深海細(xì)菌及其活性物質(zhì)防控植物病原真菌的研究進(jìn)展

孫曉磊, 閆培生, 王 凱, 王文威, 李夢瀛

哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 威海 264209

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深海細(xì)菌及其活性物質(zhì)防控植物病原真菌的研究進(jìn)展

孫曉磊, 閆培生*, 王 凱, 王文威, 李夢瀛

哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 威海 264209

近年來，從天然產(chǎn)物中開發(fā)生物農(nóng)藥成為了研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，海洋微生物因其獨(dú)特的生存環(huán)境，產(chǎn)生了許多從陸地微生物中未曾發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)，為新型生物農(nóng)藥開發(fā)帶來了佳音。從微生物多樣性、抑菌物質(zhì)的種類與結(jié)構(gòu)和抑菌機(jī)理3個(gè)方面闡述深海細(xì)菌防控植物病原真菌的研究進(jìn)展，并對其發(fā)展前景進(jìn)行了展望，以期為抗植物病原真菌的海洋微生物的開發(fā)利用提供參考。

深海細(xì)菌；植物病原真菌；產(chǎn)毒真菌；抑菌機(jī)理

海洋是微生物資源的一大寶庫，其獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)造就了具有獨(dú)特功能的海洋微生物，海洋微生物種類約100多萬種，其多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過陸地微生物。隨著人們對海洋研究的深入，發(fā)現(xiàn)海洋微生物中蘊(yùn)藏許多結(jié)構(gòu)新穎、生物活性強(qiáng)的代謝產(chǎn)物，這些天然產(chǎn)物成為新藥開發(fā)的重要來源。其中，由海洋微生物天然產(chǎn)物制成的農(nóng)用抗生素(agricultural antibiotics)在植物耐藥真菌的防治方面取得了很多進(jìn)展[1～4]。植物真菌性病害難于防治、造成的損失嚴(yán)重，是多種重要糧食作物的主要病害，在水稻的240多種病害中，90%為真菌性病害[5]。海洋微生物在對抗植物病原真菌方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，其天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)獨(dú)特，與病原真菌沒有交叉反應(yīng)，不易產(chǎn)生抗藥性；具有豐富的抗菌機(jī)制，既可制備各種生物農(nóng)藥，又可利用微生物制備拮抗菌劑。本文從產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的海洋微生物種類、活性物質(zhì)及活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)特征以及抑菌機(jī)理等方面對目前取得的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，以期為抗植物病原真菌和產(chǎn)毒真菌的海洋微生物的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供參考。

1 防控植物病原真菌的深海細(xì)菌的物種多樣性

作為海洋微生物天然產(chǎn)物的重要來源，已發(fā)現(xiàn)的海洋可培養(yǎng)細(xì)菌主要包括假單胞菌屬(Pesudomonas)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteomonas)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、腸桿菌屬(Enterobacterium)、芽胞桿菌屬(Bucillus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、微球菌屬(Micrococcus)、欽氏菌屬(Chainia)以及著色菌屬(Chromtium)等屬[6]。

海洋細(xì)菌由于其具有分布范圍廣泛、代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎、抑菌作用強(qiáng)和抑菌譜廣的優(yōu)勢[7]，一些海洋細(xì)菌已用于植物病害的生物防治[8～12]，表1匯總了部分國內(nèi)外已研究的具有抑制植物病原真菌活性的海洋細(xì)菌及其產(chǎn)生的活性物質(zhì)、靶標(biāo)和分離來源等信息，從表中可以看出，這些拮抗細(xì)菌的物種主要包括假單胞菌(Pseudomonas)、粘細(xì)菌(Haliangium)、芽胞桿菌(Bacillus)、海洋單胞菌(Marinomonas)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)和類芽胞桿菌(Paenibacillus)等，其生存的生態(tài)環(huán)境包括海洋生物體內(nèi)(如海藻、珊瑚等)、不同海域與不同深度的沉積物和極地等。

表1 海洋細(xì)菌拮抗植物病原真菌的國內(nèi)外研究概況Table 1 Foreign and domestic researches on agricultural antifungal antibiotics from marine microorganisms.

