苦杏仁精油對(duì)HaCaT 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

楊文化，周 瑞，李科友

（西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100）

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，以表皮細(xì)胞過度增生和分化異常為主要發(fā)病特征。全球大約2%的人患有銀屑病，其中約25%是中、重度型病癥［1－2］。研究結(jié)果表明環(huán)境、免疫和遺傳為其發(fā)病的主要因素［3］。而該病的確切發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，目前還未完全確定。因此，尋找新的治療銀屑病藥物具有重大意義。近幾十年來，植物提取物因?yàn)樵诙喾N銀屑病角質(zhì)細(xì)胞中具有抗增殖、促凋亡等作用，而逐漸作為銀屑病治療的替代藥物來研究［4］。

杏（P.armeniaca L.var.ansu Maxim.）是在歐亞大陸和美洲廣泛種植的經(jīng)濟(jì)樹木。杏仁的口味可分為甜杏仁、微苦杏仁和苦杏仁三類［5］。藥理學(xué)研究表明，苦杏仁擁有抗氧化、抗癌、抗微生物和抗炎活性［6－7］?？嘈尤誓苤委熛⒅夤苎?、肺氣腫、便秘、白癜風(fēng)及疼痛。此外，它也可以治療皮膚病，如癤、痤瘡。有關(guān)提取于杏仁種子的杏仁精油的抗菌活性有人進(jìn)行了報(bào)道［8］。但是關(guān)于BAEO 抗銀屑病的研究報(bào)道較少，本試驗(yàn)以銀屑病模式細(xì)胞HaCaT 作為體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究BAEO 對(duì)人表皮細(xì)胞的增殖以及凋亡的影響，以探討其抗銀屑病的可能機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮的苦杏仁種子于2012年6月購(gòu)買于甘肅省鎮(zhèn)原縣，并經(jīng)過西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院魏安智教授鑒定；一個(gè)標(biāo)本（條碼0150525）儲(chǔ)存在西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物標(biāo)本室；DMEM 培養(yǎng)液和胎牛血清均為Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶求購(gòu)于Sigma公司；4g／L 臺(tái)盼藍(lán)染液和SRB 試劑均購(gòu)自英國(guó)Sigma aldrich 公司；100×青霉素及鏈霉素溶液為碧云天生物公司產(chǎn)品；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和Annexin V－FITC／PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均求購(gòu)于為凱基生物；Caspase－3、PARP、β－Actin抗體為碧云天生物公司產(chǎn)品；羊抗鼠／抗兔二抗購(gòu)自于CWBIO 公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 BAEO 提取 用于本試驗(yàn)的BAEO 采用水蒸汽蒸餾法進(jìn)行提取。將苦杏仁種子粉碎，過40目篩，準(zhǔn)確稱取200g，常溫下浸泡在500 mL 的圓底燒瓶中水解4h。然后，用克萊文杰裝置進(jìn)行水蒸氣蒸餾。收集蒸餾所得的精油，經(jīng)過乙醚萃取并加入無水硫酸鈉干燥脫水，過濾后即得到BAEO。BAEO 使用時(shí)用吐溫80作為增溶劑，用DMEM 培養(yǎng)基將其稀釋到所需的濃度。

1.2.2 氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析 色譜條件：采用日本Shimadzu公司GCMS－QP2010氣相色譜－質(zhì)譜儀，色譜柱為rxi－5ms毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；采用程序升溫，50 ℃保持2min，再以10℃／min增加到280 ℃并保持5min；載氣是氦氣，流速為3mL／min；分流比為10∶1。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI，轟擊電壓為70eV，接口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍40m／z～550 m／z。BAEO 未知成分是通過與色譜儀所配置NIST08譜庫相匹配，并結(jié)合保留指數(shù)及相關(guān)文獻(xiàn)資料所獲得。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所。細(xì)胞培養(yǎng)液含有100mL／L滅活的胎牛血清和100U／mL 青霉素和鏈霉素。細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d～3d換新鮮培養(yǎng)液。到細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底約80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)。

