納米銀和銀離子對斑馬魚胚胎早期生長發(fā)育的影響及作用機制

辛琦，章強，程金平,

1.華東師范大學河口海岸學國家重點實驗室，上海 200062 2.香港城市大學深圳研究院，深圳 518057

納米銀和銀離子對斑馬魚胚胎早期生長發(fā)育的影響及作用機制

辛琦1,2，章強1,2，程金平1,2,

1.華東師范大學河口海岸學國家重點實驗室，上海 200062 2.香港城市大學深圳研究院，深圳 518057

為探究納米銀對水生生物的毒性作用，選取斑馬魚胚胎為受試生物，考察了納米銀對斑馬魚胚胎早期生長發(fā)育的影響，同時比較了納米銀與銀離子對斑馬魚胚胎的毒性作用和機理。實驗將受精后4小時(4 hpf)的斑馬魚胚胎分別暴露于不同濃度的納米銀和銀離子溶液中至96 hpf，觀察并記錄了胚胎的死亡、孵化和畸形等指標。應用吖啶橙(AO)染色實驗研究了胚胎暴露之后的細胞凋亡情況，并且應用熒光定量PCR技術分析了相關基因的表達水平。研究結果表明，隨著暴露濃度的增加，納米銀和銀離子均能導致斑馬魚胚胎的死亡率增加和孵化率降低，并且引起孵化延遲。納米銀和銀離子的96 h半數(shù)致死濃度(96 h-LC50)分別為11.75 mg·L-1和0.054 mg·L-1。銀離子毒性遠大于納米銀毒性。暴露的斑馬魚胚胎均表現(xiàn)出體長變短和卵黃囊腫大的畸形。AO染色結果表明，納米銀和銀離子處理組胚胎的軀干和卵黃囊部位存在細胞凋亡信號?；虮磉_分析結果顯示，1.93 mg·L-1納米銀顯著提高了斑馬魚胚胎caspase9的表達(P<0.05)，而0.006 mg·L-1的銀離子就能顯著上調COX-2a(P<0.01)和COX-17(P<0.05)基因的表達，同時0.036 mg·L-1銀離子增加了斑馬魚體內p53基因的表達(P<0.05)。以上研究結果說明，納米銀可能通過caspase通路誘導細胞凋亡進而影響斑馬魚胚胎的生長發(fā)育；而銀離子不但影響氧化系統(tǒng)基因通路，還能通過p53誘導凋亡進而阻滯斑馬魚胚胎的生長發(fā)育。

納米銀；銀離子；斑馬魚胚胎；細胞凋亡；生長發(fā)育

納米銀(Ag NPs)是一種重要的金屬納米材料，由于抗菌特性而被廣泛應用。美國Woodrow Wilson國際學者中心發(fā)布的2013年納米產品消費清單表明目前最常用的納米材料依次為銀、二氧化鈦、碳納米管、二氧化硅和氧化鋅等[1]。這些納米材料被廣泛應用在醫(yī)療領域，個人護理品，紡織品等產品中[2-3]。納米材料在帶來優(yōu)越的材料性能的同時，其潛在的負面效應也不容忽視。2009年有研究報道，長期處在有納米材料的工作環(huán)境中的工人患有嚴重肺部疾病，甚至有兩名工人因肺部損傷而死亡，這是首次納米材料致人死亡的報道[4-5]。由此，納米材料對環(huán)境和生物的潛在健康影響引起了社會關注。納米材料可以在產品的生產、使用和廢棄過程中進入環(huán)境。首先在產品的生產場地以及運輸過程中可能發(fā)生泄漏或者通過工廠廢棄物被排放進入環(huán)境，同時工人們會通過呼吸和皮膚接觸等方式暴露于納米材料中[6-7]。而作為使用者，普通群眾主要是通過使用化妝品、身體與紡織衣物的摩擦接觸等暴露或接觸到納米材料。

