環(huán)境濃度下磺胺混合物對(duì)秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)生長(zhǎng)、飲食、抗氧化酶及其調(diào)控基因表達(dá)水平的影響

梁爽，于振洋，尹大強(qiáng)

同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 長(zhǎng)江水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200092

環(huán)境濃度下磺胺混合物對(duì)秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)生長(zhǎng)、飲食、抗氧化酶及其調(diào)控基因表達(dá)水平的影響

梁爽，于振洋*，尹大強(qiáng)

同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 長(zhǎng)江水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200092

磺胺類藥物在環(huán)境中的普遍殘留引起了人們對(duì)其潛在效應(yīng)的擔(dān)憂。因?yàn)榛前坊旌衔锏男?yīng)不能通過單個(gè)物質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，所以需要針對(duì)混合物效應(yīng)開展深入研究。將秀麗線蟲暴露于4種常用磺胺藥物(磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲噁唑和磺胺甲嘧啶)組成的、環(huán)境濃度水平(0.01 mg·L-1)的混合物后，對(duì)生長(zhǎng)調(diào)控基因dbl-1和egl-4，飲食調(diào)控基因eat-2和eat-18，過氧化氫酶(CAT)編碼基因ctl-2和ctl-3，壽命調(diào)控基因sir-2，以及凋亡調(diào)控基因ced-4的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。暴露組與空白對(duì)照組的結(jié)果比較表明，秀麗線蟲dbl-1表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化(下調(diào)3%)，egl-4表達(dá)下調(diào)18%，解釋了生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)(抑制率為15.6%)。eat-2和eat-18的表達(dá)水平下調(diào)幅度相似，介于20%～22%之間，該幅度高于飲食的抑制效應(yīng)(10.7%)。ctl-2和ctl-3的表達(dá)水平上調(diào)，分別比空白對(duì)照組高101%與66%，該幅度顯著小于0.01 mg·L-1磺胺混合物暴露對(duì)CAT活性的刺激效應(yīng)(比空白對(duì)照組高789.5%)。此外，sir-2的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化，與線蟲壽命沒有受到顯著影響相一致。同時(shí)，ced-4表達(dá)上調(diào)32%，預(yù)示凋亡水平的顯著增加。egl-4、eat-2、ctl-2和ced-4基因表達(dá)水平的顯著變化分別表明磺胺混合物對(duì)β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)，煙酰乙酰膽堿受體(nAChR)、抗氧化系統(tǒng)以及細(xì)胞凋亡等多個(gè)方面的產(chǎn)生影響。

磺胺混合物；秀麗線蟲；β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；煙酰乙酰膽堿受體；過氧化氫酶；凋亡；環(huán)境濃度

磺胺類抗生素普遍用于治療養(yǎng)殖動(dòng)物，并占據(jù)了當(dāng)今抗生素用量中的較大比例。然而，由于人類對(duì)該類藥物的濫用、動(dòng)物體內(nèi)的不完全代謝以及污水處理環(huán)節(jié)中的不完全處理導(dǎo)致這些抗生素在各種環(huán)境媒介中普遍殘留[1]。為了評(píng)價(jià)磺胺抗生素的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，學(xué)者們逐步展開該類抗生素對(duì)非靶生物的毒性研究。據(jù)報(bào)道，磺胺抗生素可抑制甲殼蟲的運(yùn)動(dòng)和生殖[2-3]，影響線蟲的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)行為[4]，并且能夠影響斑馬魚胚胎的同步運(yùn)動(dòng)、心跳以及孵化等生長(zhǎng)發(fā)育過程[5]。然而，實(shí)際環(huán)境中的磺胺類污染物多以混合物形態(tài)存在[1]，因此單個(gè)物質(zhì)的效應(yīng)研究并不能夠直接表征這一類藥物的環(huán)境效應(yīng)。

鑒于環(huán)境中污染物混合物的普遍存在性，近來(lái)對(duì)磺胺混合物效應(yīng)的關(guān)注不斷增加[6]。研究表明，磺胺及其前驅(qū)物(甲氧芐氨嘧啶)對(duì)海洋發(fā)光菌會(huì)產(chǎn)生急性拮抗抑制效應(yīng)[7]。含有磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲嘧啶的混合物對(duì)線蟲的死亡會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，對(duì)倒退運(yùn)動(dòng)和體長(zhǎng)的抑制效應(yīng)呈現(xiàn)拮抗效應(yīng)[8]。這些基于受試生物表觀指標(biāo)毒性作用的研究表明磺胺抗生素混合物效應(yīng)不能夠簡(jiǎn)單地通過單個(gè)物質(zhì)的毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)，需要繼續(xù)開展混合物效應(yīng)研究，并需利用分子水平指標(biāo)(如基因表達(dá)水平等)對(duì)表觀效應(yīng)予以闡述。

秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)的生長(zhǎng)、飲食等多種指標(biāo)可廣泛用于各種化學(xué)物質(zhì)的毒性研究[9-10]。而且，秀麗線蟲也適合進(jìn)行基因表達(dá)水平的檢測(cè)，該指標(biāo)不僅可以作為新的生物標(biāo)志物，而且也可以用于闡明毒性機(jī)理[11]。在生長(zhǎng)調(diào)控基因中，egl-4在β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)的上游發(fā)揮作用，調(diào)控器官功能和細(xì)胞體積[12]；同時(shí)，dbl-1通過TGF-β的Sma/Mab途徑發(fā)揮作用，這是秀麗線蟲身體大小的主要調(diào)控途徑[13]eat-2參與到煙堿乙酰膽堿受體(nAChR)途徑中發(fā)揮作用[14]，eat-18與煙堿受體相關(guān)[15]，這2種基因通過調(diào)控咽喉泵動(dòng)調(diào)節(jié)飲食行為。與此同時(shí)，環(huán)境生物的抗氧化能力，例如過氧化氫酶(CAT)，能夠指示其在環(huán)境脅迫存在下的響應(yīng)與適應(yīng)能力。秀麗線蟲體內(nèi)ctl-2編碼的CTL-2蛋白主要在腸上皮細(xì)胞的過氧化物酶體中表達(dá)[16]，ctl-3編碼的CTL-3主要在咽喉肌肉以及神經(jīng)細(xì)胞體中表達(dá)(http://www.wormbase.org)。通過對(duì)ctl-2與ctl-3基因表達(dá)水平的檢測(cè)，還能夠指示該抗氧化響應(yīng)的潛在位點(diǎn)。此外，一個(gè)生物體的壽命和凋亡能夠表征其在多變環(huán)境中的適應(yīng)性和生存能力，線蟲體內(nèi)的sir-2和ced-4分別參與調(diào)控壽命[17]和凋亡[18]。然而，目前尚沒有證據(jù)表明上述基因能夠?qū)前坊旌衔镉兴憫?yīng)，其中機(jī)理需進(jìn)一步研究。

本研究將秀麗線蟲(C.elegans)暴露于環(huán)境濃度水平[1]的4種常用磺胺組成的混合物，然后進(jìn)行dbl-1、egl-4、eat-2、eat-18、ctl-2、ctl-3、sir-2和ced-4的表達(dá)水平，并且進(jìn)行線蟲生長(zhǎng)和飲食的檢測(cè)，從而將基因表達(dá)水平結(jié)果與表觀效應(yīng)相關(guān)聯(lián)。本研究的發(fā)現(xiàn)能夠?yàn)榛前坊旌衔镄?yīng)提供基因表達(dá)水平的生物標(biāo)志物，且能為研究磺胺對(duì)非靶生物的毒性機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 磺胺抗生素

含有磺胺嘧啶(SD,CAS RN: 68-35-9,C10H10N4O2S,≥99.0%,Sigma Aldrich,USA)、磺胺吡啶(SP,144-83-2,C11H11N3O2S,≥99.0%,Sigma Aldrich,USA)、磺胺甲噁唑(SMX,723-46-6,C10H11N3O3S,≥98.0%,Sigma Aldrich,USA)和磺胺甲嘧啶(SMZ,57-68-1,C12H14N4O2S,≥99.0%,Sigma Aldrich,USA)的混合物通過含有體積分?jǐn)?shù)為1%的二甲亞砜(DMSO,Amresco,USA)的鉀溶液(0.051 mol·L-1NaCl與0.032 mol·L-1KCl)[19-20]進(jìn)行配制。每個(gè)磺胺抗生素的濃度都為25.0 mg·L-1，磺胺混合物的總濃度是100.0 mg·L-1。環(huán)境水平0.01 mg·L-1濃度[21-22]。

1.2 線蟲培養(yǎng)

