干細(xì)胞樣U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及VEGFR2人源化單克隆抗體的干預(yù)作用

宣自學(xué)，張 琦，李琳娜，原 野，徐誠(chéng)望，楊德宣，王珊珊，袁守軍

(1.浙江省人民醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 杭州 310014；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥理毒理研究室，北京 100850；3.山東步長(zhǎng)神州制藥有限公司，山東 菏澤 274000)

干細(xì)胞樣U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及VEGFR2人源化單克隆抗體的干預(yù)作用

宣自學(xué)1,2，張 琦2，李琳娜2，原 野3，徐誠(chéng)望2，楊德宣2，王珊珊2，袁守軍2

(1.浙江省人民醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 杭州 310014；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥理毒理研究室，北京 100850；3.山東步長(zhǎng)神州制藥有限公司，山東 菏澤 274000)

目的 建立干細(xì)胞樣U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化模型，初步評(píng)價(jià)抗VEGFR2人源化單克隆抗體對(duì)轉(zhuǎn)分化的影響。方法 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得干細(xì)胞樣U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞；流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133+細(xì)胞含量；定量PCR檢測(cè)CD133、Nestin以及VEGFR2表達(dá)；觀察干細(xì)胞樣U87細(xì)胞的致瘤能力、腫瘤生長(zhǎng)速度和CD31表達(dá)情況；觀察干細(xì)胞樣U87細(xì)胞在Matrigel上血管狀結(jié)構(gòu)形成和CD31、CD34、vWF表達(dá)情況；建立干細(xì)胞樣U87細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化模型，評(píng)價(jià)抗VEGFR2人源單抗對(duì)轉(zhuǎn)分化的抑制作用。結(jié)果 獲得干細(xì)胞球樣的U87細(xì)胞，其腫瘤生長(zhǎng)更快，且血管增多，接種在Matrigel上形成血管狀結(jié)構(gòu)，CD31、CD34、vWF表達(dá)增加； 抗VEGFR2人源單抗使血管狀結(jié)構(gòu)和CD31、CD34、vWF表達(dá)均減少。結(jié)論 成功建立干細(xì)胞樣U8細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型，VEGFR2人源化單抗對(duì)轉(zhuǎn)分化有抑制作用。

干細(xì)胞樣U87細(xì)胞；Matrigel膠；內(nèi)皮細(xì)胞；轉(zhuǎn)分化；VEGFR2；血管狀結(jié)構(gòu)

腫瘤血管為腫瘤生長(zhǎng)提供足夠的氧分和營(yíng)養(yǎng)，靶向腫瘤血管生成可以達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[1]。目前靶向VEGF的藥物在臨床上已經(jīng)展現(xiàn)出很好的抗腫瘤作用，但該信號(hào)通路只能暫時(shí)地被抑制，一旦藥物撤除，信號(hào)通路會(huì)重新激活，腫瘤組織迅速建立血供，生長(zhǎng)速率有時(shí)會(huì)更快[2]。隨著研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)顯示，腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)的異質(zhì)性和可塑性導(dǎo)致其功能的多樣性，可通過(guò)多種方式為腫瘤生長(zhǎng)提供各種需求[3]，在腫瘤血管新生過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用[4]。

研究發(fā)現(xiàn)[5]，腫瘤干細(xì)胞不僅可以通過(guò)產(chǎn)生大量的血管生成因子如VEGF、SDF-1/CXCR4和HIF，“引誘”血管延伸向自己靠攏，而且在許多因子的參與下，通過(guò)構(gòu)建腫瘤細(xì)胞間通道，形成血管擬態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管的生成。此外，腫瘤干細(xì)胞還能夠直接通過(guò)轉(zhuǎn)分化成為血管內(nèi)皮細(xì)胞，構(gòu)成腫瘤新生血管的主要部分(Fig 1A)，從而在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要角色[6]。例如，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)發(fā)生染色體變異的內(nèi)皮細(xì)胞是由腫瘤干細(xì)胞分化而來(lái)；在血管較豐富的神經(jīng)膠質(zhì)瘤內(nèi)部，70%的內(nèi)皮細(xì)胞都是由腫瘤干細(xì)胞分化而產(chǎn)生的[7]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，位于血管周圍微環(huán)境中膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，經(jīng)歷間質(zhì)分化生成血管周細(xì)胞，支持血管的功能和腫瘤的生長(zhǎng)[8]。為了研究腫瘤血管形成的來(lái)源及機(jī)制，我們體外低黏附、干細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)獲得干細(xì)胞樣U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并且在Matrigel上建立膠質(zhì)瘤干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的體外模型[9]。