納米銀進入環(huán)境最主要的途徑就是通過污水排放和地表徑流，由此水環(huán)境是納米銀重要的匯[8]。有研究表明在上海市河流沉積物中重金屬銀的含量在0.14～1.10 mg·kg-1之間，平均值為0.51 mg·kg-1，相較于鋅、銅等其他重金屬濃度低很多，但是大部分地點屬于偏中度污染[9]。納米銀累積在水環(huán)境中必將對水生生物和水環(huán)境帶來一定的影響。許多對水生生物的研究已經表明納米銀具有潛在的生物毒性作用，表現(xiàn)出呼吸毒性[10]和神經毒性[11]。然而目前所有研究均處于探索階段，有關納米銀的毒性效應并沒有統(tǒng)一定論。關于納米銀延遲水生生物胚胎生長發(fā)育的報道極為少見。本研究以模式生物胚胎期的斑馬魚為受試生物，通過急性暴露實驗探究納米銀對水生生物早期生長發(fā)育的影響，并通過基因表達分析初步揭示納米銀阻礙斑馬魚胚胎生長發(fā)育的分子機制，同時比較了納米銀與銀離子致毒機制的差異。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：超聲波清洗儀(SB-520DTDN,寧波新芝公司)，透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)(JEM-2100,日本,JEOL公司)，掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)(S-4800,日本,HITACHI公司)，體視顯微鏡(SMZ168,中國,Motic公司)，解剖鏡(V8,德國,Zeiss公司)，熒光體視顯微鏡(M165FC,德國,Leica公司)，UV-vis紫外分光光度計 (SMA4000,中國,Merioton公司)，熒光定量PCR儀(ABI7500,美國,Applied Biosystems公司)，電感耦合等離子體質譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometer,ICP-MS)(Neptune,德國,Thermo公司)。

試劑：硝酸銀純度為99%和麻醉劑Tricaine均購自Sigma-Aldrich公司；納米銀粉(型號CST-NP-S10)粒徑(10±2) nm，平均粒徑為10 nm，純度為99.5%，包裹 10%～13%脂肪酸鹽，購自蘇州冷石納米材料科技有限公司；RNeasy?Mini Kit(Cat#74104，QIAGEN，GmBH，Germany)試劑盒，PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser (Cat#DRR047A，Takara，Dalian)試劑盒，SYBR Premix Ex TaqTM(Cat#DRR420A，Takara，Dalian)試劑盒以及TaKaRa Ex Taq?Hot Start Version (Cat#DRR006A，Takara，Dalian)試劑盒均購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒(NO.SK8141，生工，上海)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 實驗材料

市售的成年斑馬魚飼養(yǎng)于獨立的養(yǎng)殖單元(上海海圣)，雌雄兼有，水溫(28±0.5)℃，每日光照黑暗周期為14 h：10 h，早晚定時投喂薄片斑馬魚飼料和活豐年蝦卵2次，并每天清除排泄物。在收集胚胎前一晚，將1條雌魚和2條雄魚放入孵化盒中，第2天光照后產卵。于產卵后1 h收集魚卵并用培養(yǎng)液沖洗3次，在解剖顯微鏡下挑選正常發(fā)育的受精卵放入24孔板進行實驗。

1.3 方法

1.3.1 納米銀的表征

將納米銀粉稱重后分散在去離子水中，為了便于在透射電鏡下觀察，首先在超聲儀中40 kHz條件下分散20 min后制備成懸浮液，然后將懸浮液滴在銅網上，室溫干燥后通過透射電鏡觀察納米銀在水中分布的形態(tài)。同時將納米銀溶液模擬暴露條件放置24 h后再次用透射電鏡觀察其分散和形態(tài)。為進一步觀察納米銀顆粒的形貌特征，納米銀粉的形態(tài)也在掃描電鏡下進行了分析。納米銀粉末用導電膠粘結法裝載在樣品臺上然后通過掃描電鏡觀察樣品粉末形態(tài)。根據我們先前的研究，將暴露24 h的納米銀溶液從培養(yǎng)板中收集后加入AmiconUltra-0.5超濾管(平均孔徑2 nm)中在14 000轉下離心40 min分離納米銀溶液中的銀離子(粒徑0.28 nm)，將濾出液用10%硝酸酸化后用ICP-MS測定納米銀釋放的銀離子濃度。測定發(fā)現(xiàn)實驗所用納米銀溶液在此暴露條件下24 h并未檢測到銀離子的釋放，所以本研究所用的納米銀暴露液沒有銀離子的存在和干擾。