在線蟲生長(zhǎng)培養(yǎng)基(NGM)上，以尿嘧啶缺陷型大腸桿菌(Escherichia coli OP50)作為秀麗線蟲(C.elegans，N2，野生型)的食物進(jìn)行培養(yǎng)[23]。采用新鮮配制的次氯酸鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% NaClO/0.5 mol·L-1NaOH)殺死成熟線蟲獲得同步化的蟲卵并在20 °C繼續(xù)培養(yǎng)36 h從而獲得L3線蟲[24-25]。在線蟲用于暴露前，線蟲在鉀溶液中禁食2 h從而排空內(nèi)臟中的食物[26]。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

所有暴露實(shí)驗(yàn)在20 ℃具蓋的透明24孔板中進(jìn)行。每個(gè)濃度和空白對(duì)照(含1% DMSO的鉀溶液)都有6個(gè)孔作為平行實(shí)驗(yàn)組。每個(gè)孔含有500 μL磺胺或空白溶液，200 μL鉀溶液(含有500只線蟲)，以及300 μL大腸桿菌OP50菌液。所有暴露溶液中，DMSO的最終濃度都低于0.5%(體積分?jǐn)?shù))從而減少助溶劑的毒性效應(yīng)[19,27]。大腸桿菌OP50菌液的獲得途徑如下：將37 ℃、在Lysogeny broth (LB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的大腸桿菌OP50菌液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，在4 000 g、20 ℃離心5 min，棄上清液，加入無(wú)菌鉀溶液，采用移液器、配合無(wú)菌槍頭進(jìn)行吹打、重懸、稀釋，使1 mL大腸桿菌OP50菌液在570 nm處的吸光度值(OD570)為1.0；然后將大腸桿菌OP50與磺胺或空白溶液中(體積比1:1)平衡24 h后[28]，即可用于線蟲暴露實(shí)驗(yàn)。線蟲暴露72 h后，將每個(gè)孔中的線蟲采集到離心管中，經(jīng)過30 min沉淀后，使用10 mL鉀溶液進(jìn)行沖洗；再次經(jīng)過30 min沉淀后，得到的線蟲可用于生長(zhǎng)、生化指標(biāo)以及特定基因表達(dá)水平的檢測(cè)。

1.4 飲食與生長(zhǎng)效應(yīng)檢測(cè)

線蟲飲食和生長(zhǎng)在72 h暴露后進(jìn)行。飲食通過食物的減少進(jìn)行定量[28-29]。在暴露的開始和結(jié)束對(duì)每一個(gè)孔的OD570進(jìn)行檢測(cè)。含有線蟲的孔中吸光度值的變化(ΔOD)通過不含線蟲孔中的ΔOD進(jìn)行矯正，以減少大腸桿菌自身的死亡或生長(zhǎng)的影響。每一個(gè)暴露濃度和空白對(duì)照都有6個(gè)孔作為重復(fù)。線蟲的生長(zhǎng)通過線蟲的體長(zhǎng)進(jìn)行表征，體長(zhǎng)通過測(cè)量顯微拍照所得線蟲圖像中身體中線的折線長(zhǎng)度來(lái)獲得數(shù)據(jù)[4]。每個(gè)處理組有至少15條線蟲作為重復(fù)。

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè)

將線蟲采用磷酸鉀緩沖液(PBS，pH 6.0)沖洗、收集到1.5 mL離心管中，均分為2份，一份用于生化指標(biāo)檢測(cè)，一份用于特定基因表達(dá)水平的檢測(cè)。生化指標(biāo)的檢測(cè)方法如下：(1)將離心管在5 000g、4 ℃條件下離心5 min，棄上清液；(2)使用研磨棒進(jìn)行冰浴研磨，在用200 μL冰浴中的PBS沖洗研磨棒后，將離心管在5 000 g、4 ℃條件下離心5 min；(3)將上清液分裝3份，其中的2份采用酶聯(lián)免疫試劑盒(R&D Systems，Inc.，USA)分別測(cè)定總蛋白質(zhì)含量(TP)與過氧化氫(CAT)含量[28]，剩余1份備用。每個(gè)樣品中的CAT含量，表達(dá)為相對(duì)同一個(gè)樣品的TP的百分比，通過該表達(dá)形式可消除樣品之間生物量不同引起的差異[28]。每個(gè)處理組的樣品檢測(cè)3次。

