ASPP2表達(dá)對(duì)食管癌術(shù)后療效評(píng)價(jià)意義的研究

李東 田洪超 李樹臣 牛鳳英 殷培偉

(山東新泰第二人民醫(yī)院 山東新泰 271219)

ASPP2表達(dá)對(duì)食管癌術(shù)后療效評(píng)價(jià)意義的研究

李東 田洪超 李樹臣 牛鳳英 殷培偉

(山東新泰第二人民醫(yī)院 山東新泰 271219)

目的：探討ASPP2在食管癌術(shù)后患者中的表達(dá)水平及意義，證實(shí)ASPP2對(duì)食管癌術(shù)后療效評(píng)價(jià)的可行性。探討ASPP2在食管癌組織轉(zhuǎn)變過程中的分子作用機(jī)制，ASPP2表達(dá)與食管癌患者術(shù)后療效的關(guān)系。方法：采用免疫組化方法檢測(cè)45例食管癌、20例食管良性瘤及20例正常食管組織中ASPP2、P53的表達(dá)水平。進(jìn)一步分析ASPP2、P53的表達(dá)與食道癌臨床病理特征的關(guān)系。采用Spearman等級(jí)相關(guān)的方法，對(duì)ASPP2、P53的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：三組標(biāo)本組織中ASPP2、P53的表達(dá)水平比較P＜0.05，具有顯著性差異。結(jié)論：食管癌組織中ASPP2表達(dá)顯著下降，P53水平明顯增高，ASPP2、P53的表達(dá)與食管癌的直徑侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，ASPP2、P53的異常表達(dá)是食管癌發(fā)生和發(fā)展的重要因素，ASPP2是判斷食管癌術(shù)后療效的較好指標(biāo)。

食管癌;ASPP2;P53;基因;療效

食管癌(esophageal cancer)是全球內(nèi)發(fā)病率極高的惡性腫瘤，占全世界食管癌死亡例數(shù)的50%以上［1］。5年生存率僅為10%-15%［2］。食管癌術(shù)后5年生存率僅為25%左右，那么怎樣才能夠讓食管癌患者術(shù)后預(yù)后有一良好的評(píng)價(jià)方法成為研究熱點(diǎn)［3］。ASPP2是一個(gè)新的蛋白質(zhì)家族，具有促進(jìn)凋亡的作用，特異性地增強(qiáng)p53等細(xì)胞凋亡功能，ASPP2能與p53結(jié)合并特異性增強(qiáng)p53與促凋亡基因啟動(dòng)子的結(jié)合，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究對(duì)此進(jìn)行研究來證實(shí)ASPP2異常表達(dá)與食管癌術(shù)后轉(zhuǎn)移、發(fā)展密切相關(guān)，可以成為食管癌術(shù)后療效評(píng)估的的分子生物學(xué)特異性指標(biāo)。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年6月至2014年6月本院胸外科住院的食管疾患患者手術(shù)切除的食管組織85例，其中食管癌45例，食管良性瘤20例，正常食管(取自食管良性瘤患者的瘤旁2cm以上)組織20例。每例均有完整的臨床資料，其中男性35例，女性30例。食管癌組平均年齡61.5(45-78)歲，鱗狀細(xì)胞癌35例、腺癌5例、未分化癌5例，按2001年國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期25例，Ⅲ期6例，Ⅳ期3例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例。食管良性瘤組男性12例、女性8例，平均年齡55.2(45-67)歲，其中平滑肌瘤10例、息肉8例、乳頭狀瘤2例。所有病例均術(shù)后常規(guī)病理檢查確診，術(shù)前均未化療、放療。

1.2 隨機(jī)方法

本研究中所納入患者采用分層隨機(jī)分組化法，根據(jù)研究對(duì)象進(jìn)入試驗(yàn)時(shí)重要的臨床特征或危險(xiǎn)因素分層(如年齡、性別、病情、疾病分期、檢驗(yàn)、檢查等)，然后在每一層內(nèi)進(jìn)行隨機(jī)分組，最后分別合并為觀察組和對(duì)照組。以避免指定實(shí)驗(yàn)研究及治療所帶來的偏差，提高患者的已知和未知特性被均衡分布到各治療組的可能性，增強(qiáng)各組統(tǒng)計(jì)學(xué)的可比性。