1.3.2 急性毒性實驗

受精后4 h的斑馬魚胚胎置于24孔培養(yǎng)板中，每孔20個健康受精卵，每組設置4個平行，共80個受精卵。每孔加入2 mL空白對照液或處理組暴露液，加蓋封閉后置于28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至96 hpf。其中納米銀暴露濃度分別為：0.96、1.93、3.85、7.70、11.55、23.10、46.20 mg·L-1；銀離子暴露濃度分別為： 0.003、0.006、0.018、0.036、0.072、0.144mg·L-1。每24 h更換暴露液，并記錄胚胎的死亡，孵化和畸形情況。死亡的終點為胚胎凝結或心臟停止跳動，對于胚胎期斑馬魚發(fā)育時相的評價參照Kimmel等[12]提供的判斷標準進行。死亡率=(死亡胚胎數(shù)/總胚胎數(shù))100%，孵化率=(孵化胚胎數(shù)/總胚胎數(shù))100%。在72 hpf時，用配備了拍照系統(tǒng)的蔡司顯微鏡給斑馬魚拍照，并用ImageJ軟件測量斑馬魚的體長以及卵黃囊面積。

1.3.3 吖啶橙(acridine orange,AO)染色觀察胚胎細胞凋亡

收集處理至96 hpf的斑馬魚胚胎，用胚胎培養(yǎng)液沖洗2次后放入含5 μg·mL-1AO染色劑的胚胎培養(yǎng)液中染色20 min，然后再用培養(yǎng)液沖洗3次，每次5 min。用0.016 mol·L-1的Tricaine麻醉劑麻醉胚胎1 min后在熒光顯微鏡下用515 nm激發(fā)光觀察凋亡情況并拍照。

1.3.4 基因表達分析

為研究低濃度暴露下納米銀和銀離子的致毒機制，基因表達分析實驗選取納米銀暴露濃度為0.96、1.93、3.85 mg·L-1的斑馬魚胚胎，銀離子暴露濃度為0.006、0.018、0.036 mg·L-1的斑馬魚胚胎進行實驗。收集處理至96 hpf的斑馬魚胚胎，用RNeasy?Mini試劑盒提取總RNA，用紫外分光光度儀測RNA濃度，通過紫外吸收值A260/A280判斷RNA有無降解。然后用PrimeScriptTMRT reagentswith gDNA Eraser試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，之后用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒按照說明在熒光定量PCR儀中進行實時熒光定量反應。本研究所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如表1所示。最終實驗數(shù)據用2-ΔΔCt方法分析，以β-actin做為內參基因對結果進行標準化。本研究選取的細胞凋亡相關基因包括凋亡誘導因子(AIF)、腫瘤抑制基因p53和半胱氨酸蛋白酶caspase9，氧化相關基因包括過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、環(huán)氧化酶COX-2a和細胞色素c氧化酶COX-17。

1.3.5 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據采用平均值±標準偏差(mean±SD)表示，結果均用GraphPad Prism 5軟件進行分析及顯著性檢驗，P<0.05表示差異具有顯著性統(tǒng)計學意義。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-PCR

2 結果(Results)

2.1 納米銀的表征

圖1分別展示了納米銀的透射電鏡和掃描電鏡照片。從掃描電鏡照片中可以看出，實驗所用的納米銀粉顆粒呈現(xiàn)球形，除個別較大顆粒外，粒徑分布范圍較窄，基本無明顯團聚體(圖1C)。納米銀懸浮液制備1 h的透射電鏡照片顯示了該納米銀在去離子水中能均勻分散，無團聚現(xiàn)象，且性質穩(wěn)定呈現(xiàn)球形(圖1A)。模擬暴露條件24 h后納米銀在暴露介質中依然分散均勻，無明顯團聚現(xiàn)象且粒徑沒有明顯變化，性質穩(wěn)定(圖1B)。經測量統(tǒng)計納米銀粒徑范圍符合正態(tài)分布，主要介于8.27～12.42 nm之間，平均粒徑為(9.18±1.99) nm。在實驗條件下納米銀暴露液中沒有銀離子的釋放。