注：“-”表示該項(xiàng)未知。

2 活性物質(zhì)的種類與結(jié)構(gòu)特征

科學(xué)家利用結(jié)晶分析和其他測試技術(shù)對從深海細(xì)菌分離到的化合物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其中許多物質(zhì)結(jié)構(gòu)新穎且罕見，如芬薺素(fengycins)家族的寧康霉素(nincomycin)，對絲狀植物病原真菌有很好的抑制效果[13]。國內(nèi)外報(bào)道的海洋細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)的類型主要有肽類、蛋白類、酯類、糖苷類、醌類、苯丙素類、黃酮類和生物堿等[30]。

2.1 肽類

2.1.1 脂肽類 脂肽是由親水的肽鏈和親油的脂肪烴鏈兩部分組成，很多芽胞桿菌能夠產(chǎn)生具有抗真菌[31]、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[32]、促進(jìn)芽胞桿菌在植物根際生態(tài)系統(tǒng)中定殖[33]的脂肽類活性物質(zhì)。目前已報(bào)道的具抗真菌活性的包括伊枯草菌素(iturins)、fengycins、表面活性素(surfactins)家族的脂肽類物質(zhì)[34]，其中iturins和fengycins抗真菌效果相對顯著。目前已報(bào)道的iturins主要有bacillomycin D、F、L、Lc、S，iturin A、Al、C，mycosubtilin，mixirin。從海洋細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的iturins包括bacillomycin Lc、iturin A[18]，以及近幾年新發(fā)現(xiàn)的maribasins[35]、subtulene[36]、mojavensin[37]和bacillopeptin A(圖1)[16]等。Iturin家族的脂肪酸碳鏈長度在14～17個(gè)碳原子不等，分子量在1 000 Da左右。作為一種常見的伊枯草菌素，iturin A的抑菌活性甚至能與一些化學(xué)農(nóng)藥相比，在植物病害的生物防治方面前景廣闊[18]。Fengycins是芽胞桿菌產(chǎn)生的另一類脂肽，fengycins家族典型有fengycin A、B兩種結(jié)構(gòu)，脂肪酸碳鏈長度為14～18個(gè)碳原子，分子量在1 500 Da左右，fengycins區(qū)別于其他環(huán)脂肽的是，除4種D-氨基酸和鳥氨酸，其余氨基酸均為L-氨基酸，后8位氨基酸形成肽環(huán)，對絲狀真菌具有明顯抑制效果，且溶血活性較伊枯草菌素類低[38]，從海洋細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的fengycins有nincomycin[13]、6-abufengycin[39](圖2)等。相比化學(xué)農(nóng)藥和傳統(tǒng)抗生素，脂肽具有對動植物無害、可生物降解以及不易使病原真菌產(chǎn)生交叉抗性等優(yōu)點(diǎn)，隨著海洋資源的進(jìn)一步開發(fā)，將會發(fā)現(xiàn)更多新型抗植物病原真菌脂肽[40]。

2.1.2 縮肽類 2006年Iizuka等[41]從海洋中分離出一株弱好鹽細(xì)菌SMH-27-4，其發(fā)酵產(chǎn)物中含有一種新抗生素miuraenamides A和B(圖3)，它們?yōu)榭s合肽類化合物，miuraenamides A具有較強(qiáng)的抑制植物病原菌(如Phytophthorasp.)的活性[42]。并且，與多烯類化合物myxalamid對真菌的抑制作用[43]類似，此種縮肽類化合物也可作用于真菌呼吸鏈電子傳遞系統(tǒng)，抑制NADH氧化。

2.2 抗菌蛋白

海洋細(xì)菌L1-9可產(chǎn)生對植物病原真菌具抑制作用的蛋白酶、葡聚糖酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶[44]。海洋細(xì)菌TC-1產(chǎn)生的抗菌蛋白對香蕉枯萎病有明顯的抑制作用，推測其為耐高溫的堿性蛋白酶和中性蛋白酶[45]。Osawa等[46]在海洋細(xì)菌V.fluvialis、V.pacohaemolyticus、V.mimicus、V.algionlyticus、Idstoaellaangudlanun及Aeromonashudrophila中發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和纖維素酶是對真菌產(chǎn)生抑制作用的主要酶類[47～51]。

圖1 Iturins家族化合物結(jié)構(gòu)式[16,22,35～37]Fig.1 Structures of iturins family compounds[16,22,35～37].

圖2 Fengycins家族化合物6-abufengycin結(jié)構(gòu)式[39]Fig.2 The structure of 6-abufengycin from fengycins family[39].

圖3 縮肽類化合物miuraenumides A、B結(jié)構(gòu)式[43]Fig.3 The structure of miuraenumides A,B[43].

