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    枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

    2015-06-09 12:36:21武彩霞綜述劉開揚(yáng)審校
    關(guān)鍵詞:枯草外源芽孢

    武彩霞,王 靜 綜述,劉開揚(yáng) 審校

    (河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心,河北 張家口 075000)

    枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

    武彩霞,王 靜 綜述,劉開揚(yáng) 審校

    (河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心,河北 張家口 075000)

    隨著基因工程和分子生物學(xué)的飛速發(fā)展,在轉(zhuǎn)基因微生物領(lǐng)域里,枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成為一種繼大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)之后的新型表達(dá)系統(tǒng),為外源基因提供了良好的宿主環(huán)境,使外源基因可以進(jìn)行表達(dá),目前已經(jīng)取得了較顯著的成績。該文闡述了枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因研究中質(zhì)粒載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化方法、菌株全基因序列及外源基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)等方面的進(jìn)展。

    枯草芽孢桿菌;質(zhì)粒載體;外源基因;表達(dá)

    轉(zhuǎn)基因技術(shù)是基因工程的一種技術(shù)手段,以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ),以微生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法為手段,按照人類的意愿將外源基因通過構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌等,產(chǎn)生人類所需要的目標(biāo)產(chǎn)物,因此而獲得新的菌株(修飾后的轉(zhuǎn)基因菌株)、新的產(chǎn)品制備法(之前產(chǎn)品制備量少,現(xiàn)在可大規(guī)模生產(chǎn))和新的品種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為基因結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了強(qiáng)有力的手段,利用轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)醫(yī)藥、工業(yè)、食品及環(huán)境用外源蛋白是微生物技術(shù)研究和開發(fā)的重點(diǎn)之一。目前已經(jīng)能夠利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)許多外源蛋白,如具有活性的LTB抗原蛋白[1]、堿性蛋白酶[2]、乙醇脫氫酶[3]、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[4]等。隨著對枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主的深入研究,枯草芽孢桿菌將會成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究中重要的宿主菌,具有很重要的理論研究和應(yīng)用價值。

    1 枯草芽孢桿菌

    枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,簡稱B.subtilis)屬于芽孢桿菌屬,是一類嗜溫、好氧、內(nèi)生抗逆性孢子的革蘭氏陽性菌,廣泛分布于土壤及腐敗的有機(jī)物中。作為革蘭氏陽性細(xì)菌的典型代表,對其生理生化,遺傳及分子生物學(xué)的研究已有50多年的歷史[5]??莶菅挎邨U菌是轉(zhuǎn)基因技術(shù)常用宿主菌之一,其它常用的宿主菌有大腸桿菌、酵母菌和農(nóng)桿菌等。

    枯草芽孢桿菌也是一種益生菌,作為益生菌被應(yīng)用在多個領(lǐng)域。在食品行業(yè)方面,枯草芽孢桿菌因在生長過程中能產(chǎn)生具有一定抗菌效果的抗菌素,并且研究證明枯草芽孢桿菌不產(chǎn)生對人體有害的物質(zhì),所以可以作為食品產(chǎn)品的發(fā)酵菌種[6];在農(nóng)業(yè)上,枯草芽孢桿菌作為一種有效的生防菌已經(jīng)被廣泛使用,不僅可抑制病原菌的生長,還可以促進(jìn)農(nóng)作物增產(chǎn)[7];枯草芽孢桿菌目前還可被應(yīng)用在飼料、醫(yī)藥(新型的藥物或抗原投遞系統(tǒng)等)、養(yǎng)殖業(yè)、洗滌和紡織皮革等行業(yè);枯草芽孢桿菌也可以作為一種微生態(tài)制劑應(yīng)用在多種領(lǐng)域中[8]。

    2 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)

    枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)是緩慢發(fā)展起來的一種表達(dá)系統(tǒng),之前因為芽孢桿菌自身質(zhì)粒沒有標(biāo)記基因,不利于篩選,所以一直不能被用作表達(dá)系統(tǒng),但自從發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)可以允許來源于其它菌的載體的復(fù)制和表達(dá),尤其是研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的載體能運(yùn)用于芽孢桿菌之后,芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)(轉(zhuǎn)化金黃色葡萄球菌的載體)被大量應(yīng)用。芽孢桿菌中大多數(shù)可以作為表達(dá)宿主,主要包括枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌,其中枯草芽孢桿菌是目前使用最多的表達(dá)宿主菌。芽孢桿菌屬中其它可以用于外源基因克隆表達(dá)的宿主菌有:嗜堿芽孢桿菌、淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、耐熱的芽孢桿菌和病原菌炭疽芽孢桿菌等[9]。

    1958年Spizizen首次發(fā)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌168菌株能攝取外源基因,后來隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)明,又因為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)帶抗性標(biāo)志的質(zhì)??勺鳛榭莶菅挎邨U菌載體的發(fā)現(xiàn)(克服了枯草桿菌只有隱秘性質(zhì)粒的困難)及枯草芽孢桿菌全基因組DNA測序的完成使得枯草芽孢桿菌基因工程的工作的到了迅速發(fā)展。枯草芽孢桿菌作為繼大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)之后的基因工程菌具有巨大潛力和優(yōu)勢[10],主要因素有:非致病性,與大腸桿菌相比枯草芽孢桿菌被認(rèn)為是GRAS生物;枯草芽孢桿菌與大腸桿菌和酵母相比,對培養(yǎng)基的要求成本相對較低;枯草芽孢桿菌沒有明顯的密碼子偏好性,不會出現(xiàn)因表達(dá)的外源蛋白含有大量連續(xù)的稀有密碼子而降低蛋白表達(dá)量,或者翻譯提前終止等問題[11];枯草芽孢桿菌在極端條件下可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗逆性很強(qiáng)的內(nèi)源孢子,具有較強(qiáng)的抗逆性;與大腸桿菌相比,較多的外源質(zhì)粒載體(研究者構(gòu)建的各種優(yōu)良載體)可以被轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中;通過實驗和實際生產(chǎn)證明枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)比較穩(wěn)定可靠;枯草芽孢桿菌具有分泌自身胞外蛋白和外源蛋白的功能,所以表達(dá)后的外源蛋白可以被簡單的回收和純化;有多種轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,能夠在蛋白空間構(gòu)象正確形成后,將外源蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外;枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件及代謝過程已經(jīng)被研究透徹,所以能夠很好的控制其發(fā)酵過程,并將枯草芽孢桿菌應(yīng)用于發(fā)酵培養(yǎng)。