圖1 納米銀的表征圖：(A)納米銀懸浮液制備1 h透射電鏡照片；(B)納米銀懸浮液在模擬條件下暴露24 h后透射電鏡照片；(C)掃描電鏡照片

圖2 (A)Ag NPs和(B) Ag+暴露96 h斑馬魚胚胎的死亡率

圖3 (A)Ag NPs和(B) Ag+暴露的斑馬魚胚胎的孵化率

2.2 納米銀和銀離子對斑馬魚胚胎的急性毒性

斑馬魚胚胎在納米銀和銀離子的不同濃度下暴露96 h的死亡率如圖2所示。斑馬魚的死亡率與納米銀和銀離子的暴露濃度均呈現(xiàn)劑量效應關系，隨著暴露濃度的增大，斑馬魚死亡率增高。當納米銀的暴露濃度為46.20 mg·L-1時，斑馬魚胚胎的死亡率高達86%(圖2A)，而銀離子濃度達到0.144 mg·L-1時斑馬魚胚胎死亡率已經達到100%(圖2B)。進一步計算得到納米銀和銀離子對斑馬魚胚胎96 h的半數(shù)致死濃度分別為11.75 mg·L-1和0.054 mg·L-1。結果表明納米銀對斑馬魚胚胎或幼魚的毒性遠遠低于銀離子。

斑馬魚胚胎于48 hpf開始孵化出膜，空白對照組至72 hpf基本孵化完全。納米銀和銀離子處理組的斑馬魚胚胎顯示出隨暴露濃度的增加孵化率降低的趨勢，當納米銀濃度達到11.55 mg·L-1或者銀離子濃度達到0.144 mg·L-1時，斑馬魚胚胎的孵化率僅有10%左右(圖3)。并且納米銀和銀離子暴露組與對照組相比有延遲孵化的現(xiàn)象。0.96和1.93 mg·L-1的納米銀暴露組的斑馬魚胚胎在52～60 hpf時與對照組相比表現(xiàn)出孵化延遲現(xiàn)象(圖3A)。同樣0.018 和0.036 mg·L-1的銀離子暴露組斑馬魚主要在48～56 hpf顯示出孵化延遲的現(xiàn)象(圖3B)。

2.3 納米銀和銀離子對斑馬魚生長發(fā)育的影響

圖4 納米銀和銀離子暴露72 h影響斑馬魚胚胎發(fā)育的典型畸形特征

從斑馬魚胚胎72 hpf的照片可以看出，與對照組(圖4A)相比，納米銀和銀離子處理組的斑馬魚胚胎呈現(xiàn)出體長變短和卵黃囊腫的發(fā)育異?，F(xiàn)象(圖4B和C)。進一步測量統(tǒng)計了斑馬魚的體長后發(fā)現(xiàn)，納米銀和銀離子暴露組的斑馬魚胚胎72 hpf的體長隨暴露濃度的增加而減小(圖5)。尤其是3.85 mg·L-1和7.70 mg·L-1的納米銀暴露組(圖5A)，以及0.072 mg·L-1的銀離子暴露組(圖5B)斑馬魚胚 胎的體長明顯小于對照組。

卵黃囊是斑馬魚胚胎發(fā)育過程中儲存營養(yǎng)物質的地方，72 hpf斑馬魚胚胎的卵黃囊面積如圖6所示。納米銀處理組的斑馬魚胚胎卵黃囊面積隨暴露濃度增加而增大，并且1.93～7.70 mg·L-1暴露組的卵黃囊面積明顯大于對照組(圖6A)。銀離子暴露的斑馬魚胚胎的卵黃囊面積也呈現(xiàn)微弱的增加趨勢，但是與對照組相比并沒有顯著性差異(圖6B)。

2.4 納米銀和銀離子的致毒機制

2.4.1 氧化損傷相關基因表達情況

斑馬魚體內氧化壓力相關基因CAT,SOD，COX-2a and COX-17的表達情況如圖7所示。納米銀暴露沒有顯著改變斑馬魚體內這4種基因的表達情況(圖7A)。銀離子上調了斑馬魚體內COX-2a基因的表達，尤其是在0.006和0.036 mg·L-1暴露濃度組，上調量顯著高于對照組(圖7B)。此外，0.006 mg·L-1的銀離子處理組還顯著增加了斑馬魚體內COX-17基因的表達(圖7B)。而斑馬魚體內CAT，SOD基因的表達則沒有受到銀離子的顯著影響(圖7B)。

2.4.2 細胞凋亡

對照組和處理組的斑馬魚胚胎發(fā)育至96 hpf的AO染色結果如圖8所示。空白對照組基本沒有凋亡熒光信號(圖8A，a，C和c)。納米銀處理組的凋亡熒光信號明顯較高(圖8B)，并且凋亡主要集中在斑馬魚的軀干和尾部(圖8b)。同樣，銀離子暴露組的斑馬魚胚胎凋亡熒光信號也明顯高于對照組(圖8D)，凋亡信號主要集中在卵黃囊區(qū)域(圖8d)。

