應(yīng)用生物配體模型研究鉛和鎘及其混合物聯(lián)合毒性

周亞，朱琳，馮劍豐，楊光

南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 污染過程與環(huán)境基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071

應(yīng)用生物配體模型研究鉛和鎘及其混合物聯(lián)合毒性

周亞，朱琳*，馮劍豐，楊光

南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 污染過程與環(huán)境基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071

為探討生物配體模型(BLM)對金屬混合物的適用性，以萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)為研究對象，以藻體內(nèi)短時間(≤60 min)生物積累量為指標(biāo)，研究了Pb和Cd對萊茵衣藻的聯(lián)合毒性作用。結(jié)果表明：Pb和Cd單獨(dú)暴露下,藻體內(nèi)生物積累過程可用米門方程(Michaelis-Menten equation)來描述。計(jì)算得到Cd傳輸位點(diǎn)的最大吸收通量Jmax為(8.312±0.034)×10-12mol·cm-2·s-1，該位點(diǎn)的半飽和系數(shù)(米門系數(shù))KM=(1.012±0.032)×10-6mol·L-1，穩(wěn)定常數(shù)KCd=0.988×106(mol·L-1)-1；Pb傳輸位點(diǎn)的Jmax為(1.28±0.039)×10-11mol·cm-2·s-1，該位點(diǎn)的KM=(3.56±0.34)×10-7mol·L-1，KPb為2.81×106(mol·L-1)-1。Cd和Pb的競爭實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)固定Cd的濃度，其吸收通量隨Pb的增加而顯著降低；固定Pb的濃度，其吸收通量隨Cd的增加略有降低。這表明Pb和Cd可能存在相同的傳輸位點(diǎn)，且Pb對傳輸位點(diǎn)的結(jié)合能力要遠(yuǎn)大于Cd。在低濃度Pb和Cd的混合暴露溶液中，短時間內(nèi)綠藻對Pb的生物積累量會遠(yuǎn)大于Cd。研究結(jié)果表明BLM可用于描述低濃度下Cd和Pb的競爭關(guān)系。

萊茵衣藻；重金屬；Pb；Cd；聯(lián)合毒性；生物配體模型

生物配體模型(biotic ligand model，BLM)是一種定量評價(jià)生態(tài)系統(tǒng)中水化學(xué)特性對于金屬形態(tài)和生物有效性影響的工具[1]。BLM的概念框架是對魚鰓絡(luò)合模型(gill surface interaction model，GSIM)和自由離子模型(free-ion-activity model，F(xiàn)IAM)的改進(jìn)與完善[2]，用于預(yù)測環(huán)境中金屬生物毒性的機(jī)理性模型。BLM的一個基本原理是將金屬的毒性和生物配體上金屬的積累聯(lián)系在一起[3]，應(yīng)用平衡地球化學(xué)模型框架，考慮自由金屬離子與自然存在的陽離子(如Ca2+,Na+,Mg2+,H+)的競爭，以及與非生物配體(如：溶解性有機(jī)碳，氯化物，碳酸鹽，硫化物等)和生物配體(結(jié)合位點(diǎn)或毒性作用位點(diǎn))的結(jié)合關(guān)系。

BLM認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞膜生物配體上結(jié)合的金屬超過一定限度時產(chǎn)生生物效應(yīng)，進(jìn)而通過計(jì)算結(jié)合到配體上的金屬量，以預(yù)測金屬的毒性(如LC50)。BLM是穩(wěn)定狀態(tài)模型，以結(jié)合在生物細(xì)胞表面作用位點(diǎn)(即生物配體，BL)上的金屬量為基礎(chǔ)參數(shù)。模型假定，在吸收過程中，金屬首先與生物膜表面的位點(diǎn)結(jié)合，之后通過結(jié)合位點(diǎn)的傳輸進(jìn)入到生物體內(nèi)，其中有效的吸收產(chǎn)生毒性作用。并假設(shè)生物積累的金屬與生物的效應(yīng)相關(guān)，在配體上結(jié)合的金屬量與吸收通量之間有一定的比例關(guān)系[4]。