    枯草芽孢桿菌啟動子是實現(xiàn)外源基因在枯草芽孢桿菌宿主菌中高效表達(dá)的關(guān)鍵因子,啟動子根據(jù)控制轉(zhuǎn)錄水平的高低,可以分為強(qiáng)啟動子和弱啟動子;根據(jù)誘導(dǎo)機(jī)制,啟動子又可分為組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、時期特異性啟動子和自誘導(dǎo)啟動子[12]。組成型啟動子在表達(dá)時無需受外界的誘導(dǎo),具有持續(xù)性且大體恒定在一定水平上,枯草芽孢桿菌中應(yīng)用的組成型啟動子有HpaⅡ、lepA、SPO2和P43等,其中以P43應(yīng)用較為廣泛[11]??莶菅挎邨U菌誘導(dǎo)啟動子有:PamyQ、溫度誘導(dǎo)啟動子、Tet啟動子、IPTG誘導(dǎo)型啟動子、PxylA、Pglv、PspaS、PmanP和PliaI。PamyQ誘導(dǎo)劑為淀粉;Tet啟動子誘導(dǎo)劑為四環(huán)素;IPTG誘導(dǎo)型啟動子包括PgroE、Pspac和Pgrac;PxylA誘導(dǎo)劑為木糖;Pglv誘導(dǎo)劑為麥芽糖;PspaS誘導(dǎo)劑為subtilin;PmanP誘導(dǎo)劑為甘露糖;PliaI誘導(dǎo)劑為桿菌肽。而在枯草芽孢桿菌的基因工程中,常用的化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)有Pspac、Pxyl和PsacB系統(tǒng)等[13-14]。Su-Jin Lee等(2010)將蘇云芽孢桿菌中產(chǎn)Cry(晶體蛋白)的cry3Aa啟動子的-35和-10區(qū)改成與枯草芽孢桿菌σA-依賴性啟動子一致的序列。cry3Aa啟動子的修飾使AprE的產(chǎn)量顯著提高,這表明了該啟動子可能有利于枯草芽孢桿菌蛋白的高效表達(dá)[15]。B.R.Belitsky等[16](2015)研究了枯草芽孢桿菌總調(diào)控因子CodY和ScoC之間的相互調(diào)節(jié)作用,ScoC-lacZ融合和DNA結(jié)合試驗表明:ScoC被CodY抑制,產(chǎn)生了級聯(lián)調(diào)節(jié)反應(yīng);最后研究表明,ScoC的功能會由于其自身表達(dá)或與DNA結(jié)合調(diào)節(jié)而被其它轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控。Yan等[17](2015)發(fā)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌類真核蛋白激酶(STPK PrkA)在芽孢形成中的新功能,Hpr(ScoC)對轉(zhuǎn)錄因子σK的表達(dá)起抑制作用,而PrkA可以通過抑制Hpr(ScoC)來促進(jìn)孢子的形成和σK的表達(dá)。T.Phanaksri等[18](2015)研究發(fā)現(xiàn)依賴于調(diào)節(jié)因子σB和σA的兩個啟動子的協(xié)同作用可以提高枯草芽孢桿菌中外源基因的表達(dá),這個雙啟動子的協(xié)同效應(yīng)是很保守的,僅在σB-啟動子位于σA-啟動子上游和雙啟動子定位彼此獨(dú)立時才出現(xiàn)。

    3 枯草芽孢桿菌質(zhì)粒載體的構(gòu)建

    枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中質(zhì)粒載體的構(gòu)建也是很關(guān)鍵的一步,研究者需根據(jù)枯草芽孢桿菌宿主菌的不同來選擇合適的表達(dá)載體。

    目前枯草芽孢桿菌表達(dá)載體有整合載體(整合質(zhì)粒)、噬菌體載體和可復(fù)制質(zhì)粒載體三種。采用整合載體攜帶外源基因進(jìn)入枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主后,整合載體連同外源基因表達(dá)單元進(jìn)入染色體并隨染色體的復(fù)制而復(fù)制和表達(dá),染色體整合表達(dá)的優(yōu)勢是外源基因在宿主中可保持較好的穩(wěn)定性[19],整合載體依據(jù)其與染色體基因組DNA的同源重組方式不同,可以分為單交叉同源重組載體(single crossover)和雙交叉同源重組載體(double crossover)[12]。可用于枯草芽孢桿菌表達(dá)載體的噬菌體有spp1噬菌體和Ф105噬菌體等,其中Ф105噬菌體應(yīng)用最多,由該噬菌體衍生出的表達(dá)載體有Ф105J27和Ф105dcM等[20]。可復(fù)制質(zhì)粒也稱為游離質(zhì)?;蚋郊有唾|(zhì)粒,其在宿主中有多個拷貝,所以使用可復(fù)制質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)的優(yōu)勢是目標(biāo)基因進(jìn)入宿主的劑量增大,從而有可能使目的基因表達(dá)量大大提高。

    目前市場上銷售的枯草芽孢桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體有pWB980、pHT43、pHP13、pHP43、pBE2、pMUTIN4、pUB110、pE194、pMA5、pMK3、pMK4、pHT304、pHY300PLK、pBest502、pDG1363、pSG1154、pAX01、pSAS114、pDL、pDG148-stu、pDG641、pAL12、pUCX05-bgaB、pHT01和pVLT33,其中pVLT33是廣宿主質(zhì)粒;相配套的菌株有Bacillus subtilis 168、WB600、WB700、WB800、WB800N和FZB42等??茖W(xué)研究中常用的蛋白酶缺陷型菌株有BG2054、DB104、DB105、DB431、WB600、WB700、LB700和WB800[20]。