VEGFR2在CD133陽(yáng)性的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞上高表達(dá)，影響著膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的活性、自我更新能力、致瘤性[10]，而且可能調(diào)控著膠質(zhì)瘤干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過(guò)程。因此我們以VEGFR2人源化單克隆抗體為例，利用建立的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型，研究藥物對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料Matrigel膠(BD公司)，RPMI 1640 培養(yǎng)基(Hyclone)，Accutase Solution(Millipore公司)，BD cell recovery solution(BD公司)，TRIzol(Sigma公司)，2×qPCR Mix(北京康為世紀(jì)生物有限公司)，F(xiàn)BS(Hyclone)，DMEM/F12(1 ∶1)培養(yǎng)基(Gibco公司)，表皮生長(zhǎng)因子EGF、堿性成纖維生長(zhǎng)因子bFGF(PeproTeth公司)，細(xì)胞因子B27 Supplement (Gibco公司)，CD133-PE流式抗體(美天旎公司)，抗VEGFR2人源化單克隆抗體(山東步長(zhǎng)神州制藥有限公司)，U87細(xì)胞(中國(guó)協(xié)和細(xì)胞庫(kù))，Hera cell-50 CO2氣體培養(yǎng)箱，YT-CJ-1ND型超凈工作臺(tái)，超低黏附6 孔培養(yǎng)板、普通6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司)，AMG EVOS XL顯微鏡(AMG公司)，GUAVA流式細(xì)胞儀(Millipore 公司)，實(shí)時(shí)定量PCR儀(安捷倫Mx3005P)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的獲取 普通U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞用10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)，傳至三代后，消化收集細(xì)胞，接種在含DMEM/F12(1 ∶1) 無(wú)血清培養(yǎng)基的超低黏附6 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)基中另外添加終濃度為20 μg·L-1bFGF，20 μg·L-1EGF，5 kU·L-1胰島素，2% B27 等成分，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞呈懸浮狀生長(zhǎng)，并且相互聚集成干細(xì)胞球樣，開(kāi)始兩周，每4～5天用Accutase Solution消化分散成單個(gè)細(xì)胞，傳代，然后讓其成球生長(zhǎng)直至足夠大小[11]。

1.2.2 U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的驗(yàn)證 利用AMG EVOS XL顯微鏡照相，觀察U87干細(xì)胞成球情況。然后將球樣U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞用Accutase Solution消化分散成單個(gè)細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，一部分細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的表達(dá)；另外一部分細(xì)胞用于提取RNA后定量PCR檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)基因CD133、Nestin以及VEGFR2的表達(dá)情況，并且與普通培養(yǎng)的U87細(xì)胞作比較[12]。

1.2.3 U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞成瘤實(shí)驗(yàn) Nu/ Nu鼠，雌性，體質(zhì)量18～22 g，6～8周齡，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)買。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-001。將超低黏附培養(yǎng)獲得的干細(xì)胞球樣U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞用Accutase Solution消化分散成單個(gè)細(xì)胞，普通條件下培養(yǎng)的U87細(xì)胞用胰酶消化，離心重懸、計(jì)數(shù)后，均按照細(xì)胞懸液濃度為每只2×106接種到每只Nu/Nu鼠右腋皮下，建立荷瘤鼠模型[13]，每組5只裸鼠。觀察普通條件下U87細(xì)胞和低黏附培養(yǎng)獲得的干細(xì)胞球樣U87細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)情況，4周后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，將動(dòng)物后頸部脫臼處死，剝離瘤塊用于拍照、稱重，然后儲(chǔ)存在4%甲醛溶液中，以備HE染色和CD31免疫組化染色。