目前，BLM已經(jīng)被用于預(yù)測和解釋多種單一金屬(Ag、Cd、Cu、Ni、Co、Pb和Zn等)對多種水生生物(如魚類、大型溞和單胞藻等)的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)，并且金屬種類與受試生物的范圍還在不斷擴(kuò)大[5]。美國環(huán)保局(US EPA)[6]和歐盟化學(xué)品管理局(ECB)[7]已經(jīng)將BLM用于淡水系統(tǒng)中來推導(dǎo)銅的水質(zhì)基準(zhǔn)。歐盟也啟動了一項(xiàng)歐盟水環(huán)境框架導(dǎo)則，要求所有的歐盟成員國確保他們所有的內(nèi)陸和外海水環(huán)境質(zhì)量在2015年達(dá)到一個好的水體質(zhì)量，在該框架導(dǎo)則中特別推薦運(yùn)用BLM評價(jià)重金屬的生物慢性毒性，并作為校準(zhǔn)水環(huán)境質(zhì)量基準(zhǔn)值的一個有效手段[8]。但現(xiàn)實(shí)環(huán)境中，金屬的污染常是多來源、多種類的復(fù)合污染。金屬之間可能存在拮抗、相加或協(xié)同作用，同時也可能受到自然條件及本身理化性質(zhì)的影響，其作用機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜,如張融等[9]以大型蚤為研究對象，以蚤體內(nèi)的金屬硫蛋白(MT)含量為毒性指標(biāo)，研究了重金屬Cd和Zn對大型蚤的聯(lián)合毒性作用，在不同實(shí)驗(yàn)條件下所得到的結(jié)果相互矛盾。因此，本研究試圖在解釋其機(jī)制的基礎(chǔ)上給出毒性的預(yù)測，以量化金屬混合物對生物的影響，并將BLM的方法推廣到混合物聯(lián)合作用的研究。Niyogi和Wood[10]在關(guān)于BLM的綜述中，也指出了利用BLM的方法評價(jià)多種金屬聯(lián)合毒性是未來研究的發(fā)展方向。Veltman等[11]試圖將BLM的理論與金屬的生物積累動力學(xué)相結(jié)合。然而，由于金屬聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的缺失，將該方法真正應(yīng)用于對金屬混合物評價(jià)的研究還非常有限。因此，需要更多的研究以評價(jià)BLM對預(yù)測聯(lián)合毒性的潛力。

Pb和Cd由于人類活動的影響在自然環(huán)境中廣泛存在，并且具有較大的毒性，屬于重要的優(yōu)先控制污染物。Pb是一種典型的非必需毒性金屬元素，即使在很低濃度下也可產(chǎn)生生物積累[12]。已經(jīng)有平衡模型成功應(yīng)用于鉛積累研究的先例[13]。Cd也是典型的毒性元素，會對人體呼吸道產(chǎn)生刺激，并可積存于肝或腎臟，形成生物富集[14-15]。Pb和Cd同為二價(jià)有毒重金屬，之前已有研究成功運(yùn)用生物配體模型預(yù)測Ca2+離子存在條件下，Pb和Cd對土壤中費(fèi)氏弧菌的聯(lián)合毒性[16]，而BLM模型對于水生生物的聯(lián)合毒性的適用性還不清楚。本論文擬通過研究綠藻中Pb和Cd生物積累的相互影響，驗(yàn)證BLM模型對于金屬混合物聯(lián)合毒性的適用性。研究的一個基本假設(shè)是在金屬混合物中，與金屬在暴露溶液中的濃度相比，富集在金屬傳輸位點(diǎn)上金屬的量能更準(zhǔn)確地預(yù)測毒性效應(yīng)，并假設(shè)2種金屬具有相同的傳輸位點(diǎn)[17-18]。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)選取淡水單胞藻萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)作為受試生物。藻種購于中科院水生生物研究所，采用SE培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:(20±1) ℃,12 h(光):12 h(暗)，5 000 lx[19]。首先將藻種先接種在含1.5%瓊脂的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，而后轉(zhuǎn)接至SE培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)5 d后，使藻的濃度達(dá)到(1～3)×106cellsmL-1,再將一定體積的藻轉(zhuǎn)接到新的SE培養(yǎng)基中，使其稀釋濃度達(dá)到1×105cellsmL-1。繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，觀察藻的濃度，若達(dá)到(1～3)×106cellsmL-1，認(rèn)為藻已達(dá)到其對數(shù)生長期的中后期，則該批藻類可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 單金屬的生物積累實(shí)驗(yàn)