2.方法

2.1 標(biāo)本采集

每例標(biāo)本同時(shí)取材2塊，一塊中性福爾馬林固定，石蠟包埋用于免疫組化、病理確診、組織分型等;一塊備用。

2.2 P53免疫組化及檢測(cè)方法

2.2.1 載玻片的預(yù)處理

將載玻片用洗衣粉水浸泡過夜，自來水流水沖洗30min，蒸餾水沖洗3次，烤干，放入95%的乙醇中浸泡30min，干凈綢布擦干。

2.2.2 防脫片處理

用丙酮按1：50的比例稀釋APES配制成工作液，將清洗后的載玻片放入新鮮配制的APES工作液中20-30sec，取出玻片略干燥5min，再放入純丙酮溶液中刷洗2-3次，洗去未結(jié)合的APES，涼干裝盒，防塵防污染備用。

2.2.3 免疫組化染色程序

⑴組織切片依次置于二甲苯浸泡5min→二甲苯浸泡5min→100%乙醇浸泡5min→95%乙醇浸泡5min→80%乙醇浸泡5min→70%乙醇浸泡5min→自來水沖洗→蒸餾水浸泡5min;

⑵加新配制的3%H2O2于組織切片上，室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;蒸餾水沖洗，PBS(PH7.2-7.4)浸泡5min;

⑶抗原熱修復(fù)：將裝有枸椽酸鹽緩沖液的玻片缸放人微波爐中加熱，切片位于液面以下;當(dāng)液面出現(xiàn)小水泡時(shí)開始計(jì)時(shí)，8min后取出玻片缸冷卻至室溫，蒸餾水洗后，用PBS洗2min;

⑷加正常山羊血清工作液(藍(lán)色液體)封閉，室溫孵育15min，傾去勿洗;

⑸滴加1：100稀釋的鼠抗人p53單克隆抗體，4℃過夜，次日PBS洗3次，每次5min。用已知p53陽(yáng)性的胃癌組織標(biāo)本做陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照;

⑹滴加生物素標(biāo)記的通用型二抗工作液(黃色液體)，室溫孵育30min，PBS洗3次，每次5min;

⑺滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液(橙色液體)，室溫孵育30min，PBS洗3次，每次5min;

⑻DAB即用型試劑配制：于1ml雙蒸水中加入1滴A液混勻，然后將試劑B和C各一滴加入其中再次混勻，配好后避光保存，0.5h內(nèi)應(yīng)用;

⑼加現(xiàn)配制的DAB顯色液覆蓋標(biāo)本，顯色約2-5min，然后自來水充分沖洗。

2.2.4 復(fù)染和封片

蘇木素復(fù)染組織切片15-30sec，自來水沖洗，然后依次進(jìn)行脫水、透明和中性樹膠封片，具體步驟依次為75%乙醇浸泡2min→85%乙醇浸泡2min→95%乙醇浸泡2min→100%乙醇浸泡2min→二甲苯Ⅰ浸泡2min→二甲苯Ⅱ浸泡2min→中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

2.2.5 免疫組化結(jié)果判定

p53蛋白的陽(yáng)性顆粒在細(xì)胞核，細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽(yáng)性細(xì)胞。綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性范圍，對(duì)p53蛋白的表達(dá)進(jìn)行臨床病理評(píng)分。染色強(qiáng)度：基本未著色、染色與背景相似者為0分，著色淺、略高于背景者為1分，中度著色明顯高于背景者為2分，強(qiáng)染、著色深棕色者為3分;陽(yáng)性范圍：＜10%為0分，10%-24%為1分，25%-49%為2分，50%-75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性范圍相加，≥2分為陽(yáng)性。

2.3 ASPP2檢測(cè)方法［4］

2.3.1 將組織樣品與試劑混合，10分鐘低溫離心，棄上清，保證被檢樣品要求，同型對(duì)照管中加入熒光標(biāo)記同型對(duì)照抗體，做陰性對(duì)照;待測(cè)管中加入熒光標(biāo)記的一抗，做為實(shí)驗(yàn)管，各加3μl(按抗體使用說明書，一抗可做選擇幾個(gè)梯度1：20、50、100倍稀釋)混勻即可。