1.2.4 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型的建立 將Matrigel基質(zhì)膠放于4℃進(jìn)行解凍，并且將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板和200μl槍頭放于冰上預(yù)冷，培養(yǎng)板每孔均勻鋪入150 μl Matrigel，然后置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。將獲得的U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞用Accutase Solution消化成單個(gè)細(xì)胞后，離心計(jì)數(shù)，以3×107接種至鋪有Matrigel的6孔板中，12小時(shí)后，照相觀察微管狀結(jié)構(gòu)形成情況，并且利用BD cell recovery solution回收Matrigel上的細(xì)胞，提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，qPCR檢測(cè)CD31、CD34、vWF等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)情況[11]。普通條件培養(yǎng)的U87細(xì)胞也按照上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較兩種細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物基因CD31、CD34、vWF表達(dá)量的差別。

1.2.5 抗VEGFR2人源化單抗對(duì)U87干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的干預(yù)作用 按照上面方法接種干細(xì)胞樣U87細(xì)胞(3.5×107)至Matrigel建立轉(zhuǎn)分化模型，然后將實(shí)驗(yàn)分為3組，包括空白對(duì)照組、抗VEGFR2人源化單抗50 mg·L-1組、抗VEGFR2人源化單抗200 mg·L-1組，每組重復(fù)3孔。處理后，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察藥物對(duì)微管狀結(jié)構(gòu)的影響，最后用BD cell recovery solution回收Matrigel上的細(xì)胞，qPCR檢測(cè)CD31、CD34、vWF基因的表達(dá)變化。

1.2.6 RT-qPCR 按照TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，取2×qPCR Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL和DNA模板1 μL，然后加DEPC水至20 μL?；靹蚝?，置于qPCR儀中，95℃變性10 min，然后經(jīng)95℃變性30 s，60℃退火30 s，共39個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增。最后統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，觀察各基因的變化情況。實(shí)驗(yàn)中涉及的各基因引物：Actin上游引物5′-TTCCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3′，下游引物5′-GAGGAGCAATGATCTTGATCTTCA-3′；CD133上游引物5′-AGGCACTTACGGCACTCTTC-3′，下游引物5′-TTTCTTCCTGCTGCACCCAA-3′；Nestin上游引物5′-CTGGAGCAGGAGAAACAGGG-3′，下游引物5′-CTGAGGGAAGTCTTGGAGCC-3′；VEGFR2上游引物5′-CCAGGCAACGTAAGTGTTCGAG-3′，下游引物5′-GGGACCCACGTCCTAAACAAAG-3′；CD31上游引物5′-CCAGTGTCCCCAGAAGCAAA-3′，下游引物5′-TGATAACCACTGCAATAAGTCCTTTC-3′；CD34上游引物5′-ACGGCCATTCAGCAAGACAAC-3′，下游引物5′-GCACGTGGTCAGATGCAGAGA-3′；vWF上游引物5′-AGCCCATTTGCTGAGCCTTG-3′，下游引物5′-CCTGGCACCATGCATTTCTG-3′。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的繪圖，用Student′st檢驗(yàn)進(jìn)行組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 U87干細(xì)胞球的形成將普通U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞消化收集細(xì)胞后，接種于超低黏附6 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。 結(jié)果顯示，細(xì)胞相互聚集成干細(xì)胞球樣，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，干細(xì)胞球越來(lái)越大(Fig 1B)。提示低黏附培養(yǎng)能夠獲得干細(xì)胞球樣的U87細(xì)胞。

Fig 1 Trans-differnetiation of cancer stem cells and establishment of stem-like U87

A: Cancer stem cells trans-differentiate to endothelial cells; B: Establishment of stem-like U87 spheres