生物積累實(shí)驗(yàn)選取處于對數(shù)生長中后期的藻(1～3)×106cellsmL-1，將藻液導(dǎo)入50 mL離心管中,離心(3 200 r·min-1，4 min)后倒掉上清液，再反復(fù)2次用2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES，Sigma)作為緩沖液，使藻懸浮后重新離心并棄掉上清液，將藻液用緩沖液濃縮至50 mL用于生物積累實(shí)驗(yàn)。MES緩沖液的離子強(qiáng)度為10-2mol·L-1，并含有10-5mol·L-1的Ca(NO3)2(為保護(hù)藻類細(xì)胞壁的完整)[20],并用0.6 mol·L-1的HNO3將緩沖液的pH調(diào)至6.0。

1.2.1 Cd的生物積累實(shí)驗(yàn)

暴露溶液中Cd的濃度范圍為6×10-8mol·L-1到1×10-5mol·L-1(表1)，暴露溶液體積為450 mL。根據(jù)設(shè)定濃度，計(jì)算出所需母液的(Cd，1 000 μgmL-1)含量，進(jìn)行配置。每次配置，預(yù)留5 mL的暴露溶液，用ICP-MS進(jìn)行濃度的測定，測得的結(jié)果為暴露溶液濃度。濃度范圍的選取既要保證對藻較低的抑制率，同樣還要能夠獲得足夠的金屬累積量以便于測量，另外還要考慮到容器壁的吸附及人為操作誤差等因素。暴露時間為60 min，分別于t=0，10，20，30，40，50，60 min時取樣。取樣時，先取10 mL的暴露溶液于離心管中，再加入0.2 mL 0.1 mol·L-1的EDTA/MES(pH=6)終止生物積累[20](每次試驗(yàn)取3次平行樣，每組重復(fù)2次)，搖勻后進(jìn)行過濾取樣。

1.2.2 Pb的生物積累實(shí)驗(yàn)

暴露溶液中Pb的濃度范圍為3×10-8mol·L-1到5×10-6mol·L-1(表1)，最低濃度小于地表水一類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(10 μgL-1，地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB3838—2002)，最高濃度近似我國污水排放標(biāo)準(zhǔn)(1 000 μgL-1，污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)GB18466—2005)。其他條件同2.2.1。

1.3 Cd與Pb的生物積累實(shí)驗(yàn)

濃度范圍選取2種金屬最大吸收速率的濃度范圍附近，固定Cd(Pb)的濃度(1×10-6，5×10-6，8×10-6，1×10-5mol·L-1)，改變競爭金屬離子Pb(Cd)的濃度(1×10-6，1.6×10-6，3×10-6，5×10-6mol·L-1)，分別觀察不同濃度的競爭離子對前一金屬吸收速率的影響。暴露溶液體積為450 mL，暴露時間60 min(每次試驗(yàn)取3次平行樣，每組重復(fù)2次)。用0.5 mL 0.1 mol·L-1的EDTA/MES(pH=6)終止生物累積，搖勻后分別取10 mL進(jìn)行過濾取樣。

對于藻體內(nèi)積累的金屬含量，將樣品用真空泵經(jīng)0.45 μm硝化纖維濾膜過濾，并用0.01 mol·L-1的EDTA對濾膜進(jìn)行沖洗，以去除藻體表面的金屬。取出濾膜放入15 mL的離心管中，加入300 μL 65%的濃硝酸，放置85 ℃水浴鍋中4～5 h，至濾膜完全溶解，后加水稀釋至總體積10 mL。用ICP-MS分別對藻體內(nèi)和濾液中的金屬進(jìn)行濃度測定。

1.4 BLM模型與數(shù)據(jù)分析

BLM應(yīng)用中的基本公式及參數(shù)

