早期宮頸癌患者外周血中HtrA1和HMGB1基因的表達(dá)及其臨床意義

趙雪春

早期宮頸癌患者外周血中HtrA1和HMGB1基因的表達(dá)及其臨床意義

趙雪春

目的探討早期宮頸癌患者外周血中HtrA1、HMGB1基因的mRNA和蛋白水平的表達(dá)及其臨床意義。方法選擇2007年7月至2013年6月期間，廣西壯族自治區(qū)腦科醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的早期宮頸癌患者的住院病例60例為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)以30例子宮肌瘤患者和30例健康志愿者為陰性對(duì)照組，30例晚期(ⅡB～ⅢB)宮頸癌患者為陽性對(duì)照組。采集患者的外周血并分離出白細(xì)胞，通過實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組織化學(xué)檢測(cè)外周血、病灶組織及淋巴轉(zhuǎn)移灶組織中HtrA1和HMGB1在mRNA和蛋白表達(dá)水平的表達(dá)，分析其與臨床病理參數(shù)、預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組患者外周血HTRA1和HMGB1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組HtrA1和HMGB1 mRNA 表達(dá)水平高于陰性對(duì)照組，疾病組中發(fā)生宮頸癌轉(zhuǎn)移的淋巴組織HtrA1和HMGB1表達(dá)水平高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的淋巴組織，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。病理結(jié)果同樣顯示發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者淋巴組織中HtrA1和HMGB1的表達(dá)量高。結(jié)論宮頸癌根治術(shù)前外周血HTRA1和HMGB1 mRNA表達(dá)水平可作為診斷早期宮頸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物，可能作為預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、判斷預(yù)后的輔助指標(biāo)。

宮頸癌；淋巴轉(zhuǎn)移；HtrA1；HMGB1

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1602～1605)

全世界的宮頸癌患者的病例達(dá)到1百萬以上，作為世界第三大惡性腫瘤和第四大致死率腫瘤，對(duì)其相關(guān)機(jī)制的研究日益緊迫[1]。在美國等西方發(fā)達(dá)國家，盡管各種檢查設(shè)備和醫(yī)療技術(shù)水平的提高，包括各種手術(shù)和化療水平的提高，宮頸癌仍然是這些國家的第二婦科致死率腫瘤，每年大量的患者因此死亡[2]。雖然這方面的報(bào)道越來越多,但是誘導(dǎo)癌癥產(chǎn)生的機(jī)制尚未揭示,因此這項(xiàng)研究對(duì)于揭示癌癥與炎癥的關(guān)系至關(guān)重要。最近的研究工作顯示,免疫相關(guān)的細(xì)胞、細(xì)胞因子以及其它免疫相關(guān)的調(diào)節(jié)因子實(shí)際上在宮頸癌發(fā)生的每一個(gè)過程中都起著重要的作用,涉及癌癥的啟動(dòng)、發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移等各個(gè)階段[3-4]。本文就HtrA1和HMGB1和腫瘤的關(guān)系來討論相應(yīng)的癌癥發(fā)生，尤其是宮頸癌發(fā)生的相關(guān)性問題。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2007年7月至2013年6月期間，廣西腦科醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的術(shù)后病理確診為早期宮頸癌的60例住院患者，年齡32～76歲，平均(45.5±9.6)歲，收集完整病史，對(duì)其臨床病理資料進(jìn)行分析。記錄患者的癥狀及持續(xù)時(shí)間。所有患者術(shù)前均接受婦科檢查，常規(guī)血液檢查以及彩色多普勒超聲檢查，以搏動(dòng)指數(shù)(PI)≤1，阻力指數(shù)(RI)≤0.55作為超聲提示腫瘤血供豐富的指標(biāo)[1]。完善相關(guān)檢查后，所有患者均接受手術(shù)治療。術(shù)中標(biāo)本送病理科室進(jìn)行檢查，根據(jù)病理檢驗(yàn)結(jié)果以及向家屬告知病情后部分病例調(diào)整手術(shù)方案。術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋病理切片檢查明確診斷。術(shù)后定期隨訪，如有復(fù)發(fā)，記錄復(fù)發(fā)時(shí)間以及再次手術(shù)的時(shí)間和手術(shù)方案。同時(shí)以30例子宮肌瘤患者和30例健康志愿者為陰性對(duì)照組，年齡25～78歲，平均(42.7±10.3)歲；30例晚期(ⅡB～ⅢB)宮頸癌患者為陽性對(duì)照組，年齡33～77歲，平均(46.9±8.8)歲。