2.2 U87干細(xì)胞的干性驗(yàn)證用Accutase Solution將上述獲得U87干細(xì)胞球樣細(xì)胞消化分散成單個(gè)細(xì)胞，CD133流式抗體標(biāo)記后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞樣的U87細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志物CD133表達(dá)量為31.82%，與普通培養(yǎng)的U87細(xì)胞相比，CD133表達(dá)量明顯增加(Fig 2)。

Fig 2 Morphology and CD133 expression of U87 cells, stem-like U87 spheres

分別收集普通培養(yǎng)的U87細(xì)胞和低黏附、干細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)的U87干細(xì)胞球樣細(xì)胞，用qPCR檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)基因CD133、Nestin，并且檢測(cè)兩種細(xì)胞VEGFR2基因的差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干細(xì)胞樣U87細(xì)胞CD133、Nestin和VEGFR2的表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 3)，以上結(jié)果提示我們獲得了干細(xì)胞樣的U87細(xì)胞。

Fig 3 The CD133, Nestin, VEGFR2 expression of U87 cells, stem-like U87 spheres using real-time PCR**P<0.01 vs U87 cells

2.3 U87干細(xì)胞成瘤能力將獲得的干細(xì)胞球樣U87細(xì)胞和普通的U87細(xì)胞均以每只2×106細(xì)胞的濃度接種到每只Nu/Nu鼠右腋皮下，建立荷瘤鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞樣U87細(xì)胞和普通培養(yǎng)的U87細(xì)胞均能在小鼠皮下成瘤，但是干細(xì)胞樣U87細(xì)胞長(zhǎng)出的腫瘤生長(zhǎng)比普通培養(yǎng)的U87細(xì)胞的移植瘤更快(P<0.05)(Fig 4A)。d 31干細(xì)胞樣U87細(xì)胞移植瘤的體積為(1 734.60±605.50) mm3，而普通培養(yǎng)的U87細(xì)胞移植瘤的瘤體積只有(875.28±472.67) mm3。將動(dòng)物脫臼處死后取出瘤塊并稱重，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞樣U87細(xì)胞移植瘤的瘤重也明顯增加(P<0.05)，其為(1.68±0.74) g，普通培養(yǎng)的U87細(xì)胞移植瘤的瘤重則為(0.60±0.38) g(Fig 4B，4C)。

對(duì)兩組腫瘤進(jìn)行HE染色和CD31免疫組化分析，結(jié)果顯示普通培養(yǎng)的U87細(xì)胞和干細(xì)胞樣U87細(xì)胞均能成瘤，且都有CD31標(biāo)記的血管存在。但是干細(xì)胞樣U87細(xì)胞的腫瘤中CD31表達(dá)明顯要多于普通培養(yǎng)U87細(xì)胞腫瘤(Fig 5)。

2.4 干細(xì)胞樣U87細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型建立干細(xì)胞樣U87細(xì)胞(3×1010cells·L-1)接種至鋪有Matrigel的6孔板中，12 h后，用AMG EVOS XL顯微鏡觀察微管狀結(jié)構(gòu)形成情況。Fig 6顯示干細(xì)胞樣U87細(xì)胞在Matrigel上確實(shí)能夠形成血管狀結(jié)構(gòu)。利用BD cell recovery solution回收Matrigel上的細(xì)胞，qPCR檢測(cè)CD31、CD34、vWF等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示接種在Matrigel上的干細(xì)胞樣U87細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志基因CD31、CD34、vWF均表達(dá)量增加(P<0.001)，提示可能干細(xì)胞樣U87細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，形成了內(nèi)皮細(xì)胞(Fig 7B)。

2.5 抗VEGFR2人源化單抗抑制U87干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化建立U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型后，加入抗VEGFR2人源化單抗50、200 mg·L-1，12 h后qPCR檢測(cè)CD31、CD34、vWF表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與接種在Matrigel上且不加藥的細(xì)胞相比，抗VEGFR2人源化單抗50、200 mg·L-1給藥組的微管狀結(jié)構(gòu)明顯減少(Fig 7A)，而且CD31、CD34、vWF基因的表達(dá)都有所降低(P<0.05,Fig 7B)。這些結(jié)果說(shuō)明抗VEGFR2人源化單抗能夠抑制膠質(zhì)瘤U87干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

