高劑量肺癆康對耐多藥結(jié)核分枝桿菌的抑制作用*

陳歡 葉品良 張豐華 張傳濤 楊思捷 王帥

“肺癆康”是由百部、白芨、天冬等11味中藥組成，經(jīng)臨床長期實踐總結(jié)出的一首經(jīng)驗方。前期研究發(fā)現(xiàn)肺癆康可以促進肺結(jié)核患者臨床癥狀和肺部體征消失，促進肺部病變吸收，痰涂轉(zhuǎn)陰[1]。在體外抗菌試驗研究發(fā)現(xiàn)，肺癆康對耐利福平結(jié)核桿菌具有抑制作用[2]。在體內(nèi)抗菌實驗研究發(fā)現(xiàn)，高劑量肺癆康（灌胃給藥劑量6 g/kg）對耐利福平結(jié)核菌具有抑制作用[3]。本實驗旨在前期研究基礎(chǔ)之上，觀察高劑量肺癆康對耐利福平結(jié)核分枝桿菌感染小鼠的臟器指數(shù)影響及主要臟器病理形態(tài)學變化，探討高劑量肺癆康對耐利福平結(jié)核分枝桿菌的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 肺癆康：由天冬、沙參、麥冬、阿膠、百部等組成，所需藥品均購自同仁堂藥店成都分店，采用常規(guī)方法煎煮后濃縮，制備成每毫升含生藥1 g的藥液，冷藏備用，使用前用生理鹽水稀釋。對照藥：利福平，由沈陽紅旗制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字：H21021905，規(guī)格：0.15 g/膠囊。

1.2 實驗菌株 H37RV標準菌（ATCC：27294），由中國疾病預防控制中心臨床分中心提供；單耐利福平（A菌組INH編號：332，B菌組INH編號073），由四川省疾病預防控制中心提供。

1.3 實驗動物 健康昆明種小白鼠100只，雌性，SPF級，體重（20±2）g，由四川省醫(yī)學科學院動物實驗研究所提供，合格證號為：SCXK（川）2012-24。

1.4 實驗儀器 培養(yǎng)箱A2型：力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；生物安全柜BHC-1300ⅡA2：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；電熱鼓風干燥箱CS101-2EBN：重慶四達實驗儀器有限公司恒達儀器廠；電子恒溫水箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；顯微鏡Bx-43：Olympus；手動輪轉(zhuǎn)式切片機Leitz1516：Leica；全自動染色機Autostainer XL：Leica；全自動脫水機TSJ-Ⅲ：常州市中威電子儀器有限公司；病理組織漂烘儀PHY-Ⅲ：常州市中威電子儀器有限公司。

1.5 方法

1.5.1 動物造模 100只雌性小鼠按隨機原則抽取20只小鼠作為空白對照組后，余下的小鼠全部以尾靜脈注射0.4 mL濃度為5×104CFU/mL的耐藥結(jié)核菌液造模，穿刺部位壓迫止血1 min。

1.5.2 動物分組 造模2周后，進行PPD試驗，將試驗陽性小鼠隨機分為模型組、利福平組、肺癆康組、肺癆康與利福平聯(lián)合組（后簡稱：聯(lián)合組），共四組，每組20只，分籠飼養(yǎng)，造模小鼠與空白組小鼠隔離飼養(yǎng)。

1.5.3 動物給藥 空白對照組、標準菌株組和耐藥菌株組均給予同體積生理鹽水每日灌胃一次，連續(xù)灌胃56 d。利福平組：給予同體積的利福平每日灌胃一次，連續(xù)灌胃56 d。肺癆康組：給予同體積的高劑量肺癆康混懸液（6 g/kg）每日灌胃一次，連續(xù)灌胃56 d。聯(lián)合組：給予同體積的利福平及肺癆康混懸液（6 g/kg）每日灌胃一次，連續(xù)灌胃56 d。

1.5.4 指標測定 各組小鼠治療前稱取質(zhì)量一次，治療后每周稱取質(zhì)量一次，觀察并記錄各組動物的存活時間，分別于治療8周后處死小鼠，取小鼠全肺和脾臟觀察小鼠每個臟器的結(jié)核結(jié)節(jié)，臟器的病理形態(tài)學變化（HE染色），并研磨、稀釋后接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)4周后觀察結(jié)核菌數(shù)。

HE染色法具體方法為：取下新鮮的動物組織塊（一般厚度不超過0.5 cm）投入預先配好的固定液中（10%中性福爾馬林溶液），使組織、細胞的蛋白質(zhì)變性凝固，以防止細胞死后的自溶或細菌的分解，從而保持細胞本來的形態(tài)結(jié)構(gòu)。將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊的中酒精，才能浸蠟包埋。將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進行包埋，冷卻凝固成塊即成。將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成薄片，一般為5~8 μm厚度。切下的薄片往往皺折，要放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放45 ℃恒溫箱中烘干。染色前，須用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度酒精，最后入蒸餾水，就可染色。