Jint=kint{M-Rcell}

Jint:金屬吸收通量(mol·cm-2·min-1)；kint：吸收速率常數(shù)(min-1)；{M-Rcell}：富集到生物敏感位點(diǎn)上金屬的量(mol·cm-2)。

金屬和生物配體間的相互作用過程可描述為：

可簡化表述為：{MBL}=KM-Rs{BL}{M}

M：溶液中的自由金屬離子；BL：生物質(zhì)膜上的生物配體；kf、kd、kint：金屬同生物配體的絡(luò)合、解離及吸收速率常數(shù)；KM-Rs：金屬和生物配體的反應(yīng)平衡常數(shù)。

如果考慮其他陽離子的競爭作用：

{CBL}=KC-Rs{BL}{C}

C：與金屬競爭的陽離子；KC-Rs：該陽離子和生物配體的反應(yīng)平衡常數(shù)。KM-Rs、金屬在生物配體上的累積量、以及EC50/LC50值，通常是通過金屬累積量、金屬膜通量、金屬毒性試驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合多元非線

表1 暴露溶液中Cd、Pb的濃度Table 1 The concentration of Cd and Pb in the exposure solution

性回歸方法、Langmuir等溫吸附方程、Michaelis-Menten方程求得。

(1)

其中，Jmax：飽和時的金屬吸收通量；KM：米氏常數(shù)，即半飽和常數(shù)；[Mz+]:溶液中自由金屬的平衡濃度。

假設(shè)金屬通過生物膜的傳輸過程是限制因素，那么金屬與生物配體間的絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)(KM-Rs)可通過KM的倒數(shù)來求：

若kint<

(2)

在穩(wěn)定條件下，可將米氏常數(shù)的倒數(shù)，即KM-Rs，作為親和力常數(shù)，來描述金屬與質(zhì)膜上的吸收位點(diǎn)間的相互作用。另外，當(dāng)有競爭性陽離子存在時，其競爭效應(yīng)可通過公式(3)描述：

(3)

KC-Rs:與金屬M(fèi)z競爭相同富集位點(diǎn)金屬Cn的親和力常數(shù)；[Cn]：競爭金屬離子的濃度。通過測定濾液中溶解金屬的濃度進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，如果質(zhì)量平衡的計(jì)算結(jié)果低于或高于最初配制濃度的20%，說明取樣或測試過程有誤，則舍去該數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± sd)表示，采用ORIGIN 8.6統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 Cd、Pb單獨(dú)暴露下的生物積累

在60 min的短期暴露中，藻細(xì)胞體內(nèi)積累的單一金屬隨時間呈線性增加(圖1)。這表明Cd和Pb的生物積累在60 min內(nèi)可以通過穩(wěn)定的吸收通量(Jint)來描述。暴露溶液中測得的重金屬濃度通常會低于配置濃度，這是由于低濃度下，金屬往往會吸附到容器及藻表面。測定結(jié)果顯示，金屬在綠藻體內(nèi)的生物量可以很好地用米門方程進(jìn)行描繪(圖2和圖3)。由公式1計(jì)算出Cd傳輸位點(diǎn)的最大吸收通量Jmax為(8.312±0.034)×10-12mol·cm-2·s-1,該位點(diǎn)的半飽和系數(shù)(米門系數(shù))KM=(1.012±0.032)×10-6mol·L-1。

在自由離子濃度為6×10-8mol·L-1到1×10-6mol·L-1時,吸收通量隨自由離子濃度的增加呈現(xiàn)線性增加；當(dāng)自由離子的濃度增加至1×10-6到10-5mol·L-1的范圍后,吸收通量呈現(xiàn)飽和的趨勢,吸收通量幾乎不變。

圖1 pH=6.0,[M]tot=10-6mol·L-1藻細(xì)胞吸收的Cd和Pb隨時間的變化

圖2 Cd單獨(dú)存在時濃度與吸收通量的關(guān)系

圖3 Pb單獨(dú)存在時濃度與吸收通量的關(guān)系

由公式2得到KCd=0.988×106(mol·L-1)-1。這與kola等[22]運(yùn)用生物配體模型，研究萊茵衣藻對單金屬Cd在10-10mol·L-1到10-4mol·L-1范圍內(nèi)，得到的穩(wěn)定常數(shù)相似(106(mol·L-1)-1)。