1.6 基因表達(dá)定量分析

dbl-1、egl-4、eat-2、eat-18、ctl-2、ctl-3、sir-2和ced-4的表達(dá)水平按照改進(jìn)的Offermann的方法進(jìn)行檢測(cè)[30]，引物序列列于表1中。通過TRIzol劑提取線蟲樣品總RNA，在廠家(M-MLV，Promega)說明書指導(dǎo)下進(jìn)行cDNA的合成。隨后，總cDNA樣品用于實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，該反應(yīng)采用SYBR Green Master Mix作為染色劑、利用Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System(USA)進(jìn)行檢測(cè)。隨后，目標(biāo)基因表達(dá)采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行定量[31]。計(jì)算公式如公式(1)所示，其中CT代表循環(huán)次數(shù)；x代表目標(biāo)基因，例如dbl-1等；GPD-2作為內(nèi)源參照基因；i代表處理組；0代表空白?？瞻讓?duì)照組的基因表達(dá)歸一為1，基因表達(dá)數(shù)值大于1時(shí)表明基因表達(dá)上調(diào)，小于1時(shí)表明基因表達(dá)下調(diào)。

2-ΔΔCT=2-((CTx-CTGPD-2)i-(CTx-CTGPD-2)0)

(1)

表1 秀麗線蟲所選基因的引物模板序列Table 1 The template strand sequence for the primer pairs of the chosen genes in Caenorhabditis elegans

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有的數(shù)據(jù)都表達(dá)為相對(duì)空白對(duì)照組中同一指標(biāo)的百分比(percentage of control,POC)[22]，表達(dá)式如公式(2)所示，其中A0代表空白對(duì)照組中同一指標(biāo)的平均數(shù)值，A代表暴露組中同一指標(biāo)的數(shù)值。通過該方法，空白對(duì)照組中所有指標(biāo)的POC數(shù)值都?xì)w一為100%，POC低于100%表明抑制效應(yīng)(減少或基因表達(dá)的下調(diào)，POC高于100%表明刺激效應(yīng)(基因表達(dá)上調(diào))。每一個(gè)濃度組中的POC數(shù)值都進(jìn)行正態(tài)分布檢測(cè)[4]，并采用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式在圖中進(jìn)行表達(dá)。采用Origin Pro 8.5(Origin Lab Corp.,USA)在濃度組與空白對(duì)照組之間進(jìn)行方差分析(ANOVA)，P < 0.05作為顯著性差異的判斷標(biāo)準(zhǔn)。每次實(shí)驗(yàn)均可得出相似的結(jié)果，本文中的圖表源自一次代表性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

(2)

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 秀麗線蟲生長(zhǎng)基因表達(dá)下調(diào)與生長(zhǎng)抑制相一致

暴露于0.01 mg·L-1磺胺混合物72 h后，秀麗線蟲生長(zhǎng)調(diào)控基因dbl-1和egl-4表達(dá)水平的變化如圖1(Fig.1)所示。dbl-1和egl-4表達(dá)水平的POC數(shù)值分別為97%和82%。因?yàn)樵摂?shù)值低于100%，說明2個(gè)基因表達(dá)水平下調(diào)，與空白對(duì)照相比，下調(diào)水平分別為3%和18%(P < 0.5)，egl-4受到磺胺混合物的影響高于dbl-1(P < 0.05)。與此同時(shí)，磺胺混合物對(duì)線蟲生長(zhǎng)的效應(yīng)如圖2(Fig.2)所示。線蟲生長(zhǎng)的POC數(shù)值小于100%，表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，并且該抑制效應(yīng)隨著暴露濃度的增加而增強(qiáng)。在0.01 mg·L-1，POC數(shù)值為84.4%，相對(duì)空白的抑制率為15.6%。生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)與egl-4的下調(diào)水平更為接近，與dbl-1的下調(diào)水平相差較遠(yuǎn)。該比較結(jié)果進(jìn)一步說明egl-4在磺胺混合物暴露中受到更大的影響。