    T.T.Phan等[21](2015)發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的IPTG誘導(dǎo)型表達(dá)載體Pgrac100(含外源基因)在枯草芽孢桿菌1012中外源基因有較高水平的表達(dá)量,而在大腸桿菌中外源基因的表達(dá)量卻相對較低,在此載體基礎(chǔ)上,他們還構(gòu)建了Pgrac100-His-tag-MCS載體、Pgrac100-MCS -His-tag載體和Pgrac100-MCS-Strep-tag載體。T.Ogawa等[22](2015)發(fā)明了一種新型的枯草芽孢桿菌基因組BGM載體(誘導(dǎo)recA表達(dá)系統(tǒng))——iREX載體,與傳統(tǒng)的BGM載體相比,iREX載體能夠通過抑制錯誤重組體來操縱大片段的DNA,而且iREX載體還能被用來處理許多同源序列(比如多重報告表達(dá)框)的DNA,因此,iREX載體作為處理大片段DNA的一個平臺可以擴(kuò)大BGM載體的利用率。

    4 枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法

    枯草芽孢桿菌是表達(dá)外源蛋白的良好宿主菌,如表達(dá)蛋白酶、磷脂酶和纖維素酶,因此枯草芽孢桿菌可以被直接應(yīng)用在工業(yè)化生產(chǎn)中。但是很多枯草芽孢桿菌宿主菌因為轉(zhuǎn)化效率低而影響了其應(yīng)用價值。目前質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌的方法有固體培養(yǎng)基法、原生質(zhì)體裂解物固體培養(yǎng)基法(LP轉(zhuǎn)化法)、感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化法(化學(xué)轉(zhuǎn)化法,又稱為Spizizen法)、電轉(zhuǎn)化法(包括電轉(zhuǎn)化完整枯草芽孢桿菌法和甘氨酸處理的電轉(zhuǎn)化法)和原生質(zhì)體法。

    早在1958年John Spizizen就研究了枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化方法,他發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法Spizizen法目前仍被廣泛使用和改進(jìn)[23]。Zhang等(2011)基于枯草芽孢桿菌SCK6和多聚體質(zhì)粒的重組發(fā)明了一種制備超感受態(tài)細(xì)胞的新方法,此法簡單、快速和高效,簡單到只需限制性內(nèi)切酶、磷酸酶和連接酶即可,高效性體現(xiàn)在轉(zhuǎn)化效率:~107轉(zhuǎn)化子/μg多聚體質(zhì)粒和~104轉(zhuǎn)化子/μg重組質(zhì)粒DNA??莶菅挎邨U菌超感受態(tài)細(xì)胞的制備機(jī)制:通過添加木糖誘導(dǎo)感受態(tài)主控調(diào)節(jié)因子ComK的過表達(dá)。DNA突變文庫的構(gòu)建需要兩輪PCR:①通過易錯聚合酶鏈反應(yīng)(epPCR)獲得誘變處理的DNA,通過高保真PCR(high-fidelity PCR)獲得線性質(zhì)粒;②第一步的兩種模板DNA進(jìn)行重疊PCR(overlap PCR)可獲得多聚體質(zhì)粒。此法為Zhang等(2011)年發(fā)明的新方法,通過此新方法不僅提高了蛋白表達(dá)水平,還提高了糖苷水解酶家族5內(nèi)切葡聚糖酶再生非晶態(tài)纖維素的特殊活性。DNA突變文庫構(gòu)建的常規(guī)方法比較費(fèi)時、耗力和成功率低,此新方法簡單、快速和高效。常規(guī)方法和新方法的比較如圖1所示[24]。