1.2 血液總RNA 提取

收集新鮮的外周血，分離出白細(xì)胞，用Trizol提取的患者和對(duì)照組的血液總RNA，質(zhì)檢電泳測(cè)序合格后，保存于-20 ℃冰箱備用，可以用于下一步的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

1.3 Real-time PCR

提取淋巴外周血白細(xì)胞中的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA,進(jìn)行 Reltime PCR 反應(yīng),使用SsoFastTMEvaGreen?Supermix 檢測(cè)。 反應(yīng)體系為：SsoFastTMEvaGreen?Supermix 10 μl；上游引物(10 μM) 1 μl；下游引物(10 μM) 1 μl；cDNA 1 μl；3dH2O 7 μl共20 μl。反應(yīng)條件：(1)95 ℃ 1 min；(2)95 ℃ 5 s；(3)58 ℃ 5 s +讀板；(4)回到第二步，39個(gè)循環(huán)；(5)溶解曲線：65 ℃到95 ℃,每0.2 ℃，讀板。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行孔。CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，△△Ct 法檢測(cè)各組樣品中目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 石蠟組織切片的HE染色

病理科取材并制備宮頸癌病灶組織石蠟包埋塊，包埋后的組織經(jīng)過4 μm 切片，制備相應(yīng)的石蠟切片用于后續(xù)染色實(shí)驗(yàn)。石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟，然后經(jīng)各級(jí)乙醇脫水至水洗。用配制好的蘇木精染色5 min，染色完畢后，自來水沖洗干凈。置配置好的伊紅液中染色2 min。經(jīng)過常規(guī)脫水，透明，封片后于顯微鏡下鏡檢并獲取不同的視野拍照，記錄病理染色結(jié)果。

1.5 免疫組織化學(xué)法

組織經(jīng)10%中性甲醛固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋、切片。切片常規(guī)脫蠟水化，0.3%過氧化氫處理10 min，檸檬酸鹽緩沖液加熱修復(fù)抗原，正常羊血清封閉，分別滴加抗HTRA1和HMGB1抗體，4 ℃孵育過夜。PBS 洗3遍，加生物素化二抗，37 ℃，30 min；清洗后，加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白素工作液， 37 ℃，30 min；DAB顯色；自來水中淋洗；蘇木精浸泡10 min；自來水淋洗；鹽酸酒精分化；自來水淋洗；熱水中浸泡，染化；梯度酒精脫水；晾干，中性樹脂封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 早期宮頸癌患者根治術(shù)前外周血HTRA1和HMGB1 mRNA表達(dá)水平

與早期宮頸癌實(shí)驗(yàn)組相比，良性肌瘤患者與正常對(duì)照組外周血HTRA1和HMGB1 mRNA明顯表達(dá)減少(P<0.05)，而晚期宮頸癌陽性對(duì)照組患者外周血HTRA1和HMGB1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，說明HTRA1和HMGB1在宮頸癌早期的發(fā)生和晚期的發(fā)展過程中都扮演了極其重要的作用，見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組外周血HTRA1和HMGB1 mRNA表達(dá)水平