1.6 統(tǒng)計學處理 結(jié)果采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料結(jié)果均以（x-±s）表示，組間計量資料比較采用組間t檢驗，計數(shù)資料用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重變化及存活時間 與空白組比較，模型組動物死亡時體重明顯降低（P<0.05），通過高劑量癆康組（6 g/kg）、利福平組和聯(lián)合組治療后動物死亡時體重與模型組動物死亡時體重比較，各組動物死亡時體重明顯升高，其中高劑量肺癆康組、聯(lián)合組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與空白組比較，模型組動物平均存活天數(shù)明顯縮短（P<0.05），經(jīng)過高劑量癆康組（6 g/kg）、聯(lián)合組治療后動物存活天數(shù)有所延長，其中高劑量肺癆康組、聯(lián)合組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 小鼠體重變化及存活時間比較（x-±s）

2.2 小鼠臟器系數(shù)及肺臟結(jié)核結(jié)點變化 與空白組比較，模型組肺臟系數(shù)和肝臟系數(shù)明顯增加（P<0.05），脾臟系數(shù)降低（P<0.05），通過高劑量癆康組（6 g/kg）、利福平組和聯(lián)合組治療后可以降低肺臟系數(shù)和肝臟系數(shù)，升高脾臟系數(shù)。其中高劑量癆康組、聯(lián)合組與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組小鼠肺部均產(chǎn)生肺部結(jié)節(jié)，通過高劑量癆康組（6 g/kg）、利福平組和聯(lián)合組治療后可以明顯減少肺結(jié)節(jié)的生成，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 小鼠臟器病理組織學結(jié)果 通過藥物造模后各組動物肝、脾和肺部均發(fā)現(xiàn)炎性改變，采用高劑量肺癆康，利福平和聯(lián)合組治療后可以不同程度緩解肝、脾和肺部炎性病變。見表3。

表2 小鼠臟器系數(shù)及肺臟結(jié)核結(jié)點變化（x-±s）

3 討論

耐藥性肺結(jié)核是指耐一種或一種以上抗結(jié)核藥物的肺結(jié)核，屬于慢性緩發(fā)性傳染性疾病，由于藥物的濫用及結(jié)核桿菌菌種的變異，導致耐多藥結(jié)核病病例不斷增加[4]。據(jù)報道目前至少有27.8%的肺結(jié)核患者對現(xiàn)有肺結(jié)核藥物耐藥[5]。目前西藥對于利福平單耐藥結(jié)核病以利福平、吡嗪酰胺和鏈霉素為核心加用乙胺丁醇，根據(jù)病史及病變嚴重程度、確定是否加用氟喹諾酮類藥物，至少注射3個月，總療程不少于9個月[6]。根據(jù)相關(guān)研究報道利福平單耐藥結(jié)核病采用標準的治療方案及多種聯(lián)合給藥均可取得較為滿意的臨床效果[7-9]。

表3 小鼠臟器病理組織學結(jié)果 只

中醫(yī)學認為耐藥性肺結(jié)核屬于“肺癆”范疇，臨床以咳嗽、咯血、潮熱、盜汗及身體逐漸消瘦為主要特征[10]。目前中醫(yī)藥已成為抗肺結(jié)核的常用藥，其中百部、海浮石、大蒜、黃連、夏枯草、狼毒，貓爪草、苦參能增強感染肺結(jié)核小鼠的免疫力[11-12]，水車前、貓爪草、苦參具有抑菌作用[13]。中藥復方保真湯、百部丸、海浮石丸、抗癆保肺丸、保肺丸、地榆稚草湯、月華丸及百合固金湯，與抗結(jié)核西藥聯(lián)合使用可以改善臨床癥狀，減輕抗結(jié)核藥物的毒副作用，降低耐藥率，可以有效應(yīng)用于耐藥性肺結(jié)核的治療[14-23]。

本次實驗結(jié)果顯示高劑量肺癆康、高劑量肺癆康與利福平聯(lián)合治療后均能升高耐多藥結(jié)核模型小鼠的體重，降低升高的肺臟系數(shù)和肝臟系數(shù)，減少肺部結(jié)節(jié)數(shù)，延長模型小鼠的存活時間。病理結(jié)果顯示，高劑量癆康，高劑量肺癆康與利福平聯(lián)合治療后均可以不同程度緩解肝、脾和肺部炎性改變。對此筆者認為高劑量癆康，高劑量肺癆康與利福平聯(lián)合后可以通過緩解肝、脾和肺部臟器的炎性反應(yīng)，從而降低肺臟系數(shù)和肝臟系數(shù)，進而說明高劑量肺癆康對耐多藥結(jié)核模型小鼠具有較好的治療作用，但是起具有治療作用的機制還有待進一步深入研究。

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