納米銀和銀離子不同濃度處理組斑馬魚的細胞凋亡相關基因的表達情況如圖9所示?；虮磉_分析結果表明，納米銀處理上調了斑馬魚體內caspase9基因的表達，尤其是1.93 mg·L-1暴露組中caspase9基因的表達明顯高于對照組(圖9A)。而銀離子暴露則上調了斑馬魚體內p53基因的表達，尤其在0.036 mg·L-1組表達量顯著高于空白對照組(圖9B)。斑馬魚體內AIF基因的表達則在納米銀和銀離子處理組中均沒有明顯變化(圖9A和B)。

圖5 (A)Ag NPs和(B) Ag+暴露72 h斑馬魚胚胎的體長

圖6 (A)Ag NPs和(B) Ag+暴露72 h斑馬魚胚胎的卵黃囊面積

圖7 (A)Ag NPs和(B) Ag+暴露96 h斑馬魚胚胎的氧化壓力相關基因CAT,SOD，COX-2a和COX-17的表達情況

3 討論(Discussion)

本研究表明，斑馬魚胚胎暴露于納米銀和銀離子后均表現(xiàn)出死亡率增高和孵化率降低，并且有延遲孵化的現(xiàn)象。而研究中所用納米銀溶液在暴露過程中性質穩(wěn)定并且沒有銀離子釋放，這可能是由于納米銀添加了脂肪酸鹽包裹材料，包裹物降低了理化因子對納米銀團聚、沉降的影響，也使銀離子難以從納米銀中釋放出來。從而說明實驗中納米銀產生的毒性并不能歸因于銀離子。斑馬魚胚胎受精后的3 d時間內胚胎發(fā)育形成的過程可分為7個主要時期，而孵化期是其中之一[12]。通常情況，在標準條件下培養(yǎng)的斑馬魚胚胎能夠在48～72 hpf孵化出膜。而本研究中納米銀和銀離子暴露的斑馬魚出現(xiàn)孵化率降低的現(xiàn)象，并且分別在52～60 hpf和48～56 hpf時與對照組相比表現(xiàn)出孵化延遲。為了進一步研究斑馬魚延遲孵化的影響，我們在形態(tài)學統(tǒng)計時又檢查了斑馬魚的體長和卵黃囊這兩項指標。因為體長和卵黃囊面積通常用來作為評估斑馬魚生長發(fā)育的2個重要參數(shù)[13]。我們發(fā)現(xiàn)納米銀和銀離子暴露的斑馬魚與對照組相比體長明顯變短，這恰好與延遲孵化的結果相吻合，證明了納米銀和銀離子都能影響斑馬魚的生長發(fā)育。卵黃囊能夠為胚胎的發(fā)育提供營養(yǎng)物質，隨著胚胎的成長，卵黃逐漸消耗，而卵黃囊的尺寸也應該相應變小[12]。本研究中納米銀和銀離子暴露的斑馬魚出現(xiàn)卵黃囊腫大的畸形，測量了卵黃囊面積后發(fā)現(xiàn)納米銀處理組的斑馬魚卵黃囊面積明顯大于對照組，這進一步印證了納米銀能延遲斑馬魚胚胎的生長發(fā)育。與此類似，Wu等[14]的研究發(fā)現(xiàn)納米銀引起暴露的青鳉魚胚胎最大視頂蓋寬度減小，因此表明生長發(fā)育受阻滯。與納米銀不同的是，雖然碳納米管也能引起斑馬魚胚胎孵化延遲，但是并沒有影響胚胎的發(fā)育和存活[15]。