    A:常規(guī)方法流程 B:新方法流程

    枯草芽孢桿菌DB104(枯草芽孢桿菌168的衍生菌株)由于其具有低降解蛋白酶活性和高效的分泌途徑,成為一種很受人關(guān)注的進(jìn)化宿主菌,但枯草芽孢桿菌DB104也是和其它枯草芽孢桿菌一樣,存在低轉(zhuǎn)化效率(≤103轉(zhuǎn)化子/μg DNA)的缺陷,Vojcic等(2012)經(jīng)過研究獲得了一種較高效率的轉(zhuǎn)化方法,通過在枯草芽孢桿菌感受態(tài)階段改善培養(yǎng)生長條件和組氨酸的濃度、增加感受態(tài)階段的孵育時間和增加轉(zhuǎn)化過程中恢復(fù)階段的孵育時間,使枯草芽孢桿菌DB104的轉(zhuǎn)化效率提高到了~105轉(zhuǎn)化子/μg DNA[25]。

    Lu等(2012)通過改善電轉(zhuǎn)化方法的條件分別提高了枯草芽孢桿菌WB800和DB104的轉(zhuǎn)化效率,運(yùn)用改善后的方法,使得枯草芽孢桿菌WB800的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了3.64×105轉(zhuǎn)化子/μg DNA,枯草芽孢桿菌DB104的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了2.10×105轉(zhuǎn)化子/μg DNA。此轉(zhuǎn)化效率的提高將大大有益于外源基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)、定向進(jìn)化基因文庫構(gòu)建和野生型枯草芽孢桿菌菌株的轉(zhuǎn)化[26]。

    5 枯草芽孢桿菌全基因序列測定及蛋白分泌途徑

    目前全基因組序列測序成功的枯草芽孢桿菌有很多,全基因組序列測序的成功為人類研究枯草芽孢桿菌的結(jié)構(gòu)和功能機(jī)制提供了更好的基礎(chǔ)。

    最近剛剛公布全基因組序列的枯草芽孢桿菌有:BacillussubtilisATCC 6051a、Bacillussubtilis3NA、BacillussubtilisQB928和Bacillussubtilissubsp.spizizeniiW23等。枯草芽孢桿菌ATCC 6051a(=KCTC 1028/P31K6)是一種廣泛用于工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌株,具有很高的分泌效率,Kabisch等[27](2015)公布了枯草芽孢桿菌ATCC 6051a的全基因組序列(Accession No.CP011115),該菌全基因組序列的公布為更好的研究此菌的結(jié)構(gòu)和功能提供了理論依據(jù)??莶菅挎邨U菌ATCC 6051全基因序列和作為外源蛋白表達(dá)宿主菌已經(jīng)得到認(rèn)可,這個野生型菌株與廣泛應(yīng)用于試驗的枯草芽孢桿菌168相比顯示出許多營養(yǎng)缺陷性,比如不可產(chǎn)生聚酮化合物等。但枯草芽孢桿菌ATCC 6051可以通過遺傳學(xué)修飾成為優(yōu)化菌株,在乙偶姻誘導(dǎo)型啟動子控制下表達(dá)異源蛋白基因[28]。Reuβ等[29](2015)公布了枯草芽孢桿菌3NA的全基因序列(序列登陸號為:CP010314),枯草芽孢桿菌3NA在分批補(bǔ)料發(fā)酵時會達(dá)到一個高濃度細(xì)胞的水平,因此作為一個生產(chǎn)菌株有待于進(jìn)一步優(yōu)化,優(yōu)化后的枯草芽孢桿菌168和W23基因特性的出現(xiàn)更加表明了枯草芽孢桿菌3NA可以成為一個待優(yōu)化的混合菌株。Yu等[30](2012)完成了枯草芽孢桿菌QB928的全基因組序列測定,并公布在了Genσbank上,序列號為:CP003783??莶菅挎邨U菌QB928全基因序列的成功測定可被廣泛應(yīng)用在枯草芽孢桿菌遺傳學(xué)研究中。Zeigler(2011)等[31]報道了Bacillussubtilissubsp.spizizeniiW23菌株的全基因序列,此全基因序列的公布強(qiáng)有力地證明了W23是B.subtilisATCC 6633的子代。W23和目前研究的模式菌株B.subtilissubsp.subtilis168同樣擁有3.6Mb的核基因,而且核基因次序都是高度保守的;另外,W23基因組有157個不同于B.subtilissubsp.subtilis168的非核基因片段,而B.subtilissubsp.subtilis168基因組有141個不同于W23的非核基因片段。