同樣，用米門方程計(jì)算出Pb傳輸位點(diǎn)的最大吸收通量Jmax為(1.28±0.039)×10-11mol·cm-2·s-1,該位點(diǎn)的KM=(3.56±0.34)×10-7mol·L-1。在自由離子濃度為3×10-8mol·L-1到5×10-7mol·L-1濃度范圍內(nèi)，吸收通量值呈線性增加；當(dāng)自由離子濃度增加到5×10-7mol·L-1到5×10-6mol·L-1的范圍后，吸收通量幾乎不變，在穩(wěn)定條件下，由公式2可求得Pb金屬傳輸?shù)腒Pb為2.81×106(mol·L-1)-1，這與前人研究萊茵衣藻對單金屬Pb在5×10-8mol·L-1到10-5mol·L-1范圍內(nèi)，得到的穩(wěn)定常數(shù)相近[19]。

相比其他二價(jià)金屬，Pb和Cd的穩(wěn)定常數(shù)要明顯大于Ca(104.5(mol·L-1)-1[20]，104.0(mol·L-1)-1[21])，與Cu(105.8(mol·L-1)-1[19])的穩(wěn)定常數(shù)相似，比Mn(107.0(mol·L-1)-1；107.1(mol·L-1)-1[17])和Zn(107.7(mol·L-1)-1；107.5(mol·L-1)-1[17])的穩(wěn)定常數(shù)低一個數(shù)量級左右。另外，有研究表明Ni和Mg可能存在相同的傳輸位點(diǎn)[22]，而Ca和Cd可能存在相同的傳輸位點(diǎn)[23]，這為我們探究Pb和Cd是否存在相同的傳輸位點(diǎn)提供了參考。

2.2 Pb對Cd生物積累的影響

如圖4所示，當(dāng)Cd的濃度為8×10-6mol·L-1和1×10-5mol·L-1時，Cd的吸收隨Pb濃度的升高而明顯降低；當(dāng)Cd的濃度低于5×10-6mol·L-1時，生物積累量受Pb濃度變化的影響較小。BLM假設(shè)，細(xì)胞膜上有一定數(shù)量的活性位點(diǎn)可與金屬結(jié)合，當(dāng)金屬濃度較低時，膜上有足夠的活性位點(diǎn)，因而競爭金屬不足以對目標(biāo)金屬的吸收通量產(chǎn)生明顯影響。隨著競爭離子濃度的增加，將會與目標(biāo)金屬競爭結(jié)合細(xì)胞膜上的活性位點(diǎn)，表現(xiàn)為競爭金屬的吸收通量增加，而目標(biāo)金屬的吸收通量降低[24]。本研究表明Pb對Cd的吸收影響基本符合BLM的競爭機(jī)制假設(shè)，兩者存在明顯的競爭性。

圖4 Pb競爭對不同[Cd2+]條件下Cd吸收通量的影響

根據(jù)BLM假設(shè)，在生物累積作用中，如果不同的金屬有相同的活性結(jié)合位點(diǎn)，那么競爭關(guān)系可以通過以下公式進(jìn)行描述：

由圖4擬合的曲線可得，2種金屬在不同濃度下，求得Pb對Cd結(jié)合位點(diǎn)的穩(wěn)定常數(shù)及不同濃度條件下Cd的最大吸收通量(Jmax(Cd))(表2)。通過競爭實(shí)驗(yàn)求得的穩(wěn)定常數(shù)與單金屬短期暴露實(shí)驗(yàn)得到的參數(shù)接近，隨著Cd離子濃度的增加，Pb的穩(wěn)定常數(shù)(LogKPb)增大，即Pb對Cd的競爭作用逐漸增強(qiáng)，也表明這2種金屬在細(xì)胞膜的活性位點(diǎn)上產(chǎn)生了競爭作用，且Pb對Cd的競爭作用較強(qiáng)。