egl-4在TGF-β通路的上游發(fā)揮作用，dbl-1通過TGF-β中的Sma/Mab通路發(fā)揮作用[13]。基因表達(dá)水平與生長(zhǎng)抑制效應(yīng)之間的比較結(jié)果表明，磺胺混合物產(chǎn)生毒性效應(yīng)的途徑很可能是通過TGF-β通路，但是并不是通過TGF-β通路中Sma/Mab通路產(chǎn)生效應(yīng)。同時(shí)，egl-4的表達(dá)還會(huì)影響腸胃、皮下組織以及肌肉的體積，并且影響腸胃和肌肉中的細(xì)胞大小[12]。因此，磺胺混合物對(duì)線蟲生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)可能源自這些器官和細(xì)胞尺寸的變化。而且，egl-4能夠編碼一種依賴環(huán)鳥苷酸(cGMP)的蛋白激酶，在感覺神經(jīng)元的TGF-β下游發(fā)揮作用，調(diào)控秀麗線蟲對(duì)攝入食物的響應(yīng)[32]以及行為過程[33]。秀麗線蟲的EGL-4變異體還表現(xiàn)出嗅覺適應(yīng)性損傷[34]。因此本研究發(fā)現(xiàn)的egl-4表達(dá)的下調(diào)，還可能擾亂線蟲的飲食以及對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性。因此，egl-4基因表達(dá)水平可以作為評(píng)價(jià)磺胺環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物。

圖1 磺胺混合物(0.01 mg·L-1)暴露72 h后秀麗線蟲dbl-1、egl-4、eat-2、eat-18、ctl-2、ctl-3、sir-2和ced-4等基因的表達(dá)水平

圖2 磺胺混合物暴露72 h后秀麗線蟲生長(zhǎng)抑制效應(yīng)

2.2 秀麗線蟲飲食基因表達(dá)下調(diào)與飲食減少相一致

秀麗線蟲暴露于0.01 mg·L-1磺胺混合物72 h后，飲食調(diào)控基因eat-2和eat-18的表達(dá)水平如圖1(Fig.1)所示。eat-2和eat-18的POC數(shù)值分別為78%和80%(P < 0.5)。相應(yīng)地，2種基因表現(xiàn)出的下調(diào)水平分別為22%和20%，2種基因表達(dá)水平的變化不具有顯著性差異。與此同時(shí)，磺胺混合物對(duì)線蟲飲食的效應(yīng)如圖3(Fig.3)所示。線蟲飲食受到磺胺混合物的抑制效應(yīng)，并且該抑制效應(yīng)表現(xiàn)出對(duì)暴露濃度的依賴性。相對(duì)空白組線蟲，暴露于0.01 mg·L-1磺胺混合物的線蟲飲食表現(xiàn)出10.7%的抑制效應(yīng)。該抑制效應(yīng)水平明顯低于eat-2和eat-18基因的下調(diào)水平，這種差異可能是因?yàn)閑at-2與eat-18存在基因相互作用[35]。

圖3 磺胺混合物暴露72 h后秀麗線蟲飲食抑制效應(yīng)

eat-2和eat-18的下調(diào)水平相似。值得注意的是，eat-2通過nAChR機(jī)制發(fā)揮作用[14]，該作用使eat-2表達(dá)水平的變化具有指示人類健康影響的作用。nAChR機(jī)制在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的興奮性突觸中發(fā)揮重要作用[14]，nAChR功能狀態(tài)的變化能夠?qū)е虏徽５募∪馕s[36]。近期的研究還在致力于根據(jù)nAChR機(jī)制針對(duì)阿茲海默癥、鎮(zhèn)痛和消炎等開展新型治療方法的探索[37]。因此，采用eat-2基因表達(dá)水平作為生物標(biāo)志物，能夠?yàn)榕袛喱F(xiàn)有藥物和新型治療對(duì)非靶生物的效應(yīng)提供關(guān)鍵信息。

2.3 秀麗線蟲抗氧化基因上調(diào)與抗氧化物含量升高相一致

0.01 mg·L-1磺胺混合物對(duì)秀麗線蟲過氧化氫酶(CAT)調(diào)控基因表達(dá)水平的效應(yīng)如圖1所示。CAT調(diào)控基因ctl-2、ctl-3表達(dá)水平的POC數(shù)值分別為201%、166%(P< 0.05)，即2種基因的表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組，上調(diào)水平分別為101%與66%，并且2種基因的上調(diào)水平不具有顯著性差異。與此同時(shí)，磺胺混合物對(duì)線蟲CAT的效應(yīng)如圖4所示。線蟲的CAT受到磺胺混合物的刺激效應(yīng)影響，并且該刺激效應(yīng)隨著暴露濃度的增加而增強(qiáng)。其中，暴露于0.01 mg·L-1磺胺混合物的線蟲CAT表現(xiàn)出高出空白對(duì)照789.5%的刺激效應(yīng)，該刺激效應(yīng)的水平遠(yuǎn)高于ctl-2和ctl-3基因的上調(diào)水平。