    枯草芽孢桿菌蛋白分泌是指枯草芽孢桿菌表達(dá)的蛋白由細(xì)胞膜向細(xì)胞外運(yùn)輸?shù)倪^程??莶菅挎邨U菌蛋白分泌途徑至少有4種:Sec途徑(此途徑又稱為一般分泌途徑,大多數(shù)細(xì)菌分泌蛋白都通過此轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)分泌)、Tat途徑(又稱雙精氨酸分泌途徑,因分泌蛋白的信號肽中含有兩個相鄰的精氨酸殘基而得名)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子途徑(主要用于細(xì)菌素等分子的輸出)和Com分泌途徑(與枯草芽孢桿菌感受態(tài)的形成有關(guān))[32]。

    6 枯草芽孢桿菌作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)存在的問題及解決方法

    枯草芽孢桿菌是一種很重要的可以生產(chǎn)高質(zhì)量工業(yè)酶的革蘭氏陽性菌,但運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中有一個很大的障礙:枯草芽孢桿菌自身產(chǎn)生的細(xì)胞外蛋白酶可以將外源蛋白降解,這是枯草芽孢桿菌作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)的最重要缺陷之一。其它缺陷還有:枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒不穩(wěn)定,一定程度上存在結(jié)構(gòu)型或分離型上的不穩(wěn)定,在大規(guī)模生產(chǎn)中容易丟失或發(fā)生結(jié)構(gòu)改變,影響目的蛋白的產(chǎn)率;某些外源基因的表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中會對細(xì)胞的生長產(chǎn)生影響;基因?qū)?xì)胞產(chǎn)生毒性時,外源蛋白得不到有效表達(dá)。

    目前已被確定的枯草芽孢桿菌細(xì)胞外蛋白酶有中性蛋白酶A、中性蛋白酶B、枯草桿菌蛋白酶(又稱為堿性蛋白酶,包括3種堿性絲氨酸蛋白酶)、金屬蛋白酶和桿菌肽F等??莶菅挎邨U菌可以產(chǎn)生細(xì)胞外蛋白酶并降解外源蛋白已成為事實,為了克服這一障礙,科學(xué)家們通過基因工程手段對枯草芽孢桿菌進(jìn)行了一些修飾,比如通過基因敲除構(gòu)建缺失某種或幾種細(xì)胞外蛋白酶基因的枯草芽孢桿菌菌株;應(yīng)用缺失突變的方法使染色體上相應(yīng)的基因失活,構(gòu)建一個或者多個蛋白酶失活的突變體等。目前構(gòu)建好的缺失細(xì)胞外蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株有:WB600菌株、WB700菌株、WB800菌株和WB800N菌株等。WB600菌株是6個蛋白酶失活的突變株,WB700菌株是7個蛋白酶全失活的突變株,當(dāng)外源基因在這些突變株中表達(dá)時,既提高了產(chǎn)率又增加了穩(wěn)定性,但這也不是絕對的。Takeko Kodama等(2007)證實在枯草芽孢桿菌后期平穩(wěn)增長階段由于AprX泄露到培養(yǎng)基中(可能是由細(xì)胞裂解引起的)造成了異源(外源)蛋白的降解[33],因此可以構(gòu)建缺失AprX基因的菌株;Rabbani等[34](2014)通過同源重組手段使蛋白酶基因aprE失活,從而獲得了缺失aprE基因活性的Bacillussubtilis168菌株;B.R.Belitsky等[35](2011)通過使用CodY的突變分析和DNaseⅠ足跡實驗的結(jié)合,確定了兩個與CodY有高親和力的結(jié)合位點(diǎn)與ybgE基因控制子有關(guān)。