2.2.1 幾丁質(zhì)酶 幾丁質(zhì)(chitin)又名甲殼素，是N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1，4糖苷鍵連接的直鏈多聚物，廣泛存在于自然界，特別是海洋中。幾丁質(zhì)作為真菌細(xì)胞壁的主要成分可被幾丁質(zhì)酶酶解為N-乙酰氨基葡萄單糖。幾丁質(zhì)酶屬糖苷水解酶18、19家族，其定義有廣義、狹義之分，廣義的幾丁質(zhì)酶是指所有與幾丁質(zhì)降解有關(guān)的酶，包含脫乙酰酶、殼聚酶、幾丁寡糖酶和幾丁二糖酶等，狹義的幾丁質(zhì)酶是指催化水解至少含有一個(gè)N-乙酰葡萄胺基團(tuán)糖苷鍵的酶，包括幾丁內(nèi)切酶和幾丁外切酶[52]。幾丁質(zhì)酶的分子結(jié)構(gòu)主要包括信號肽序列、催化區(qū)、特異性結(jié)合區(qū)域和C端區(qū)域。其中催化區(qū)具2個(gè)高度保守區(qū)，Glu和Asp殘基高度保守。來源于同一菌株的酶的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域具有相似性，而不同來源的幾丁質(zhì)酶結(jié)合區(qū)域也不同[53～55]。

2.2.2 葡聚糖酶 β-1，3-葡聚糖酶是植物抗真菌病的重要抗性物質(zhì)之一，具破壞真菌細(xì)胞壁并將其殺死的能力。有關(guān)β-1，3-葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)研究比較晚。現(xiàn)已知其是一種混合酶系包含內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶和外切β-1，3-葡聚糖酶，其中內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶更易降解真菌細(xì)胞壁，最終導(dǎo)致菌體自溶[56]。已知的β-1，3-葡聚糖酶均屬于糖基水解酶第十七家族[57]，其成員具有共同的序列結(jié)構(gòu)：(LIVM)X(LIVMFYM)3(STAG)E(ST)GWP(ST)XG[50]。

2.2.3 纖維素酶 纖維素酶是由多種水解酶組成的復(fù)雜酶系，通常人們從習(xí)慣上將纖維素酶分成3類：葡聚糖外切酶(C1)、葡聚糖內(nèi)切酶(Cx)酶和β葡萄糖苷酶(CB)。C1酶是對纖維素最初起作用的酶，破壞纖維素鏈的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，生成纖維二糖。Cx酶是作用于經(jīng)C1酶活化的纖維素、分解β-1，4-糖苷鍵的纖維素酶。β-葡萄糖苷酶可以將纖維二糖、纖維三糖及其他低分子纖維糊精分解為葡萄糖[58～60]。馬炳田等[51]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，供試菌株纖維素酶活力可能與其生物防治潛能有一定關(guān)系，纖維素酶活力越高，生防潛能越大。大多數(shù)纖維素酶都由一個(gè)或多個(gè)催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain，CD)和纖維素結(jié)合區(qū)(cellulose binding domain，CBD)組成，中間由一段可辨認(rèn)的連接肽(linker peptide)所連接[61]。

2.3 酯類

Fudou等[27]從海洋粘細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了能抑制多種植物病原真菌的含β-甲氧基丙烯酸酯基團(tuán)的多不飽和酯。到目前為止已報(bào)道的此類抗生素有40多個(gè)，結(jié)構(gòu)簡單的有15個(gè)，其中strobilurin類的有16個(gè)、oudemansin系列4個(gè)、cymenin系列3個(gè)、myxothiazole系列17個(gè)[48]?；诰哂袣⒕钚缘奶烊沪?甲氧基丙烯酸酯衍生物研發(fā)出了一系列天然抗生素，結(jié)構(gòu)中含有甲氧基和丙烯酸酯或酰胺的基團(tuán)，其他基團(tuán)在β位取代，具有廣譜、高效、安全的特點(diǎn)[62]。

Strobilurin A是strobilurin天然抗生素家族中最早被確定的，也是種類最多的一類，按照結(jié)構(gòu)特點(diǎn)一般劃分為兩類：一是苯基取代三烯類，包括strobilurin A-C，H、strobilurin F-1、strobilurin F-2、9-methoxystrobilurin A和hydroxystrobilurin A 8個(gè)化合物(圖4A)；二是苯并二氧雜環(huán)取代三烯類，包括strobilurin E、9-methoxystrobilurin E、strobilurin M、strobilurin D (G)、strobilurin O、strobilurin P、hydroxytrobilurin (G)和9-methoxystrobilurin K 8個(gè)化合物(圖4B)[62～66]。