研究表明，ctl-2編碼的CTL-2蛋白主要在腸上皮細(xì)胞的過氧化物酶體中表達(dá)[16]，ctl-3編碼的CTL-3主要表達(dá)在咽喉肌肉以及神經(jīng)細(xì)胞體中(http://www.wormbase.org)?；前坊旌衔飳?duì)ctl-2和ctl-3基因的調(diào)控水平均為上調(diào)，而且上調(diào)水平相似，該結(jié)果表明磺胺混合物誘發(fā)秀麗線蟲的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)位點(diǎn)同時(shí)存在于腸胃細(xì)胞、咽喉肌肉以及神經(jīng)細(xì)胞中。CAT調(diào)控基因的表達(dá)上調(diào)水平顯著低于CAT表現(xiàn)出的刺激水平，可能由于相應(yīng)的mRNA存在時(shí)間較短所致。因?yàn)閏tl-2表達(dá)水平略高，而且其占據(jù)線蟲總CAT活性的絕大部分(約80%)[16]，因此，ctl-2基因表達(dá)水平可以作為后續(xù)環(huán)境效應(yīng)監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物。

2.4 壽命與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化

因?yàn)閴勖鼘?duì)于判斷生物體是否適應(yīng)環(huán)境變化具有重要作用，本研究還檢測(cè)了壽命調(diào)控基因sir-2[17]的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1所示。sir-2基因表達(dá)水平?jīng)]有受到磺胺混合物暴露的顯著影響，該結(jié)果與磺胺混合物沒有顯著影響線蟲壽命的結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)相一致。本研究的結(jié)果表明磺胺混合物沒有對(duì)sir-2的表達(dá)產(chǎn)生影響，sir-2不適宜用于作為生物標(biāo)志物。

凋亡是表征生物體對(duì)環(huán)境變化適應(yīng)性的另一關(guān)鍵指標(biāo)，因此本研究還檢測(cè)了線蟲體內(nèi)促進(jìn)凋亡的基因ced-4的表達(dá)水平[18]。因?yàn)镻OC數(shù)值大于100%，ced-4的表達(dá)為上調(diào)，該上調(diào)比空白高32%(P < 0.5,圖1)。ced-4的顯著上調(diào)可能有2個(gè)原因。其一，線蟲全部細(xì)胞在磺胺混合物暴露中都表現(xiàn)出凋亡程度的增加；其二，線蟲體內(nèi)某一部分組織器官表現(xiàn)出顯著調(diào)亡，例如生殖器官。研究表明，ced-4的mRNA主要在胚胎發(fā)生期間表達(dá)，大多數(shù)細(xì)胞程序性死亡都發(fā)生在該期間[38]。并且，本研究中線蟲開始暴露時(shí)的時(shí)間為孵化后36 h，隨后的72 h暴露時(shí)間，涵蓋了精子、卵子、受精卵/胚胎形成的全部過程[39]，此生物過程可能為磺胺混合物毒性效應(yīng)提供了靶目標(biāo)，從而解釋了ced-4表達(dá)的顯著上調(diào)，但是該解釋依然需要通過進(jìn)一步的AO吖啶橙染色予以確認(rèn)。凋亡基因表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡(apoptosis,cell loss)增多將促使秀麗線蟲壽命減少[40]，同時(shí)抗氧化能力的增加能夠促進(jìn)壽命延長(zhǎng)[41-42]，從而導(dǎo)致了本研究中秀麗線蟲壽命沒有顯著變化的結(jié)果，但是該推測(cè)也需進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果不僅說明ced-4表達(dá)水平具有良好生物標(biāo)志物的潛質(zhì)，而且也為后續(xù)毒性機(jī)理研究提供了方向。

圖4 磺胺混合物暴露72 h對(duì)秀麗線蟲過氧化氫酶(CAT)刺激效應(yīng)