    質(zhì)粒不穩(wěn)定和蛋白酶降解目的蛋白使枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)受到制約,目前的解決方法主要有:①利用多個調(diào)控基因和誘導(dǎo)的方法控制外源基因的表達(dá);②將克隆基因整合到染色體上,隨染色體的復(fù)制而復(fù)制,后者是目前克隆枯草芽孢桿菌質(zhì)粒不穩(wěn)定的一種有效途徑[9];③篩選或構(gòu)建缺陷型蛋白酶菌株。外源基因表達(dá)量低的解決辦法有改善宿主菌培養(yǎng)條件和優(yōu)化誘導(dǎo)劑的濃度等。R.F.Li等[36](2015)通過響應(yīng)面的方法來改善重組體CGA-N46在枯草芽孢桿菌DB1342(p-3N46)的表達(dá)條件,結(jié)果表明糊精和胰蛋白胨是影響CGA-N46表達(dá)的兩個關(guān)鍵因素。CodY是革蘭氏陽性菌的主調(diào)控因子,在枯草芽孢桿菌中,200多個基因包括多肽轉(zhuǎn)運(yùn)酶、胞內(nèi)蛋白水解酶和氨基酸降解通路都受CodY調(diào)控,但一直以來沒有數(shù)據(jù)顯示CodY能夠調(diào)控胞外蛋白酶,直到G.Barbieri等[37](2015)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)CodY與相應(yīng)胞外蛋白酶基因的調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合時,CodY可以對Vpr和Mpr兩個胞外蛋白酶基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控調(diào)節(jié),因此,目前可以認(rèn)為CodY是枯草芽孢桿菌全部蛋白有效通路的總調(diào)控因子。

    7 枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因應(yīng)用及展望

    近年來,枯草芽孢桿菌作為轉(zhuǎn)基因表達(dá)宿主菌,在分泌外源表達(dá)蛋白方面的研究取得了很大的進(jìn)展,國內(nèi)外已經(jīng)成功表達(dá)了多種類型的基因[38],例如:Z.B.Guan等[39](2015)首次報道了CotA-laccase在枯草芽孢桿菌WB600中的異源表達(dá),并介紹了重組枯草芽孢桿菌WB600-5在細(xì)菌酶的工業(yè)化生產(chǎn)方面具有很大的潛能,而且CotA-laccase-ACS系統(tǒng)也有望應(yīng)用于工業(yè)紡織廢水的生物學(xué)處理中。Q.He[40]等(2015)研究發(fā)現(xiàn)在枯草芽孢桿菌使用內(nèi)蛋白表達(dá)系統(tǒng)中可以很好的表達(dá)和純化類似抗菌肽cathelicidin-BF的這種溶解性多肽和蛋白。張漫莉等[41](2013)在枯草芽孢桿菌蛋白酶缺失型菌株WB700中成功表達(dá)了纖維素酶EGA基因;李靜靜[42](2013)成功構(gòu)建了枯草芽孢桿菌體系誘導(dǎo)表達(dá)α-ALDC基因,并比較研究了純酶的酶學(xué)性質(zhì),優(yōu)化了具有工業(yè)應(yīng)用前景的重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。

    枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因應(yīng)用產(chǎn)品有核苷類產(chǎn)品、核黃素、微生物制劑/益生菌和工業(yè)酶制劑??莶菅挎邨U菌轉(zhuǎn)基因技術(shù)在基因工程這一領(lǐng)域里已經(jīng)被研究的很成熟了,在質(zhì)粒載體的選擇和改進(jìn)、轉(zhuǎn)化方法的選擇和優(yōu)化及缺失型蛋白酶菌株的構(gòu)建等方面研究已有很大突破,而且在工業(yè)化生產(chǎn)的實踐應(yīng)用中也取得了很顯著的成績。但還需更加深入的了解芽孢桿菌屬的其它細(xì)菌及枯草芽孢桿菌的結(jié)構(gòu)和功能,從而為枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因研究提供更好的理論和研究基礎(chǔ)。

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    [責(zé)任編輯:李薊龍]

    河北北方學(xué)院青年基金項目(No.Q2014028)

    武彩霞(1986-),女,山西大同陽高人,碩士,研究實習(xí)員。

    Q 812

    C

    10.3969/j.issn.1673-1492.2015.05.030

    來稿日期:2014-09-01

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