圖8 納米銀和銀離子對暴露96 h的斑馬魚細胞凋亡的影響

圖9 (A)Ag NPs和(B) Ag+暴露96 h斑馬魚胚胎的細胞凋亡相關基因AIF,p53和caspase9的表達情況

氧化損傷是納米材料致毒的一個重要機制[16]。過氧化氫酶(catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是生物體內2種重要的抗氧化酶并且能清除體內氧自由基。本研究中納米銀和銀離子都沒有顯著改變斑馬魚體內CAT和SOD這2種基因的表達量。與此類似，Choi等[17]研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚體內SOD基因沒有明顯受納米銀或銀離子暴露的影響，而斑馬魚肝臟內CAT的表達量卻減少。環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)COX-2a靜息時不表達，一般會在激素、致癌物質等因子的誘導下表達，它可以通過抑制凋亡、促進細胞增殖等參與腫瘤的形成過程[18-19]。COX-2a一般認為參與芳香烴受體(Ahr)介導的毒性，二噁英(TCDD)能顯著增加暴露的青鳉魚內COX-2a的表達[20]。本研究中，Ag+同樣顯著提高了96 hpf斑馬魚體內COX-2a的表達，而納米銀卻未影響COX-2a的表達。細胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase)亞型COX-17是線粒體銅伴侶蛋白，其蛋白異常表達量與活性氧自由基形成有關。Craig等[21]的研究表明在銅中暴露48 h的斑馬魚鰓和肝臟內COX-17基因的表達明顯上調。同樣的，我們的研究表明Ag+處理也能顯著增加COX-17的表達。所有結果表明銀離子對斑馬魚體內氧化和抗氧化系統(tǒng)的基因通路有顯著影響，而本研究中納米銀對此通路沒有明顯影響。

已有研究報道氧化壓力在誘導和調節(jié)細胞凋亡中的重要作用[22]。應激導致的細胞凋亡一般認為是造成胚胎發(fā)育異常的因素[23]。因此我們用AO染色實驗觀察了暴露的斑馬魚體內細胞凋亡的情況，結果發(fā)現(xiàn)納米銀暴露的斑馬魚軀干和銀離子暴露的斑馬魚卵黃囊均有凋亡的熒光信號。我們進一步分析了細胞凋亡相關基因的表達情況。腫瘤抑制基因p53的激活可以導致細胞周期停滯或者細胞凋亡[24]，本研究中Ag+顯著上調了斑馬魚體內p53基因的表達，暗示斑馬魚體內細胞凋亡通路的激活。而納米銀處理卻沒有顯著改變p53的表達，這與Choi等[17]的研究結果一致，他們發(fā)現(xiàn)納米銀暴露的斑馬魚體內p53蛋白增加但是p53基因表達水平沒有變化，因此認為這可能是由于p53的表達主要在轉錄后水平。凋亡可通過caspase通路產生，caspase通路又包括內源性和外源性兩種路徑，caspase9主要參與內源性通路[25]。本研究中納米銀顯著增加了斑馬魚體內caspase9的表達，表明是通過激活內源性通路引起細胞凋亡的發(fā)生。凋亡誘導因子(AIF)是一種線粒體蛋白，它可轉移到細胞質及細胞核內引起細胞凋亡，主要介導與caspase無關的通路[26-27]。本研究中納米銀和銀離子的暴露中AIF的表達均沒有明顯變化，表明凋亡主要是通過caspase通路而不是AIF通路發(fā)生的。

綜上所述，本研究基于急性暴露實驗研究了納米銀和銀離子對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響，結果表明銀離子毒性遠遠大于納米銀的毒性，二者均能影響斑馬魚胚胎的孵化，并使斑馬魚的生長發(fā)育受阻滯。AO染色發(fā)現(xiàn)納米銀和銀離子暴露的斑馬魚均有細胞凋亡的現(xiàn)象，進一步研究表明納米銀的致毒機制是可通過caspase的內源性通路造成細胞凋亡，而銀離子不但能影響斑馬魚的氧化抗氧化相關的基因通路，而且能激活p53基因進而造成細胞凋亡。

[1] Project on Emerging Nanotechnologies (PEN).Analysis of the inventory of nanotechnology-based consumer products [DB/OL].[2014-10-15].http://www.nanotechproject.org/cpi/about/analysis/

[2] Project on Emerging Nanotechnologies (PEN).Categories of nanotechnology-based consumer products [DB/OL].[2014-10-15].http://www.nanotechproject.org/cpi/browse/categories/

[3] Navarro E,Piccapietra F,Wagner B,et al.Toxicity of silver nanoparticles to Chlamydomonas reinhardtii[J].Environmental Science & Technology,2008,42(23): 8959-8964