Fig 4 Tumorigenic assay of U87 cells, stem-like U87 spheres

A: The tumor volume of U87 cells, stem-like U87 spheres; B: The tumor weight of U87 cells, stem-like U87 spheres; C: The tumors of U87 cells, stem-like U87 spheres.**P<0.01vsU87 cells

Fig 5 HE staining and CD31 immunostaining of U87 cells,stem-like U87 spheres xenografts

A: HE staining of U87 cells, stem-like U87 spheres xenografts; B and C: CD31 immunostaining of U87 cells, stem-like U87 spheres xenografts

Fig 6 Stem-like U87 cells developed morphological feature of endothelial cells on Matrigel

3 討論

上世紀(jì)70年代Fulkman[14]提出抑制腫瘤血管形成能夠“餓死”腫瘤的理論。隨后的研究證明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移都離不開(kāi)腫瘤血管的形成，干預(yù)腫瘤血管形成的環(huán)節(jié)或條件均可抑制腫瘤的生長(zhǎng)，例如Bevacizumab(VEGF拮抗劑)在美國(guó)獲批的適應(yīng)癥有結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、復(fù)發(fā)性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤等。2014年4月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)抗VEGFR2單抗ramucirumab上市，主要用于化療失敗的胃癌、胃食管連接處腺癌。apatinib(VEGFR2選擇性抑制劑)即將被CFDA批準(zhǔn)作為晚期胃癌的治療藥物。雖然這些靶向腫瘤血管的藥物在臨床上已經(jīng)展現(xiàn)出較好的治療作用，但仍然會(huì)出現(xiàn)腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，以及藥物不良反應(yīng)等情況[2, 15]，具體原因可能與復(fù)雜的腫瘤血管調(diào)控機(jī)制有關(guān)。近年來(lái)，研究者們發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞與腫瘤血管新生有密切的聯(lián)系，尤其是腫瘤干細(xì)胞能夠通過(guò)轉(zhuǎn)分化方式形成血管內(nèi)皮細(xì)胞，直接參與腫瘤血管的形成[16]。因此在研發(fā)抗血管生成藥物時(shí)，應(yīng)該重視腫瘤干細(xì)胞在血管生成中的作用，通過(guò)選擇性靶向腫瘤干細(xì)胞和腫瘤血管的關(guān)聯(lián)性，從而達(dá)成治療目的。

因此，有必要建立一種簡(jiǎn)單可靠的干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的模型。我們通過(guò)體外誘導(dǎo)獲得干細(xì)胞樣的U87細(xì)胞，然后接種在Matrigel上建立膠質(zhì)瘤干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞樣U87細(xì)胞在Matrigel上確實(shí)能形成血管狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)皮標(biāo)志物基因CD31、CD34、vWF表達(dá)量也均上調(diào)，提示干細(xì)胞樣U87細(xì)胞在該實(shí)驗(yàn)條件下可以轉(zhuǎn)分化形成內(nèi)皮細(xì)胞。干細(xì)胞樣U87細(xì)胞成瘤性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干細(xì)胞樣U87細(xì)胞在Nu/Nu鼠皮下能夠形成腫瘤塊，并且比普通的U87腫瘤生長(zhǎng)的迅速；病理和免疫組化結(jié)果提示，干細(xì)胞樣U87細(xì)胞形成的腫瘤組織中血管比普通U87的腫瘤中血管要豐富和密集。這一結(jié)果也能提示干細(xì)胞樣U87細(xì)胞能夠通過(guò)轉(zhuǎn)分化形成血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而形成血管。

