高效液相色譜法測定小鼠血清中磺胺間甲氧嘧啶及其N4－乙?；x物含量

張強，張丹，劉業(yè)好，盛杰，陳文軍，王國秀，劉開永

（安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，合肥230601）

高效液相色譜法測定小鼠血清中磺胺間甲氧嘧啶及其N4－乙?；x物含量

張強，張丹，劉業(yè)好，盛杰，陳文軍，王國秀，劉開永?

（安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，合肥230601）

磺胺間甲氧嘧啶（SMM）于ICR小鼠哺乳期暴露后，測定其血清中SMM和N4－乙?；前烽g甲氧嘧啶（ACSMM）含量。小鼠哺乳期以0、10、50、200 mg／（kg·d）灌胃給藥直至21 d，于第22天麻醉，摘眼球取血。血清樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白，超聲輔助提取，采用反相C18（250 mm× 4.6 mm，5μm）色譜柱，以乙腈：水（含0.2%冰乙酸）為流動相，流速為1 mL／min，柱溫35℃，高效液相色譜耦合二極管陣列檢測器對目標物檢測，SMM和ACSMM檢測波長分別為273 nm和267 nm，外標法峰面積定量。SMM和ACSMM血清加標回收率為85.8%～110.2%，精密度（RSD%）均小于8.3%，在0.05～2.5μg／mL和5～30μg／mL（適用母鼠體內(nèi)SMM）范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r2＞0.990；最低檢出限分別為0.023和0.042μg／mL。本法靈敏、快速、準確，可用于血清中SMM和ACSMM的測定。

磺胺間甲氧嘧啶；N4－乙?；前烽g甲氧嘧啶；高效液相色譜；二極管陣列檢測器

磺胺間甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM）是長效磺胺類獸藥（Sulfonamides，SAs）中的一員，研究表明SAs（包含SMM）在地表水、蔬菜、魚肉制品和牛奶等中均有檢出，甚至部分食品存在超標［1－4］。磺胺藥能通過乳汁分泌，藥物在葡萄糖－6－磷酸脫氫酶缺乏的新生兒中導致溶血性貧血發(fā)生，還可導致膽紅素腦病和新生兒溶血［5］?；前奉愃幬锛捌湟阴；x物在酸、中性環(huán)境中易在泌尿系統(tǒng)形成結(jié)晶，引起尿痛、血尿、尿閉等［6］。研究證明磺胺類抗菌藥物是一種甲狀腺素干擾物，可損傷甲狀腺濾泡細胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而影響甲狀腺球蛋白的合成與分泌［7－9］。目前關(guān)于SMM代謝產(chǎn)物的液相色譜檢測報道較少［10］，國內(nèi)目前所報道的也僅限于SMM原形藥的殘留檢測且具有不確定性［11］和代謝動力學探討［12］。本研究擬建立方便快捷的色譜學方法，測定SMM哺乳期長期暴露后母體及子代血清SMM及ACSMM含量，為其在特殊人群體內(nèi)暴露的風險評估提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級ICR小鼠（8周齡；雄性體重28～30 g，雌性體重24～26 g）購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（許可證號：SCXK（京）2012－0001）。

1.2 儀器與試劑 島津LC－20A高效液相色譜儀，光電二極管陣列檢測器（PDA－5500）；高速離心機（5417R），德國Eppendorf公司；純水儀（DZG－303A），安徽皖儀科技股份有限公司?；前烽g甲氧嘧啶標準品（CAS：1220－83－3，批號：00817），含量＞98.5%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；N4－乙?；前烽g甲氧嘧啶標準品（CAS：4049－01－8，批號：003－096），含量＞98.9%，上海Carlow化學試劑有限公司；乙腈，色譜純，美國Tedia公司；冰乙酸，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 動物處理 實驗前適應性喂養(yǎng)1周，飲食自由，晝夜均衡，溫度23～25℃，濕度45%～55%。24只雌鼠按雌雄比2∶1交配受孕，孕鼠正常喂養(yǎng)至自然分娩，將母鼠分為對照組、低、中、高劑量暴露組，分娩后第1天母鼠灌胃給予0、10、50和200 mg／kg SMM（溶于生理鹽水），正常飼喂21 d，第22天麻醉母鼠和子鼠后，摘除眼球取血，3500 r／min離心10 min，吸上清，保存于－20℃冰箱，待測。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 Luna C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex Inc，USA）；乙腈：水（含0.2%冰乙酸）＝25∶75為流動相：檢測波長：267 nm（ACSMM）和273 nm（SMM）；流速1 mL／min；柱溫35℃；進樣量20μL。