2.3.2 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。

2.3.3 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時(shí)間(參考：30min)。

2.3.4 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時(shí)振蕩。

2.3.5 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。

2.3.6 上機(jī)檢測(cè)，先做同型對(duì)照，用熒光顯微鏡觀察，觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度。染色強(qiáng)度：基本未著色、染色與背景相似者為0分，著色淺、略高于背景者為1分，中度著色明顯高于背景者為2分，強(qiáng)染、著色深棕色者為3分;陽(yáng)性范圍：＜10%為0分，10%-24%為1分，25%-49% 為2分，50%-75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性范圍相加，≥2分為陽(yáng)性。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料的數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示，計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用X2檢驗(yàn)，采用Spearman等級(jí)相關(guān)的方法，對(duì)相關(guān)性進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有顯著性。

3.結(jié)果

3.1 三組標(biāo)本組織中ASPP2、P53在食管癌組織中的的表達(dá)分別是11.11%(5/45);93.7(42/45)在食管良性腫瘤中表達(dá);65%(13/20); 10.0(2/20)在正常食管組織中的表達(dá)75.0%(15/20);5.0%(1/20)

三組食管組織中ASPP2、P53表達(dá)差異有顯著性(P＜0.01)，見表1

表1 ASPP2、P53在食管癌組織、食管良性腫瘤、正常食道組織中的表達(dá)

3.2 ASPP2、P53的表達(dá)與食道癌臨床病理特征的關(guān)系比較，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者ASPP2表達(dá)較其它兩組明顯下降、P53表達(dá)明顯高其它兩組;隨著TNM分期及腫瘤大小的升高ASPP2顯著下降、P53表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，ASPP2、P53與年齡無關(guān)(P＞0.05)，見表2

表2 ASPP2、P53的表達(dá)與食道癌臨床病理特征的關(guān)系比較［n，(%)］

3.3 ASPP2、P53在食管癌組織中的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)。見圖1

圖1 ASPP2、P53在食管癌組織中的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)