VEGFR2是轉(zhuǎn)導(dǎo)VEGF血管新生信號(hào)的關(guān)鍵受體，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移都起著重要作用。VEGFR2在正常人體組織中呈低水平表達(dá)，而在血管內(nèi)皮細(xì)胞和CD133陽(yáng)性的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中呈高表達(dá)[17]，并且影響著膠質(zhì)瘤干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過(guò)程[18-19]。因此，選擇性靶向VEGFR2或許可以產(chǎn)生很好的治療前景。我們以抗VEGFR2人源化單克隆抗體為受試藥物，發(fā)現(xiàn)抗VEGFR2人源化單抗能夠明顯抑制干細(xì)胞樣U87細(xì)胞在Matrigel上形成血管狀結(jié)構(gòu)，并且下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因CD31、CD34、vWF的表達(dá)。

綜上所述，我們通過(guò)體外誘導(dǎo)獲得干細(xì)胞樣U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，該細(xì)胞能夠在Matrigel上形成血管狀結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)化成內(nèi)皮細(xì)胞，且抗VEGFR2單克隆抗體能夠抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

Fig 7 Effect of anti-VEGFR2 human monoclonal antibody on trans-differentiation

A: Anti-VEGFR2 human monoclonal antibody inhibited the formation of capillary-like structures,A1:Control;A2:50 mg·L-1;A3:200 mg·L-1; B: Anti-VEGFR2 human monoclonal antibody decreased expression of CD31, CD34 and vWF.*P<0.05,**P<0.01vsControl

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Stem cell-like U87 cells trans-differentiating into endothelial cells and inhibition of anti-VEGFR2 human monoclonal antibody

XUAN Zi-xue1,2, ZHANG Qi2, LI Lin-na2, YUAN Ye3, XU Cheng-wang2,YANG De-xuan2, WANG Shan-shan2, YUAN Shou-jun2

(1.DeptofPharmacy,ZhejiangProvincialPeople’sHospital,Hangzhou310014,China; 2.DeptofPharmacologyandToxicology,BeijingInstituteofRadiationMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China;3.ShandongBuchangShenzhouPharmaceuticalCo.Ltd.,HezeShandong274000,China)

Aim To establish the trans-differentiation model of stem cell-like U87 glioma cells into endothelial cells, and evaluate the effect of anti-VEGFR2 human monoclonal antibody on this process. Methods To obtain stem-like cells from U87 cell line, U87 tumor spheres were inducedinvitro, then they were identified by FACS and qPCR, and the tumorigenicity, tumor growth and CD31 vascular density were also detected. Finally, we established the trans-differentiation model to evaluate the effect of anti-VEGFR2 fully human monoclonal antibody. Results Big tumorspheres were formed successfully, an obvious increase of the CD133+ cells was showed by FACS analysis, and the up-regulation of CD133, Nestin and VEGFR2 was further revealed by qPCR assay. Additionally, tumors from stem-like U87 cells grew faster, and the blood vessels increased obviously. When stem-like U87 cells were grown on Matrigel, many tubular networks were observed, and the expression of CD31, CD34 and vWF was significantly increased. Once treated with anti-VEGFR2 human monoclonal antibody, the formation of capillary-like structures was impaired, accompanied by the decrease of CD31, CD34 and vWF. Conclusions The trans-differentiation models of stem-like U87 cells into endothelial cells on matrigel were successfully established; anti-VEGFR2 human monoclonal antibody could inhibit the trans-differentiation of tumor stem cells.

stem cell-like U87 cells; Matrigel; endothelial cells; trans-differentiation; VEGFR2; capillary-like structures

時(shí)間：2015-3-3 11:08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.010.html

2014-11-29,

2014-12-30

國(guó)家科技重大專項(xiàng)-綜合性新藥研究開(kāi)發(fā)技術(shù)大平臺(tái)資助項(xiàng)目(No 2012ZX09301003-001)

宣自學(xué)(1988-)，男，藥劑師，碩士生，研究方向：腫瘤藥理。Tel:010-66931215， E-mail: xuanzixue0222@163.com; 袁守軍(1962-)，男，教授，碩士/博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤藥理與藥物毒理，通訊作者，Tel:010-66930271，E-mail: yuansj@nic.bmi.ac.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.010

A

1001-1978(2015)03-0339-07

R322.12；R329.24；R392.11；R392.12；R730.264