1.4.2 標準溶液的配制 混合標準溶液：分別準確稱取磺胺間甲氧嘧啶和N4－乙酰化磺胺間甲氧嘧啶0.0100 g，甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，定容至刻度，搖勻，配成各組分質(zhì)量濃度為1mg／mL的混合標準溶液。以流動相稀釋母液配制系列濃度為0.05、0.5、0.625、1.25和2.5μg／mL的標準工作液。由于母鼠體內(nèi)SMM濃度較高，單獨配制5、10、15、20和30μg／mL的標準系列濃度。

1.4.3 樣品前處理 吸取0.2 mL血清于2 mL離心管中，加入0.6 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，超聲輔助提取10min，再渦旋振蕩1min，15000 r／min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾，收集濾液待測。

1.5 方法學考察

1.5.1 標準曲線 取空白血清加入適量SMM和ACSMM標準溶液，得混合液系列濃度：0.05、0.5、0.625、1.25和2.5μg／m L，進行HPLC分析后，以峰面積為縱坐標，系列標準濃度為橫坐標，進行線性回歸分析。僅作母鼠體內(nèi)SMM含量測定的單個標準品添加濃度系列為5、10、15、20和30μg／m L。

1.5.2 精密度與回收率 空白血清添加SMM和ACSMM標準品，使混合物終濃度為0.5、1.0和2.5μg／mL，每個濃度重復3個樣品，然后以1.4.3項樣品處理方法進行前處理及測定，依據(jù)標準曲線，計算實測濃度、回收率和精密度。

1.5.3 靈敏度 通過加標試驗，以0.5μg／mL的添加濃度進樣3次，以信噪比RSN等于10來計算最低定量限（LOQ），以RSN等于3計算最低檢測限（LOD）。

2 結(jié)果

2.1 方法學驗證

2.1.1 檢測波長的選擇 用200～400 nm檢測波長對2.5μg／mL的混合標準液進行了掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個化合物最大吸收波長并不一致，為了提高方法的靈敏度，保證目標化合物都能在各自最大吸收波長下檢測，因此實驗采用多波長檢測，由圖1可以看出，SMM最大吸收波長是273 nm，ACSMM最大吸收波長是267 nm。

圖1 SMM（左）和ACSMM（右）的最大吸收波長光譜圖

2.1.2 色譜條件的選擇 在1.4.1項條件下，SMM和ACSMM標準品和血清添加均得到了很好的分離，前者保留時間為9.105 min，后者為7.834 min（圖2）。

圖2 SMM和ACSMM標準品色譜圖（濃度2.5μg／m L）

圖3 空白小鼠血清色譜圖

圖4 小鼠血清添加SMM和ACSMM混合標準品（0.5μg／m L）色譜圖

2.1.3 樣品提取 經(jīng)過反復試驗，用0.6 mL乙腈一次提取，可將目標分析物提取出來，且小鼠空白血清和標準品添加色譜圖比較，分離度較好，目標色譜峰處無干擾（圖3～圖5）。

2.1.4 標準曲線 線性回歸方程分別為：SMM：y＝87230x－4292.3，r2＝0.9993；y＝35624x＋27528（r2＝0.9989，僅用于母鼠體內(nèi)SMM計算）；ACSMM：y＝82870x－724.33，r2＝0.9974。在實驗初期，用一條混合標準添加濃度做標準曲線時，由于SMM及代謝物在母鼠和仔鼠濃度范圍跨度較大，為兼顧代謝物計算的誤差產(chǎn)生，通過繪制雙標準曲線來計算目標物濃度。從上述數(shù)據(jù)可看出本方法在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度和回收率 經(jīng)過3次添加回收率測定，方法的回收率SMM：85.8%～110.2%，ACSMM：88.2%～106.3%，精密度（RSD%）均小于8.3%，可以用于檢測血清中的SMM和ACSMM。

2.1.6 方法靈敏度 經(jīng)信噪比測試，靈敏度值如下：SMM，LOD＝0.012μg／mL，LOQ＝0.023μg／mL；ACSMM，LOD＝0.018μg／mL，LOQ＝0.042μg／mL。表明該測定方法的靈敏度較好。

2.2 樣品測定 利用本法，對1.3項的血清樣品進行測定，SMM及ACSMM濃度見表1。

圖5 小鼠實際樣品血清色譜圖

表1 母鼠和子鼠血清SMM和ACSMM濃度（s，n＝6）

表1 母鼠和子鼠血清SMM和ACSMM濃度（s，n＝6）

組別 SMM／（μg·mL－1）ACSMM／（μg·mL－1）母鼠子鼠母鼠子鼠SMM 0 mg／kg 0 0 0 0 SMM 10 mg／kg 3.28±0.74 0.49±0.09 0.13±0.02 0.06±0.07 SMM 50 mg／kg 10.82±0.66 0.80±0.16 0.77±0.14 0.48±0.12 SMM 200 mg／kg 24.79±3.92 1.97±0.81 1.72±0.30 0.77±0.29