綜上，暴露于環(huán)境濃度水平的磺胺混合物后，秀麗線蟲特定基因的表達(dá)水平表現(xiàn)出差異。生長(zhǎng)調(diào)控基因dbl-1和egl-4表現(xiàn)為下調(diào)，而且egl-4下調(diào)水平顯著強(qiáng)于dbl-1，并與生長(zhǎng)抑制效應(yīng)表現(xiàn)出更好的相似性。飲食調(diào)控基因eat-2和eat-18表現(xiàn)出相似的下調(diào)水平，而且這些下調(diào)水平顯著高于飲食的抑制效應(yīng)。過氧化氫酶(CAT)調(diào)控基因ctl-2、ctl-3表達(dá)上調(diào)，但是上調(diào)水平顯著低于CAT表現(xiàn)出的刺激水平。同時(shí)，凋亡調(diào)控基因ced-4的表達(dá)顯著上調(diào)。研究結(jié)果推薦egl-4、eat-2、ctl-2和ced-4的表達(dá)水平作為潛在的生物標(biāo)志物。

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◆

Effects of Sulfonamide Mixtures at Environmental Concentrations on Growth,Feeding,Catalase Activity and the Gene Expression Levels ofCaenorhabditiselegans

Liang Shuang,Yu Zhenyang*,Yin Daqiang

Key Laboratory of Yangtze River Water Environment,Ministry of Education,College of Environmental Science and Engineering,Tongji University,Shanghai 200092,China

28 March 2015 accepted 17 July 2015

The ubiquitous existence of sulfonamide residues in environments is drawing attentions on their potential effects.Previously,mixture effects of sulfonamides were falsely predicted by simply combining the individual effects.Accordingly,direct investigations on sulfonamide mixture effects are needed.Here,Caenorhabditis elegans was exposed to mixtures containing four commonly used sulfonamides (sulfadiazine,sulfapyridine,sulfamethaxozale and sulfamethazine) at environmental relevant concentration of 0.01 mg·L-1.The expression levels of growth regulating genes (dbl-1 and egl-4),feeding regulating genes (eat-2 and eat-18),catalase (CAT) encoding genes (ctl-2 and ctl-3),lifespan regulating gene (sir-2) and apoptosis regulating gene (ced-4) were analyzed.Compared with the control,dbl-1 expressions in exposure to sulfonamide mixture were not significantly influenced with a slight down-regulation by 3%.Meanwhile,egl-4 expressions were down-regulated by 18%,explaining inhibitions on growth which was 15.6% lower than the control.Both eat-2 and eat-18 expressions were down-regulated by 20%～22%,greater than the inhibition on feeding (10.7% lower than the control).ctl-2 and ctl-3 expressions were up-regulated by 101% and 66% higher than the control,respectively.The up-regulation levels were significantly lower than the CAT stimulations which were 789.5% higher than the control.sir-2 expression was not significantly influenced as well as the lifespan.In addition,ced-4 expression was up-regulated by 32%,indicating increases in apoptosis.The results of egl-4,eat-2,ctl-2 and ced-4 indicated that the involvement of transforming growth factor β (TGF-β) pathway,nicotinic acetylcholine receptor (nAChR),antioxidant responses and apoptosis in the sulfonamide mixture effects,respectively.

sulfonamide mixture; Caenorhabditis elegans; TGF-β; nAChR; CAT; apoptosis; environmental concentration

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.21307095，No.51278353)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(No.2013KJ015)；瑞典研究委員會(huì)項(xiàng)目(D0691301)

梁爽(1990-)，女，學(xué)士，研究方向?yàn)槎纠韺W(xué)，E-mail: liang6897@qq.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: yuzhenyang3227@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150328010

2015-03-28 錄用日期：2015-07-17

1673-5897(2015)4-088-08

X171.5

A

于振洋(1984—)，男，博士，助理研究員，主要從事污染物毒性效應(yīng)與機(jī)理、化學(xué)品生態(tài)與健康風(fēng)險(xiǎn)的研究。

梁爽，于振洋，尹大強(qiáng).環(huán)境濃度下磺胺混合物對(duì)秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)生長(zhǎng)、飲食、抗氧化酶及其調(diào)控基因表達(dá)水平的影響[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015,10(4): 88-95

Liang S,Yu Z Y,Yi D Q.Effects of sulfonamide mixtures at environmental concentrations on growth,feeding,catalase activity and the gene expression levels of Caenorhabditis elegans [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 88-95 (in Chinese)