1.2.4 SRB細(xì)胞增殖試驗(yàn) BAEO 和及其主要成分苯甲醛對(duì)HaCaT 細(xì)胞的細(xì)胞毒性采用SRB法測(cè)量。細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)，濃度為5×103細(xì)胞／孔，每孔體積200μL。待細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的BAEO 或苯甲醛，每個(gè)濃度設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，分別于24、48、72h后進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。細(xì)胞用100 μL預(yù)冷的500g／L三氯乙酸（TCA）固定，在4 ℃冰箱放1h后，用去離子水洗滌3次，自然晾干。在室溫下經(jīng)100μL 4g／L 的SRB 染液染色30 min，用10mL／L乙酸洗滌3次，自然晾干，最后用100μL的Tris－HCl緩沖液（pH 10.4）溶解。用酶標(biāo)儀于570nm 處測(cè)吸光度值（OD）。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）＝［（對(duì)照組平均OD 值－用藥組平均OD 值）／對(duì)照組平均OD 值］×100%。采用GraphPad Prism 5確定細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測(cè) 采用PI單染法檢測(cè)BAEO作用于HaCaT 細(xì)胞后細(xì)胞周期的變化。將細(xì)胞以5×105細(xì)胞／mL 的密度接種于6孔板，每孔2mL。次日，待細(xì)胞貼壁后，不同濃度的BAEO（0.1、0.25、0.5mL／L）處理HaCaT 細(xì)胞24h，然后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌，并用預(yù)冷的700mL／L 乙醇固定和放存在4 ℃過夜。上機(jī)前用預(yù)冷的PBS 洗2次，加100μL RNase A 37 ℃水浴30min，再用400 μL的PI 4 ℃避光染色30min。盡快對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。試驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用Annexin VFITC和PI雙染色分析細(xì)胞凋亡。將細(xì)胞以5×105細(xì)胞／mL的密度接種在6孔板，每孔2mL。用濃度分別為0.1、0.25和0.5mL／L的BAEO 處理細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，PBS洗滌，并重懸在500μL 的緩沖液中，先 后 加 入 各5μL 的Annexin－V－FITC 和PI，常溫下避光染色30min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。試驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.7 Western blot分析 將細(xì)胞以5×105細(xì)胞／mL的密度接種在6孔板，每孔2mL。不同濃度的BAEO處理HaCaT細(xì)胞24h后，洗滌細(xì)胞兩次，用含有0.5mmol／L苯甲基磺酰氟（PMSF）、蛋白酶抑制劑（PI）的細(xì)胞裂解液在冰上裂解細(xì)胞，BCA 法蛋白定量。樣品蛋白用SDS－PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC）上。50g／L 脫脂奶粉封閉1h，孵育一抗4℃過夜，洗膜，二抗室溫孵育2h，洗膜。用ECL顯色試劑和Chemidoc XRS＋成像系統(tǒng)曝光和顯影。

2 結(jié)果

2.1 BAEO 的化學(xué)成分分析

用水蒸氣蒸餾法得到的BAEO 經(jīng)氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)出15 種成分，占總成分的97.81%。其中7種為芳香類物質(zhì)，并占總精油的82.54%（表1）。主要成分分別為苯甲醛（57.36mL／L）、苯甲酸（12.73mL／L）、扁桃腈（9.54mL／L）。這個(gè)結(jié)果與Lee H H 等［8］報(bào)道的杏仁精油成分相似。

2.2 BAEO 對(duì)HaCaT 細(xì)胞增殖的影響

不同濃度BAEO 和苯甲醛經(jīng)過不同時(shí)間對(duì)HaCaT 細(xì)胞抑制作用具有相似的影響。BAEO 和苯甲醛作用 于HaCaT 細(xì)胞24 h 后，在0.05%mL／L～1mL／L范圍內(nèi)均有顯著地抑制作用（P＜0.01），且隨著濃度和時(shí)間增加，抑制效果越明顯，均呈劑量和時(shí)間依耐性。然而，BAEO（48h，IC50＝142.45μg／mL）對(duì)細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)大于苯甲醛（48h，IC50＝394.17μg／mL）的細(xì)胞毒性（表2）。

2.3 BAEO 對(duì)HaCaT 細(xì)胞周期的影響

不同濃 度BAEO 處 理 細(xì) 胞24h 后，G0／G1 期細(xì)胞所占比例從對(duì)照組的30.03%±2.29%隨著藥物濃度的增加分別升到32.21%±0.10%、38.77%±1.49%和44.62%±3.50%，而S 期的細(xì)胞所占比例從對(duì)照組的51.12%±2.12%分別降到46.27%±1.46%、38.10%±6.60%和37.96%±2.12%，G2／M 期 變 化 不 明 顯，提 示BAEO 使 HaCaT 細(xì)胞周期阻滯在G0／G1期（圖1）。

表1 BAEO 化學(xué)成分GC－MS分析Table 1 Chemical composition analysis of BAEO by GC－MS

表2 苯甲醛和BAEO 對(duì)HaCaT 細(xì)胞增殖的抑制作用（n＝4，x±SD，%）Table 2 Proliferation inhibitory effect of benzaldehyde and BAEO on HaCaT cells（n＝4，x±SD，%）