[4] Song Y,Li X,Du X.Exposure to nanoparticles is related to pleural effusion,pulmonary fibrosis and granuloma [J].European Respiratory Journal,2009,34(3): 559-567

[5] 王震宇,趙建,李娜,等.人工納米顆粒對水生生物的毒性效應及其機制研究進展[J].環(huán)境科學,2010,31(6): 1409-1418

Wang Z Y,Zhao J,Li N,et al.Review of ecotoxicity and mechanism of engineered nanoparticles to aquatic organisms [J].Environmental Science,2010,31(6): 1409-1418(in Chinese)

[6] Nowack B,Krug H F,Height M.120 years of nanosilver history: Implications for policy makers [J].Environmental Science & Technology,2011,45:1177-1183

[7] Gottschalk F,Nowack B.The release of engineered nanomaterials to the environment [J].Journal of Environmental Monitoring,2011,13(5): 1145-1155

[8] Bradford A,Handy R D,Readman J W,et al.Impact of silver nanoparticle contamination on the genetic diversity of natural bacterial assemblages in estuarine sediments [J].Environmental Science & Technology,2009,43(12): 4530-4536

[9] 賈英,方明,吳友軍,等.上海河流沉積物重金屬的污染特征與潛在生態(tài)風險[J].中國環(huán)境科學,2013,33(1): 147-153

Jia Y,Fang M,Wu Y J,et al.Pollution characteristics and potential ecological risk of heavy metals in river sediments of Shanghai [J].China Environmental Science,2013,33(1): 147-153 (in Chinese)

[10] Bilberg K,Hovgaard M B,Besenbacher F,et al.In vivo toxicity of silver nanoparticles and silver ions in zebrafish (Danio rerio) [J].Journal of Toxicology,2011,2012,doi 10.1155/2012/293784

[11] Powers C M,Slotkin T A,Seidler F J,et al.Silver nanoparticles alter zebrafish development and larval behavior: Distinct roles for particle size,coating and composition [J].Neurotoxicology and Teratology,2011,33(6): 708-714

[12] Kimmel C B,Ballard W W,Kimmel S R,et al.Stages of embryonic development of the zebrafish [J].Developmental Dynamics,1995,203(3): 253-310

[13] Westerfield M.The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) [M].Eugene: Institute of Neuroscience,University of Oregon,1995

[14] Wu Y,Zhou Q,Li H,et al.Effects of silver nanoparticles on the development and histopathology biomarkers of Japanese medaka (Oryzias latipes) using the partial-life test [J].Aquatic Toxicology,2010,100(2): 160-167

[15] Cheng J,Flahaut E,Cheng S H.Effect of carbon nanotubes on developing zebrafish (Danio rerio) embryos [J].Environmental Toxicology and Chemistry,2007,26(4): 708-716

[16] Nel A,Xia T,M?dler L,et al.Toxic potential of materials at the nanolevel [J].Science,2006,311(5761): 622-627

[17] Choi J E,Kim S,Ahn J H,et al.Induction of oxidative stress and apoptosis by silver nanoparticles in the liver of adult zebrafish [J].Aquatic Toxicology,2010,100(2): 151-159

[18] Subbaramaiah K,Zakim D,Weksler B B,et al.Inhibition of cyclooxygenase: A novel approach to cancer prevention [J].Experimental Biology and Medicine,1997,216(2): 201-210

[19] 韓勇軍,吳新榮.COX 基因在斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中的表達 [J].廣東藥學院學報,2010,26(6): 628-631

Han Y J,Wu X R.Expression of COX during early embryonic development in zebrafish [J].Journal of Guangdong Pharmaceutical College,2010,26(6): 628-631 (in Chinese)

[20] Dong W,Matsumura F,Kullman S W.TCDD induced pericardial edema and relative COX-2 expression in medaka (Oryzias latipes) embryos [J].Toxicological Sciences,2010,118(1): 213-223

[21] Craig P M,Wood C M,McClelland G B.Oxidative stress response and gene expression with acute copper exposure in zebrafish (Danio rerio) [J].American Journal of Physiology-Regulatory,Integrative and Comparative Physiology,2007,293(5): R1882-R1892

[22] Simonian N A,Coyle J T.Oxidative stress in neurodegenerative diseases [J].Annual Review of Pharmacology and Toxicology,1996,36(1): 83-106

