液相色譜能量相關(guān)二級(jí)質(zhì)譜快速鑒定藥物氧化降解產(chǎn)物

賀玖明等

摘 要 基于快速高分辨液相色譜（RRLC）的高分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的全掃描（TOFMS）功能，開展了無需選擇母離子可獲得子離子的能量相關(guān)二級(jí)質(zhì)譜（MSE）分析方法的研究。探討了快速獲取和挖掘復(fù)雜混合物中全面的組分信息，并將本方法應(yīng)用于藥物氧化降解產(chǎn)物的快速分析鑒定。對(duì)莫西沙星原料在30% H2O2中進(jìn)行氧化降解，采用RRLC進(jìn)行分離，分別設(shè)定高低碰撞能量的TOFMS實(shí)驗(yàn)采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用質(zhì)量虧損過濾（MDF）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲取母離子與碎片離子等質(zhì)譜信息，從而了解藥物降解雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)及相對(duì)含量。本方法為藥物雜質(zhì)分析和藥品質(zhì)量控制提供了新穎且高效的分析思路及手段。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用；串聯(lián)質(zhì)譜；藥物降解產(chǎn)物；結(jié)構(gòu)分析；質(zhì)量虧損過濾

1 引 言

藥物雜質(zhì)與藥品質(zhì)量、安全性密切相關(guān)，而且多數(shù)雜質(zhì)具有潛在的生物活性，其性質(zhì)與含量水平是藥品臨床使用中不良反應(yīng)的重要因素之一[1，2]。因此，雜質(zhì)研究及質(zhì)量控制是藥品安全保證的關(guān)鍵要素[2]，研發(fā)出適用于原料藥中的工藝雜質(zhì)和藥物降解產(chǎn)物的快速分析鑒定的新技術(shù)、新方法是提高藥品質(zhì)量安全的重要手段和保障。

近年來，新技術(shù)新方法的發(fā)展對(duì)藥物分析起到了重要的推動(dòng)作用。超高壓液相色譜（UPLC）[3，4]或快速高分辨液相色譜系統(tǒng)（RRLC）[5]與常規(guī)的高效液相色譜（HPLC）技術(shù)相比，大大提高了分析速度和分離能力，HPLC與串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS，MSn）的聯(lián)用技術(shù)也已廣泛應(yīng)用于新藥研發(fā)和藥物質(zhì)量控制的分離與快速分析[6～9]。利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行混合物成分的快速分析時(shí)，碎片離子或子離子能提供關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)信息。常用的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)主要有選擇母離子的碰撞誘導(dǎo)裂解（CID）和數(shù)據(jù)依賴性掃描（DDA和IDA）等。LCMS/MS技術(shù)在一次分析周期內(nèi)無法同時(shí)設(shè)置太多的CID掃描，且對(duì)未知多組分混合物需要進(jìn)行多次LCMS/MS分析。而DDA或IDA的掃描方式由于需要設(shè)置CID實(shí)驗(yàn)的激發(fā)閾值，如果該值太高會(huì)丟失混合物中低含量組分的結(jié)構(gòu)信息，而太低則高含量組分有可能得不到理想的MS/MSCID譜。

本研究基于RRLC的高分離能力和空間串聯(lián)質(zhì)譜儀的全掃描（TOFMS）功能，開展了無需選擇母離子可獲得碎片離子的能量相關(guān)二級(jí)質(zhì)譜[10～13]（MSE）分析方法研究，并采用質(zhì)量虧損過濾[14]（Mass Defect Filter，MDF）從對(duì)復(fù)雜混合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并應(yīng)用于藥物降解雜質(zhì)的快速分析鑒定。研究表明，本方法可以簡便、快速地獲得混合物體系中藥物雜質(zhì)的母離子與子離子信息，從而為藥物雜質(zhì)分析和藥品質(zhì)量控制提供一種新穎且高效的分析手段。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

液相色譜分離采用Agilent 1200 RRLC高效液相色譜儀 （Agilent Technologies， Waldbronn， Germany）；質(zhì)譜分析采用QSTAR Elite型四級(jí)桿飛行時(shí)間（Q/TOF）串聯(lián)質(zhì)譜儀（AB SCIEX， USA），配有電噴霧離子源（ESI），數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為Analyst QS 2.0。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，Merk，德國）；水（娃哈哈純凈水）。所有液相色譜用溶劑均經(jīng)抽濾、超聲脫氣處理（津騰公司濾膜：水相，0.22 μm；有機(jī)相，0.22 μm）。藥物鹽酸莫西沙星（Matrix Scientific， USA， 047902），30% H2O2（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120513）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