2.4 BAEO 對(duì)HaCaT 細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V－FITC／PI 雙 染 法 流 式 細(xì) 胞 儀（FCM）檢測(cè)見圖2，左下限Annexin V（＋）／PI（＋）表示活細(xì)胞群，左上限Annexin V（－）／PI（＋）表示自噬壞死細(xì)胞群，右下限Annexin V（＋）／PI（－）表示早期凋亡細(xì)胞群，右上限AnnexinV（－）／PI（－）表示 晚 期 凋 亡 細(xì) 胞。0.1、0.25、0.5 mL／L 的BAEO 處理24h后，細(xì)胞凋亡率（早期凋亡＋晚期凋亡）從空白對(duì)照組2.63%分別上升到6.07、20.08、26.32%。在0.25 mL／L～0.5 mL／L 范圍內(nèi)，活細(xì)胞率相對(duì)于空白對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。早期凋亡率隨BAEO 濃度的增加而增多，晚期凋亡在濃度為0.25mL／L時(shí)達(dá)到峰值。

2.5 BAEO 對(duì)HaCaT 細(xì)胞Caspase－3和PARP蛋白的影響

為了進(jìn)一步研究細(xì)胞凋亡的機(jī)制，利用Western blot 分 析 了Caspase 凋 亡 相 關(guān) 蛋 白（圖3）。BAEO 作用24h后，Caspase－3和PARP 蛋 白 表 達(dá)量下調(diào)，且均出現(xiàn)了切割條帶，表明細(xì)胞發(fā)生了凋亡。

3 討論

銀屑病是常見慢性皮膚病，臨床發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)［9］。其主要病理特征是角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖異?；钴S，皮損細(xì)胞不能及時(shí)凋亡。抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡已成為抗銀屑病的重要途徑之一。近年來，眾多的天然植物成分因誘導(dǎo)人角質(zhì)細(xì)胞HaCaT 凋亡而應(yīng)用于銀屑病治療。如提取于茜草的1，4－二羥基－2－萘酸［10］。在大量的天然提取物中，精油因具有多種生物活性，而被應(yīng)用于殺蟲、殺菌、抗腫瘤等［11］。本研究采用提取于苦杏仁種子的BAEO 處理人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT，觀察到BAEO 對(duì)HaCaT 細(xì)胞有顯著的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BAEO 對(duì)HaCaT 細(xì)胞周期的影響Fig.1 Effect of BAEO on the cell cycle of HaCaT cells detected by flow cytometry

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BAEO 對(duì)HaCaT 細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of BAEO on the cell apoptosis of HaCaT cells detected by flow cytometry

BAEO 主 要 成 分 是57.36 mL／L 的 苯 甲 醛、12.73mL／L 的苯甲酸、9.54 mL／L 的扁桃腈。高含量苯甲醛可能是由于在樣品研磨過程中苦杏仁苷和β－葡萄糖苷酶相互接觸生成的，扁桃腈是由苦杏仁苷分解成苯甲醛和氰化氫的過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物［12］，苯甲酸是由于苯甲醛的氧化。

通過SRB法檢測(cè)不同濃度的BAEO 對(duì)HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，試驗(yàn)結(jié)果顯示，BAEO 處理細(xì)胞24、48和72h后，IC50值分別為324.97、142.45、65.52μg／mL，表明BAEO 對(duì)HaCaT 細(xì)胞在體外有比較顯著的增殖抑制作用。且BAEO 抑制HaCaT 細(xì)胞增殖呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性，以及細(xì)胞毒性比苯甲醛高。Adams T 等［13］的研究也表明苯甲醛只有在高劑量時(shí)對(duì)人和動(dòng)物細(xì)胞有細(xì)胞毒活性。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HaCaT 細(xì)胞，結(jié)果表明BAEO 作用HaCaT 細(xì)胞24h后，可使細(xì)胞周期的分布發(fā)生明顯變化，使停滯于G0／G1期的細(xì)胞比例明顯增多，細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組相比明顯增加，且隨濃度增大而增大，具有明顯的濃度依賴性。