3 活性物質(zhì)抗植物病原真菌的作用機(jī)制

3.1 肽類抗植物病原真菌機(jī)制

真菌具有細(xì)胞壁這一特殊結(jié)構(gòu)，其主要組分為幾丁質(zhì)、葡聚糖和甘露聚糖等。抗真菌肽對真菌的作用機(jī)理有如下幾種：①對真菌細(xì)胞膜作用，抗真菌肽與膜作用，破壞脂膜使細(xì)胞質(zhì)發(fā)生泄漏。且抗真菌肽增加細(xì)胞膜的電導(dǎo)率和通透性，影響細(xì)胞膜的表面張力，抑制病原菌孢子的形成,如magainins、cecropins和dermaseptins等[67]。Iturin是一類生物表面活性劑，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，iturin家族脂肽都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗真菌活性。Iturin的抗真菌活性主要源自于膜通透效應(yīng)，但它不會破壞細(xì)胞膜，卻可以干擾細(xì)胞膜上的離子通道。Surfactins是比iturins更強(qiáng)的生物表面活性劑，由于具有兩親型結(jié)構(gòu)，surfactin類脂肽可以緊密錨定于脂膜中，破壞細(xì)胞膜的完整性；②對真菌細(xì)胞壁的作用，抗真菌肽通過抑制細(xì)胞壁的重要組分葡聚糖和幾丁質(zhì)的合成，破壞病原菌細(xì)胞壁的合成，從而達(dá)到殺菌的作用，抑制病原物的侵入和擴(kuò)展，調(diào)節(jié)提高植物防御能力，如nikkomycin Z、echinocandins[67]；③抗真菌肽對真菌內(nèi)細(xì)胞器(如線粒體)的作用，如buforins、Ib-AMP1和histatins[68～72]。

Fengycins類脂肽有很強(qiáng)的抗絲狀真菌活性，但這類脂肽的抑菌機(jī)理尚不明確，其作用機(jī)理也可能與改變脂膜結(jié)構(gòu)和通透性有關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)其家族成員寧康霉素可阻遏真菌代謝系統(tǒng)，導(dǎo)致菌絲生長緩慢[13]。

圖4 化合物strobilurin結(jié)構(gòu)式[62]Fig.4 The structures of strobilurin[62].A.苯基取代三烯類；B.苯并二氧雜環(huán)取代三烯類。

3.2 抗菌蛋白與酶類抑菌機(jī)理

生防菌可以通過產(chǎn)生生物活性物質(zhì)抵抗植物病原真菌，其中抗菌蛋白作為主要的抗菌成分已受到到國內(nèi)外專家的關(guān)注。關(guān)于抗菌蛋白的作用機(jī)理，到目前為止主要涉及兩方面：一是造成細(xì)胞畸變，出現(xiàn)小泡、腫脹，然后裂解；二是破壞細(xì)胞壁，菌絲原生質(zhì)從細(xì)胞壁溶解處泄漏，菌絲體斷裂成段，繼而消融，但因抗菌蛋白結(jié)構(gòu)不同其作用機(jī)理可能也不一樣，也有許多學(xué)者對抗菌蛋白的作用機(jī)制提出了不同觀點(diǎn)[45]。

海洋天然產(chǎn)物幾丁質(zhì)酶對真菌新生細(xì)胞如芽管和菌絲頂端細(xì)胞壁具有破壞作用。絲狀真菌延伸菌絲的過程中生長頂端會不斷新合成幾丁質(zhì)、葡聚糖或其他多糖，菌絲頂端暴露的幾丁質(zhì)鏈會被幾丁質(zhì)酶所水解，進(jìn)而使頂端細(xì)胞壁變薄，形成球狀突起，最后降解細(xì)胞壁，原生質(zhì)體破裂，進(jìn)而使真菌孢子萌發(fā)、芽管伸長和菌絲生長受抑制，芽管和附著胞解體。幾丁質(zhì)酶解的產(chǎn)物是幾丁寡糖，具有抗菌、抑菌性能，可以直接殺死病原真菌，還可以作為植物功能調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)植物生長發(fā)育[73]。在植物的細(xì)胞次生壁與中膠層中有蛋白質(zhì)存在，可被蛋白酶降解。細(xì)胞壁降解酶如幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和纖維素酶等均能引起真菌細(xì)胞壁通透性變化抵抗植物病原真菌。