4.討論

食管惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展存在著復(fù)雜多階段、多步驟的生物學(xué)變化的過程，與細(xì)胞的增殖、基因改變和凋亡調(diào)節(jié)等有著密切相關(guān)性［5］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及在各系統(tǒng)腫瘤研究領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，很多學(xué)者從基因水平對(duì)食管癌的評(píng)價(jià)進(jìn)行了廣泛而深入的研究，而且發(fā)現(xiàn)了許多意義較大的基因，P53就是目前已被明確確定的基因［6］。盡管隨著醫(yī)學(xué)科技的進(jìn)步，腫瘤的治療手段日益豐富，然而令人失望的是，食管癌總體五年生存率仍然很低，預(yù)后較差，死亡率很高［7］。ASPP2作為一個(gè)腫瘤抑制基因，已成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，前期研究發(fā)現(xiàn)ASPP2作為抑癌基因，在肝癌、肺癌、白血病等惡性腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用，國(guó)外學(xué)者在食管癌細(xì)胞株研究中ASPP2也具有明顯表達(dá)［8］，因此本研究對(duì)三組組織進(jìn)行研究對(duì)比來證實(shí)其在食管癌中的表達(dá)，從而來分析其對(duì)食管癌患者術(shù)后療效評(píng)價(jià)的作用及機(jī)制。研究顯示［9］ASPP2 是p53凋亡刺激蛋白家族是一個(gè)新的蛋白家族，ASPP2能與p53蛋白的核心區(qū)域結(jié)合，增強(qiáng)p53促進(jìn)凋亡基因轉(zhuǎn)錄的能力，發(fā)揮抑制腫瘤的作用。ASPP2是由1128個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，能促進(jìn)p53結(jié)合DNA，增強(qiáng)p53的促細(xì)胞凋亡功能。學(xué)者們還發(fā)現(xiàn)ASPP2與p53相互作用，通過調(diào)控p53的凋亡功能對(duì)抑制腫瘤生長(zhǎng)起到重要作用［10］。ASPP2促凋亡機(jī)制是通過刺激p53家族(包括p53，p63，p73)的啟動(dòng)子，增強(qiáng)特異啟動(dòng)子的綁定與轉(zhuǎn)活目的基因的功能來完成的。染色質(zhì)免疫沉淀分析顯示，在體內(nèi)ASPP2的表達(dá)選擇性的提高了啟動(dòng)子結(jié)合目的基因p53的活性，啟動(dòng)這一抑癌基因發(fā)揮作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11］。APPS2不僅能增強(qiáng)正常啟動(dòng)因子結(jié)合目的基因，而且ASPP2的表達(dá)還能選擇性刺激p53對(duì)異位表達(dá)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)活性［12］。最近研究表明［13］，ASPP2的一段主干序列由氨基酸序列N端截?cái)嗟囊欢喂δ軉挝?，同樣具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的能力，但是其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和p53蛋白凋亡功能的能力較強(qiáng)，在一些資料中體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)ASPP2可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的線粒體死亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生，揭示了ASPP2通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和p53蛋白凋亡功能活性抑制食管癌生長(zhǎng)這一分子機(jī)制［14］。但是當(dāng)食管腫瘤發(fā)生后iASPP可與ASPP2競(jìng)爭(zhēng)性地與p53結(jié)合，抑制ASPP2的促凋亡能力及表達(dá)，從而減低P53的抑制性來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。從本研究可以看出三組標(biāo)本組織中ASPP2、P53在食管癌組織中的的表達(dá)分別是11.11%(5/45);93.7% (42/45)在食管良性腫瘤中表達(dá);65%(13/20);10.0%(2/20)在正常食管組織中的表達(dá)75.0%(15/20);5.0%(1/20)三組食管組織中ASPP2、P53表達(dá)差異有顯著性(P＜0.01)，這也說明國(guó)外研究結(jié)果與本研究相符ASPP2、P53在食管癌組織中表達(dá)具有相關(guān)性。同時(shí)本研究進(jìn)一步進(jìn)行ASPP2、P53的表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系比較，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者ASPP2表達(dá)較其它兩組明顯下降、P53表達(dá)明顯高其它兩組;隨著TNM分期及腫瘤大小的增長(zhǎng)ASPP2顯著下降、P53表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，ASPP2、P53與年齡無關(guān)(P＞0.05)，更進(jìn)一步證實(shí)隨著食管癌患者病情加重及治療結(jié)果ASPP2的表達(dá)明細(xì)顯降低。綜上所述，ASPP2在食管癌組織中表達(dá)明顯降低，與食管癌的侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。是食管癌發(fā)病和進(jìn)展的重要因素。APSPP與p53的表達(dá)是食管癌發(fā)生和進(jìn)展的相關(guān)因素，ASPP2通過p53的相互作用，調(diào)控食管癌的發(fā)病、侵襲和轉(zhuǎn)移共同發(fā)揮著重要作用。由此可見，ASPP2在食管癌中的表達(dá)足以反應(yīng)其轉(zhuǎn)移、分期緩解程度，與傳統(tǒng)標(biāo)記物P53共同反應(yīng)食管癌的預(yù)后，因此完全可以將ASPP2作為食管癌術(shù)后療效的評(píng)估指標(biāo)，但是ASPP2在外周血中的表達(dá)準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步的研究。

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ASPP2 expression studies on the efficacy of postoperative evaluation of the significance

Li Dong Tian HongChao LiShuChen NiuFengYeng YinPeiWei

Objective:To investigate the expression and significance ASPP2 in postoperative patients，demonstrated the feasibility of ASPP2 efficacy of postoperative evaluation.ASPP2 investigate the molecular mechanism of esophageal carcinoma during the transition，the relationship ASPP2 expression and efficacy in postoperative patients.Methods:Immunohistochemical staining was detected 45 cases of esophageal cancer，20 cases of benign esophageal tumors and 20 cases of normal esophageal tissues ASPP2，the expression level of P53.Further analysis of the relationship between expression and clinicopathological features of esophageal ASPP2，P53＇s.Using Spearman rank correlation method，the ASPP2，P53 expression level correlation analysis.Results:The three groups of tissue samples ASPP2，P53 expression level was P＜0.05，significant difference.Conclusion:esophageal carcinoma ASPP2 expression was significantly decreased，P53 levels were significantly increased in diameter invasion ASPP2，P53 expression and lymph node metastasis of esophageal cancer，ASPP2，abnormal expression of P53 is an important factor in the occurrence and development of esophageal cancer，ASPP2 is a good indicator to judge the efficacy of postoperative.

Esophageal cancer;ASPP2;P53;Gene;Efficacy

R735.1

B

1009-6019(2015)02-0007-03

李東，大學(xué)學(xué)歷，主任醫(yī)生，研究方向胸外疾病的診斷與治療