色譜條件：Agilent 1200型RRLC液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器，二元梯度泵，在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器； 色譜柱為Agilent ZOBAX SBC18 （150 mm × 4.6 mm， 5 μm，Agilent，USA）； 以甲醇（A）和0.3%甲酸（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：初始流動(dòng)相平衡10 min； 0～10 min，5% 甲醇； 10～20 min，5%～22%甲醇； 20～23 min，22%～36%甲醇； 23～35 min，36%～38% 甲醇； 35～45 min，38%～70% 甲醇； 45～55 min，70%～80% 甲醇。流速為1.0 mL/min； 紫外吸收檢測波長為190～400 nm； 柱溫設(shè)定30 ℃。

質(zhì)譜條件：采用Q/TOF型串聯(lián)質(zhì)譜儀正離子的TOFMS全掃描對(duì)莫西沙星的降解產(chǎn)物進(jìn)行分析。檢測條件如下： 噴霧電壓（SV）： +5.5 kV； 解簇電壓（DP）：+40 V； 入口電壓（EP）：+9 V； 離子源溫度：400 ℃； 霧化氣（GS1）：50 arb； 干燥氣（GS2）：50 arb。碰撞能量（CE）：+10 eV/+35 eV。質(zhì)譜采集范圍100～1000 Da，每秒采集1張譜圖。Q/TOF型串聯(lián)質(zhì)譜儀分辨率高于10000（半峰寬）。使用的各種氣路均為氮?dú)?。?shù)據(jù)處理與信息挖掘采用軟件PeakView 1.2（AB SCIEX， USA）。質(zhì)量虧損過濾（MDF）參數(shù)如下：Defect設(shè)為179.5 mDa，Defect Tolerance 設(shè)為 30 mDa， Mass range設(shè)為350～500 Da。

供試品和空白對(duì)照溶液的制備：稱取鹽酸莫西沙星適量，加入適量30%雙氧水，制得濃度為2.5 g/L的溶液，避光放置7天進(jìn)行氧化降解； 取適量降解后的溶液加水稀釋至50 μg/mL（以原莫西沙星計(jì)），作為供試品溶液。以30%雙氧水作為溶劑，隨行制備空白對(duì)照溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 能量相關(guān)二級(jí)質(zhì)譜MSE分析方法的建立

能量相關(guān)二級(jí)質(zhì)譜（MSE）分析方法是一種基于UPLC、RRLC與MS/MS聯(lián)用技術(shù)的質(zhì)譜全掃描（TOFMS）功能，通過設(shè)定兩個(gè)不同碰撞能量的全掃描質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)，同時(shí)獲得所含組分的母離子與子離子信息[11～14]。通過低碰撞能量的實(shí)驗(yàn)1（Exp 1）獲得分子離子峰； 通過高碰撞能量的實(shí)驗(yàn)2（Exp 2），不經(jīng)Q1選擇，將各組分同時(shí)送入碰撞室進(jìn)行碎裂，以獲得所有同時(shí)流出組分的碎片及結(jié)構(gòu)信息。當(dāng)混合物經(jīng)液相色譜分離后，進(jìn)入離子源實(shí)現(xiàn)離子化，所有離子全部通過四極桿分析器Q1（MS1），在低碰撞能量下（Low CE），直接通過碰撞室（Q2）而不發(fā)生碎裂，進(jìn)入分析器2（MS2）分析，可以獲得分子離子峰； 當(dāng)在高碰撞能量下（High CE），離子在碰撞室（Q2）發(fā)生碎裂，經(jīng)分析器2分析，獲得碎片離子信息。在整個(gè)液相色譜分離洗脫時(shí)間內(nèi)，低、高碰撞能量下循環(huán)進(jìn)行質(zhì)譜測定； 數(shù)據(jù)處理時(shí)，在相同保留時(shí)間內(nèi)獲得分別為低、高CE值的質(zhì)譜圖。

3.2 RRLCMSE方法在藥物雜質(zhì)分析中的應(yīng)用

采用上述RRLCMSE方法，對(duì)莫西沙星（Moxifloxacin）的氧化氧化降解產(chǎn)物進(jìn)行分析研究。將莫西沙星原料藥在H2O2條件下加速氧化制得供試品，并以相應(yīng)的溶劑作為空白對(duì)照，采用RRLCMSE方法對(duì)其進(jìn)行分析。圖1a 和1b分別為在紫外檢測波長294～296 nm獲得的色譜圖和質(zhì)譜100～1000 Da范圍內(nèi)檢測獲得的總離子流圖。根據(jù)相應(yīng)的質(zhì)譜圖判斷，在保留時(shí)間21.69 min的最強(qiáng)色譜峰為主成分莫西沙星。對(duì)于雜質(zhì)而言，在保留時(shí)間9.96 min的雜質(zhì)色譜峰可以被清楚地觀察到； 但其它低含量的雜質(zhì)，因背景離子強(qiáng)度太高，不能直接識(shí)別。

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