細(xì)胞凋亡是體內(nèi)細(xì)胞主動(dòng)發(fā)生，受一系列基因控制的自發(fā)性死亡方式，是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)機(jī)制之一。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白（Caspase）是細(xì)胞凋亡過程中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)酶，負(fù)責(zé)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，通常以無活性的酶原形式存在［14］。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同，可分為兩類：起始因子如Caspase－4、5、8 和10 負(fù)責(zé)對(duì)效應(yīng)前體的切割；效 應(yīng) 因 子 如Caspase－3、6 和7 負(fù) 責(zé) 切 割 調(diào)節(jié)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白［15］。凋亡信號(hào)刺激細(xì)胞后，作為Caspases中非常關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者Caspase－3，切割其下游靶蛋白（如PARP）［15］。本試驗(yàn)檢測(cè)到了Caspase－3和PARP 的剪切，表明BAEO 可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本試驗(yàn)從體外水平證明了BAEO 能夠有效抑制HaCaT 細(xì)胞增殖。同時(shí)3種不同的凋亡形式，細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡率增加和Caspase－3活化及PARP剪切，表明了BAEO 也能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)僅探索了BAEO 體外對(duì)HaCaT 細(xì)胞的影響，因此，BAEO 生物活性成分對(duì)增殖和凋亡的影響以及體內(nèi)試驗(yàn)尚需進(jìn)一步研究。

［1］ Lu X，Du J，Liang J，et al.Transcriptional regulatory network for psoriasis［J］.J Dermatol，2013，40（1）：48－53.

［2］ Takeshita J，Wang S W，Shin D B，et al.Comparative effectiveness of less commonly used systemic monotherapies and common combination therapies for moderate to severe psoriasis in the clinical setting［J］.J Am Acad Dermatol，2014，71（6）：1167－1175.

［3］ Pietrzak A，Chodorowska G，Szepietowski J，et al.Psoriasis and serum lipid abnormalities［J］.Dermatol Ther，2010，23（2）：160－173.

［4］ Lin Z X，Jiao B W，Che C T，et al.Ethyl acetate fraction of the root of Rubia cordifolia L.inhibits keratinocyte proliferation in vitro and promotes keratinocyte differentiation in vivo：potential application for psoriasis treatment［J］.Phytother Res，2010，24（7）：1056－1064.

［5］ Lee J，Zhang G，Wood E，et al.Quantification of amygdalin in nonbitter，semibitter，and bitter almonds（Prunus dulcis）by UHPLC－（ESI）QqQ MS／MS［J］.J Agri Food Chem，2013，61（32）：7754－7759.

［6］ Gomaa E Z.In vitro antioxidant，antimicrobial，and antitumor activities of bitter almond and sweet apricot（Prunus armeniaca L.）kernels［J］.Food Sci Biotechnol，2013，22（2）：455－463.

［7］ Chang H K，Yang H Y，Lee T H，et al.Armeniacae semen extract suppresses pipopolysaccharide－induced expressions of cycloosygenase－2and inducible nitric oxide synthase in mouse BV2microglial cells［J］.Biol Pharm Bull，2005，28（3）：449－454.

［8］ Lee H H，Ahn J H，Kwon A R，et al.Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of apricot seed［J］.Phytother Res，2014，28（12）：1867－1872.

［9］ 楊素清，魏 巍，閆景東，等.蜈蚣敗毒飲對(duì)HaCaT 細(xì)胞Keratin6mRNA 表達(dá)的影響［J］.中國(guó)藥房，2014，25（47）：4420－4422.

［10］ Mok C F，Xie C M，Sham KW Y，et al.1，4－dihydroxy－2－naphthoic acid induces apoptosis in human keratinocyte：potential application for psoriasis treatment［J］.Evid Based Compl Alternat Med，2013，2013：792840

［11］ 晏潤(rùn)緯，花金紅.烏藥根揮發(fā)油對(duì)hepg2細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.南昌大學(xué)學(xué)報(bào)：理科版，2014，38（5）：483－487

［12］ Menon R，Munjal N，Sturino J M.Characterization of amygdalin－degrading Lactobacillus species［J］.J Appl Microbiol，2015，118（2）：443－453.

［13］ Adams T，Cohen S，Doull J，et al.The FEMA GRAS assessment of benzyl derivatives used as flavor ingredients［J］.Food Chem Toxicol，2005，43（8）：1207－1240.

［14］ Lamkanfi M，F(xiàn)estjens N，Declercq W，et al.Caspases in cell survival，proliferation and differentiation［J］.Cell Death Differ，2007，14（1）：44－55.

［15］ Zhao F，Huang W，Ousman T，et al.Triptolide induces growth inhibition and apoptosis of human laryngocarcinoma cells by enhancing p53activities and suppressing E6－mediated p53degradation［J］.PLoS One，2013，8（11）：e80784.