertile men［J］.Fertil Steril，2000，74：239－244.

［13］ Seveso M，Giusti G，Seveso M，et al.Mast cells as a potential prognostic marker in prostate cancer［J］.Dis Markers，2013，10：711－720.

［14］ 石嵩山，周宗瑤，王士平.新生大鼠雌激素注射后睪丸肥大細(xì)胞的變化［J］.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2000（19）：122－124.

［15］ 常 晶，胡 敏，張躍輝，等.肥大細(xì)胞及其介質(zhì)在生殖系統(tǒng)中的作用［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2015，36（7）：1442－1443.

［16］ Li J，Wang H，Zhang J，et al.Abnormal secretion of reproductive hormones and antioxidant status involved in quinestrol induced reproductive toxicity in adult male rat［J］.Tissue Cell，2014，46（1）：27－32.

［17］ Liu X Z，Nie S P，Chen Y J，et al.Effects of 4－nonylphenol isomers on cell receptors and mitogen－activated protein kinase pathway in mouse Sertoli TM4cells［J］.Toxicology，2014，326：1－8

［18］ Wang Y，Wang S C，Luo X，et al.The roles of DNA damage－dependent signals and MAPK cascades in tributyltin－induced germline apoptosis in Caenorhabditis elegans［J］.Chemosphere，2014，108：231－238.

［19］ Sokanovic S J，Janjic M M，Stojkov N J，et al.Age related changes of cAMP and MAPK signaling in Leydig cells of Wistar rats［J］.Exp Gerontol，2014，58：19－29.

［20］ Mechlin C W，Levesque J，F(xiàn)eustel P，et al.Mast cell numbers negatively correlate with fibrosis in cryptorchid testes［J］.J Pediatric Urol，2014，10：527－531.

［21］ Meineke V，F(xiàn)rungieri M B，Jessberger B，et al.Human testicular mast cells contain tryptase：increased mast cell number and altered distribution in the testesof infertile men［J］.Fertil Steril，2000，74：239－244.