由表1可知，對照組未檢出SMM及ACSMM，當母鼠SMM灌胃劑量以倍數(shù)增加時，母鼠和子鼠血清的SMM和ACSMM并不以倍數(shù)關(guān)系增加。

3 討論與小結(jié)

本文建立了長效獸藥磺胺間甲氧嘧啶及其乙?；x物的高效液相色譜耦合二極管陣列檢測器的快速檢測方法。本法采用乙腈直接沉淀蛋白，超聲輔助提取，既加快了預處理的速度，又縮短了SMM及ACSMM提取的時間，且雜質(zhì)干擾較小。本方法的優(yōu)勢在于所用儀器、試劑、前處理方法均較簡單、常見。試驗中曾用二氯甲烷提取時，血清中脂肪漂浮在提取溶劑表面，傾倒困難；使用偏磷酸－甲醇作提取溶劑，由于含有大量的水分，造成減壓蒸餾耗時費力；使用乙酸乙酯提取效率最高，但提取的組織內(nèi)源性物質(zhì)也最多，凈化較困難；本實驗也嘗試用waters HLB固相萃取小柱凈化，盡管樣品基質(zhì)的去除較為滿意，但是ACSMM的回收率偏低。最后采用乙腈作提取溶劑，提取效率較高，再輔助超聲提取，可獲得滿意的回收率，另外用乙腈提取時共提的雜質(zhì)也較少。

方法的精密度和準確度均能夠滿足SMM及其代謝物ACSMM的限量檢測要求，且具有較高的實用性，有利于推廣普及，為后續(xù)研究食品中磺胺類獸藥殘留的檢測提供了基礎(chǔ)。Furusawa報道了SMM及代謝物在雞血漿中的測定，其血清標準添加的高濃度回收率均小于90%，而精密度與本實驗基本相同。就ACSMM測定的靈敏度而言，本實驗最低定量限低于報道的色譜學方法（0.09μg／mL）［13］。

SMM在人體內(nèi)為長效類藥物，口服半衰期超過24 h，而SMM有效血藥濃度維持時間在動物體內(nèi)差異很大，多數(shù)消除半衰期維持在2～7 h［14］。從本實驗的濃度數(shù)據(jù)可以看出，盡管母鼠暴露高劑量的SMM，但是ACSMM在母子鼠體內(nèi)濃度較低，而且原形藥濃度也較低。本實驗中ICR小鼠長期暴露SMM后測得的母鼠和子鼠血清中的SMM及ACSMM含量，提示SMM在人和動物體內(nèi)代謝的差異很大，在磺胺類獸藥進行安全風險評估時要考慮種屬間的差異。

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（編輯：侯向輝）

Determ ination of Sulfamonomethoxine and Its N4－acetyl M etabolite in M ice Serum by HPLC

ZHANG Qiang，ZHAGN Dan，LIU Ye－h(huán)ao，SHENG Jie，CHENWen－jun，WANG Guo－xiu，LIU Kai－yong?
（School of Public Health，AnhuiMedical University，Hefei 230601，China）

Determination of sulfamonomethoxine（SMM）and N4－acetyl metabolite（ACSMM）in ICR mice exposed to SMM during lactation.The lactational mice were orally administered with SMM（0，10，50，200 mg／（kg·d）for 21 d，the mice were anesthetized and then taken blood by removalling eyeball.Following serum protein precipitation with acetonitrile，the ultrasonic－assisted extraction of the targets，separation of them were carried out on a reversed－phase C18（250 mm×4.6mm，5μm）column，themobile phase was involved in acetonitrile and 0.2%acetic acid in water，the flow rate was 1 mL／min and the column temperature was 35℃，the high performance liquid chromatographywas coupled with a diode array detector，detection wavelength of SMMand ACSMM were 273 and 267 nm respectively，and quantified with external standard method.The recoveries of SMM and ACSMM spiked in serum were 85.8%～110.2%，RSD s less than 8.3%were obtained，the linear range was 0.05～2.5μg／mL，but 5～30μg／mL suitable for SMM in the dams，and showed a good linear relationship（r2＞0.990）.The limit of quantitation（LOQ）was 0.023 and 0.042μg／mL respectively.This method was sensitive，rapid，accurate，can be used for the determination of SMM and ACSMM in serum.

sulfamonomethoxine；N4－acetyl sulfamonomethoxine；high performance liquid chromatography；diode array detector

2014－12－01

A

1002－1280（2015）02－0027－05

S859.83

國家自然科學基金項目（81202209）；安徽省高等學校優(yōu)秀青年人才基金（2012SQRL075ZD）；安徽醫(yī)科大學中青年學術(shù)骨干資助基金（2012051）

張強，碩士在讀，從事食品衛(wèi)生學研究。

劉開永。E－mail：liukaiyong163＠163.com