根據(jù)假設(shè)，在2種金屬濃度相近的條件下，如果2種金屬有共同的富集位點(diǎn)，則每種金屬的吸收通量都會出現(xiàn)降低；相反，如果2種金屬有各自不同的吸收位點(diǎn)，則不會出現(xiàn)吸收通量降低的現(xiàn)象[16]。由表2可得，在Pb存在的條件下，Cd的吸收通量明顯降低，當(dāng)Cd的濃度為1×10-6mol·L-1時，吸收通量僅為非競爭條件下的46%，說明Pb和Cd在綠藻細(xì)胞表面應(yīng)該存在相同的富集位點(diǎn)，且Pb與細(xì)胞膜上位點(diǎn)結(jié)合的能力要遠(yuǎn)大于Cd，因而導(dǎo)致Cd的吸收通量明顯降低。

表2 利用BLM公式擬合圖4中的數(shù)據(jù)求出KPb和Jmax

2.3 Cd對Pb生物積累的影響

如圖5所示，在隨著Cd濃度從0增加到10-5mol·L-1，Pb的吸收通量逐漸降低。當(dāng)Cd濃度較低時，競爭離子沒有顯著降低Pb的生物累積量。雖然當(dāng)Cd的濃度在較高濃度范圍(5×10-6mol·L-1到1×10-5mol·L-1)時，Pb的吸收通量會有所降低，但并不顯著(t檢驗(yàn)，P>0.05)。根據(jù)BLM假設(shè)，Cd對Pb的競爭作用可用如下公式進(jìn)行描述，

由圖5擬合的曲線，2種金屬在不同濃度下，可求得Cd對Pb結(jié)合位點(diǎn)的富集常數(shù)(表3)。從擬合圖中可看出，Pb在不同的濃度條件下，競爭離子Cd對其競爭作用不顯著，即使Cd的濃度范圍從10-6mol·L-1升高至10-5mol·L-1，對Pb最大吸收通量的影響仍很小(t檢驗(yàn)，P>0.5)。Pb在1×10-6到5×10-6mol·L-1范圍內(nèi)，大約為國標(biāo)Ⅴ類水標(biāo)準(zhǔn)(100 μgL-1)的2到10倍，Cd在1×10-6到1×10-5mol·L-1范圍內(nèi)，大約為國標(biāo)Ⅴ類水標(biāo)準(zhǔn)(10 μgL-1)的10到100倍。綠藻在此范圍內(nèi)對Pb的生物富集量要明顯大于Cd(t檢驗(yàn)，P≤0.05)，這也為更低濃度條件下，生物對2種重金屬的競爭積累提供了一定的參考。從兩者在非競爭條件下得到的穩(wěn)定常數(shù)上看，Cd的穩(wěn)定常數(shù)要小于Pb，最大吸收通量(Jmax)也要比Pb小0.5個數(shù)量級左右，即Pb與細(xì)胞膜上位點(diǎn)結(jié)合能力要比Cd更強(qiáng)，以致較高濃度的Cd仍不足以對較低濃度的Pb形成顯著的競爭作用。這與單一金屬試驗(yàn)結(jié)果相吻合。由表2可得不同濃度的Pb，在有競爭離子Cd的條件下的吸收通量。與無競爭離子條件相比，吸收通量沒有發(fā)生太大的變化，即Cd對Pb在吸收位點(diǎn)上的競爭能力較弱，并不足以對Pb產(chǎn)生明顯的競爭作用。

圖5 Cd競爭對不同[Pb2+]條件下Pb吸收通量的影響

表3 利用BLM公式擬合圖5中數(shù)據(jù)求出KCd和Jmax
Table 3 Applying BLM formula to fit the data in Figure 5 to obtain KCdand Jmax

Pb離子濃度/(mol·L-1)TheconcentrationofPb/(mol·L-1)穩(wěn)定常數(shù)/((mol·L-1)-1)LogKPb/((mol·L-1)-1)最大吸收通量Jmax(Pb)1×10-65.15(5.05～4.25)(0.951±0.037)×10-111.6×10-64.41(4.38～4.45)(0.984±0.017)×10-113×10-63.84(3.83～3.85)(1.154±0.058)×10-115×10-63.94(3.94～3.95)(1.181±0.019)×10-11