3.3 酯類殺菌機(jī)制

以天然產(chǎn)物Strobilurin A作為先導(dǎo)化合物開發(fā)的新型殺菌劑——甲 氧 基 丙 烯 酸 酯 類 殺 菌 劑，是線粒體呼吸抑制劑。它的作用機(jī)理是在植物病原真菌線粒體合成能量的過程中鍵合在位于真菌線粒體內(nèi)膜的細(xì)胞色素b(Cytb,細(xì)胞色素bc1復(fù)合物的一部分)的還原型輔酶Q的氧化位點(diǎn)(Qo位點(diǎn)) ，阻止細(xì)胞色素b和c1之間的電子傳遞，抑制線粒體的呼吸作用，破壞三磷酸腺苷(ATP) 的產(chǎn)生，從而阻斷了菌體內(nèi)部的能量循環(huán)[74,75]。

4 深海細(xì)菌防控產(chǎn)毒植物病原真菌的研究現(xiàn)狀

深海環(huán)境存在著豐富的微生物資源，具有巨大的研究空間與開發(fā)潛力[4,76]，目前國內(nèi)外研究主要集中在利用深海細(xì)菌對非產(chǎn)毒真菌的生物防治，對產(chǎn)毒真菌的生物防治研究開展的很少，而產(chǎn)毒真菌的危害比非產(chǎn)毒真菌更加嚴(yán)重，不僅影響作物生長，降低產(chǎn)量，更重要的是產(chǎn)生能嚴(yán)重危害人類和動物健康的真菌毒素，如黃曲霉毒素、鐮刀菌毒素和赭曲毒素等，具有強(qiáng)毒性、致癌性、致畸性及免疫抑制性，因此，產(chǎn)毒真菌的防治是一個(gè)亟待解決的重大課題。本文作者已開展了大西洋深海細(xì)菌抗黃曲霉毒素和鐮刀菌毒素產(chǎn)生的研究[77,78]，篩選出一些菌株，其發(fā)酵無細(xì)胞上清液對黃曲霉毒素產(chǎn)生菌和鐮刀菌毒素產(chǎn)生菌的孢子萌發(fā)和真菌毒素產(chǎn)生的抑制率達(dá)100%，有些菌株的15倍稀釋液仍能完全抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，這些高效菌株的獲得為有效防控產(chǎn)毒真菌提供了新的可能。

5 展望

化學(xué)合成農(nóng)藥的使用遍及世界，過多的使用會使植物病原真菌產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)，還會帶來大量農(nóng)藥殘留，污染環(huán)境，危害人類健康。利用次生代謝物防治不僅可更好的防控耐藥性作物病害，還有利于環(huán)境保護(hù)。并且，海洋微生物來源的天然產(chǎn)物新穎結(jié)構(gòu)、具有較強(qiáng)的活性和多種作用機(jī)制，是開發(fā)抗植物真菌病生物農(nóng)藥的重要資源，也是植物真菌病害防治的發(fā)展方向之一。盡管目前海洋微生物在植物病害防治中主要研究利用的是近海、淺海及海岸帶等來源的微生物，但隨著人們對深海微生物研究的不斷深入，越來越多的能高效抑制植物病原真菌特別是產(chǎn)毒真菌的深海微生物將會被篩選出來，并在生物防治領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。

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Progress of Deep-sea Bacteria and its Bioactive Compounds on Prevention of Plant Pathogenic Fungi

SUN Xiao-lei,YAN Pei-sheng*,WANG Kai,WANG Wen-wei,LI Meng-ying

SchoolofMarineScienceandTechnology,HarbinInstituteofTechnologyatWeihai,ShandongWeihai264209,China

In recent years，the development of biopesticides from natural products has been concerned by scholars.For the unique living environment，marine microorganisms producing many novel bioactive compounds that never been found in the terrestrial microorganisms，which provide bright prospects for developing novel biopesticides.The research progress of deep-sea bacteria against phytopathogenic fungi was briefly summarized from three aspects of species diversity，kinds and structures of antifungal substances and antifungal mechanisms.Developing biological pesticide from marine microorganisms was prospected in this paper.This review might provide some insight for development and utilization of marine microorganisms in anti-phytopathogenic fungi.

deep-sea bacteria; phytopathogenic fungi; mycotoxin-producing fungi; antifungal mechanisms

2015-04-22; 接受日期：2015-05-12

國際海域資源調(diào)查與開發(fā)“十二五”重大項(xiàng)目(DY125-15-R-01)；哈爾濱工業(yè)大學(xué)優(yōu)秀團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃資助。

孫曉磊，碩士研究生，主要從事海洋微生物研究。E-mail：sunrabbit@yeah.net。*通信作者：閆培生，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸镔Y源與利用、海洋生物質(zhì)及其加工廢物的高值資源化、有害微生物的生物防治與生物農(nóng)藥、微生物發(fā)酵工程與生物制藥等。E-mail：yps6@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.03.05