[23] Yang S,Liu S,Ren Z,et al.Induction of oxidative stress and related transcriptional effects of perfluorononanoic acid using an in vivo assessment [J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology,2014,160: 60-65

[24] Langheinrich U,Hennen E,Stott G,et al.Zebrafish as a model organism for the identification and characterization of drugs and genes affecting p53 signaling [J].Current Biology,2002,12(23): 2023-2028

[25] Jin Z,El-Deiry W S.Review overview of cell death signaling pathways [J].Cancer Biology & Therapy,2005,4(2): 139-163

[26] Nagata S,Nagase H,Kawane K,et al.Degradation of chromosomal DNA during apoptosis[J].Cell Death & Differentiation,2003,10(1): 108-116

[27] Luzio A,Monteiro S M,Fontaínhas-Fernandes A A,et al.Copper induced upregulation of apoptosis related genes in zebrafish (Danio rerio) gill [J].Aquatic Toxicology,2013,128: 183-189

◆

Effects of Silver Nanoparticles and Silver Ions on the Early Development of Zebrafish Embryos and Toxicity Mechanisms

Xin Qi1,2，Zhang Qiang1,2，Cheng Jinping1,2,*

1.State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research,East China Normal University,Shanghai 200062,China 2.City University of Hong Kong Shenzhen Research Institute,Shenzhen 518057,China

16 November 2014 accepted 12 January 2015

To investigate the effects of silver nanoparticles (Ag NPs) on the early development of aquatic organisms and compare with that of silver ions,zebrafish embryos were selected and exposed to different concentrations of Ag NPs or Ag+from 4 hours post fertilization (hpf) to 96 hpf.The survival,hatching and malformations of treated zebrafish embryos were examined.The cell apoptosis in treated zebrafish embryos were observed by the acridine orange (AO) staining.Related genes and their expression profiles were analyzed with fluorescence quantitative PCR.Results showed that exposure to Ag NPs or Ag+induced increased mortality,decreased hatching rate and delayed hatching in zebrafish embryos in a concentration-dependent manner.The 96 h half lethal concentration (96 h-LC50)of Ag NPs and Ag+on zebrafish embryos were 11.75 mg·L-1and 0.054 mg·L-1respectively.The toxicity of Ag+was greater than that of Ag NPs.Exposed zebrafish embryos exhibited shorter body length and enlarged yolk sac.The AO staining results showed cell apoptosis in the trunk and yolk sac of zebrafish were observed respectively after treatment with Ag NPs and Ag+.The gene expression analysis showed that Ag NPs significantly up-regulated the expression of caspase9 in zebrafish embryos at the concentration of 1.93 mg·L-1(P<0.05).Exposure to 0.006 mg·L-1of Ag+significantly up-regulated the expressions of COX-2a (P<0.01) and COX-17 (P<0.05) in zebrafish embryos.The expression level of p53 gene were also significantly increased in zebrafish embryos after exposed to 0.036 mg·L-1Ag+(P<0.05).This study suggested Ag NPs could induce apoptosis in zebrafish embryos via the caspase-dependent pathway and thus affected the development of exposed zebrafish embryos.However,exposure to Ag+not only affected the oxidation-related gene pathway,but also induced apoptosis via p53 pathway and inhibited the development of exposed zebrafish embryos.

silver nanoparticles; silver ions; zebrafish embryos; apoptosis; development

國家自然科學基金(41101489)；廣東省自然科學基金(s2012010010847)；教育部新世紀優(yōu)秀人才計劃項目(NECT-12-0181)；河口海岸學國家重點實驗室自主課題(2012RCDW-01)

辛琦(1989-)，女，碩士研究生，研究方向為環(huán)境毒理學，E-mail: xinxin8922@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: jinpingcheng@gmail.com

10.7524/AJE.1673-5897.20141116002

2014-11-16 錄用日期：2015-01-12

1673-5897(2015)4-055-10

X171.5

A

程金平(1978—)，女，博士，研究員，主要研究方向為生態(tài)毒理學。

辛琦，章強，程金平.納米銀和銀離子對斑馬魚胚胎早期生長發(fā)育的影響及作用機制[J].生態(tài)毒理學報，2015,10(4): 55-64

Xin Q，Zhang Q，Cheng J P.Effects of silver nanoparticles and silver ions on the early development of zebrafish embryos and toxicity mechanisms [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 55-64 (in Chinese)