綜上，金屬對生物體的生物效應(yīng)中，最先發(fā)生的就是生物累積，即生物需要先將金屬從溶液中吸收到體內(nèi)。Pb和Cd作為目標(biāo)金屬，最初的假設(shè)是這2種重金屬很有可能有相同的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而探究2種金屬對細(xì)胞膜上配體結(jié)合能力的差異。通過對Pb和Cd分別進(jìn)行單金屬的暴露試驗(yàn)，計(jì)算出各自的穩(wěn)定常數(shù)。再固定1種金屬濃度，改變另一種金屬濃度的暴露試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Cd與Pb應(yīng)該存在相同的結(jié)合位點(diǎn)。由于Pb的穩(wěn)定常數(shù)和吸收通量都明顯大于Cd，可推測出Pb與活性位點(diǎn)的結(jié)合能力更強(qiáng)，不同濃度混合試驗(yàn)條件下的試驗(yàn)也驗(yàn)證了這點(diǎn)。即暴露溶液中若同時存在低濃度的Pb和Cd，綠藻會對Pb產(chǎn)生更多的生物積累，這也為進(jìn)一步修訂水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)提供了一定的理論參考，表明了BLM可用于描述低濃度下Cd和Pb對萊茵衣藻的競爭關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)僅考慮了不同濃度條件下的競爭，沒有考慮存在其他陽離子(如Ca2+，K+，Mg2+等)及有機(jī)配體條件下的競爭條件，因此模型仍需要進(jìn)一步研究。

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Validation of the Biotic Ligand Model (BLM) Predicting Pb,Cd and Their Mixtures Toxicity

Zhou Ya,Zhu Lin*,Feng Jianfeng,Yang Guang

Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria,Ministry of Education,Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control,College of Environmental Science and Engineering,Nankai University,Tianjin 300071,China

13 March 2015 accepted 30 April 2015

In order to explore the applicability of biotic ligand model (BLM) to metal mixture,Chlamydomonas reinhardtii was chosen as a testing organism,and the bioaccumulation was used as the index to investigate the joint toxic effects of Cd and Pb.The results indicated that for the individual Cd or Pb exposure,Cd bio-uptake was well described by a Michaelis-Menten equation with the constants: Jmax=(8.312±0.034)×10-12mol·cm-2·s-1,KM=(1.012±0.032)×10-6mol·L-1,KCd=0.988×106(mol·L-1)-1; Pb bio-uptake was described by the equation with the constants: Jmax=(1.28±0.039)×10-11mol·cm-2·s-1,KM=(3.56±0.34)×10-7mol·L-1,KPb=2.81×106(mol·L-1)-1.In the competition experiment of Cd and Pb,we found that the maximum influx rate (Jmax) of Cd (Pb) decreased with the increase of Pb (Cd) concentration,and the competition between Pb and Cd can be described by BLM.The results suggested that Cd and Pb were likely to share a common bio-uptake pathway,and in a short period (≤60 min),the combination ability of Pb to bio-uptake pathway was greater than Cd in the low mixed solution of Pb and Cd.

Chlamy domonas reinhardtit; heavy metal; Pb; Cd; joint toxicity; biotic ligand model (BLM)

國家自然科學(xué)基金(21277076);國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2012ZX07501-003)

周亞(1990-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail: zhouxiaoya0910@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: zhulin@nankai.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150313004

2015-03-13 錄用日期：2015-04-30

1673-5897(2015)4-047-08

X171.5

A

朱琳(1957—)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生態(tài)毒理學(xué)，環(huán)境生物學(xué)，海洋生態(tài)學(xué)等方面的研究。

周亞，朱琳，馮劍豐，等.應(yīng)用生物配體模型對鉛和鎘及其混合物聯(lián)合毒性研究[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015,10(4): 47-54

Zhou Y,Zhu L,Feng J F,et al.Validation of the biotic ligand model (BLM) to Pb and Cd,and their mixtures [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 47-54 (in Chinese)