注：*為與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.01；△為與陰性組比較，P<0.01。

2.2 HtrA1和HMGB1在宮頸癌病灶組織中的mRNA水平

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組宮頸癌病灶組織中HTRA1和HMGB1的mRNA 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)結(jié)果與免疫組化結(jié)果相一致,實(shí)驗(yàn)組中病灶組織HTRA1和HMGB1表達(dá)高于陰性對(duì)照組,具有顯著差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組中發(fā)生宮頸癌轉(zhuǎn)移的淋巴組織中HTRA1和HMGB1表達(dá)也高于未發(fā)生宮頸癌轉(zhuǎn)移的淋巴組織中(P<0.05)。見圖1。

a：實(shí)驗(yàn)組；b：陰性對(duì)照組；c：陽性對(duì)照組。

2.3 HTRA1和HMGB1在淋巴組織中的表達(dá)

利用免疫組化的方法比較陰性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組淋巴組織中HTRA1和HMGB1的表達(dá)，圖2顯示，晚期宮頸癌患者的淋巴組織的HTRA1和HMGB1的表達(dá)均高于良性肌瘤患者對(duì)照組。早期60例宮頸癌患者中，30例宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移灶患者的HTRA1和HMGB1的表達(dá)均高于未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移灶宮頸癌患者。這些結(jié)果顯示，HTRA1和HMGB1的高表達(dá)可能與宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移的過程相關(guān)。

a：實(shí)驗(yàn)組；b：陰性對(duì)照組；c：陽性對(duì)照組。

2.4 宮頸癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病理檢查

發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的30例宮頸癌患者經(jīng)影像學(xué)、解剖及病理檢查證實(shí)淋巴成瘤,另有30例宮頸癌患者只至觀察期終止時(shí)未發(fā)現(xiàn)淋巴成瘤。陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)中，無宮頸癌的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)組中，對(duì)取出的患者淋巴進(jìn)行的HE染色結(jié)果顯示，證實(shí)發(fā)生宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及破壞淋巴的能力。

2.5 HTRA1和HMGB1在宮頸癌轉(zhuǎn)移淋巴組織中的表達(dá)

利用免疫組化的方法比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組淋巴組織的HTRA1和HMGB1的表達(dá)量，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中發(fā)生轉(zhuǎn)移的淋巴組織中，HTRA1和HMGB1的表達(dá)明顯低于對(duì)照組患者淋巴組織；并且實(shí)驗(yàn)組中未發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的淋巴組織中的HTRA1和HMGB1的表達(dá)也明顯低于轉(zhuǎn)移的患者的淋巴組織。

3 討論

關(guān)鍵調(diào)控蛋白與腫瘤的關(guān)系，除了提及的蛋白外，還包括趨化因子(chemokines),環(huán)氧化酶(COX-2),NF-kB2,低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1alpha) 和 STATs 等一系列蛋白因子。因此這些蛋白的表達(dá)和腫瘤的發(fā)生存在密切的相關(guān)性，并在這個(gè)相關(guān)的過程中伴隨著一系列的蛋白因子和相關(guān)通路。對(duì)這些相關(guān)蛋白因子和通路的分析有助于我們加深對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白的認(rèn)識(shí)，也有助于我們從分子水平和角度來認(rèn)識(shí)和治療炎癥相關(guān)的癌癥[5]。宮頸癌是一種最嚴(yán)重的婦科疾病，HTRA1和HMGB1在這過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，并且越來越多的證據(jù)顯示HTRA1和HMGB1可以作為一種主要的調(diào)節(jié)子在宮頸癌的發(fā)生中扮演著極其重要的作用[6]。雖然目前對(duì)宮頸癌的認(rèn)識(shí)有一定的進(jìn)步，但是它仍然是高致死性的癌癥，說明其中還有待我們進(jìn)一步的研究和認(rèn)識(shí)，腫瘤細(xì)胞假說，可能有助于我們對(duì)宮頸癌發(fā)生的相關(guān)認(rèn)識(shí)，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)證明，宮頸癌的某些分型細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生過程中扮演著重要的作用[7]。

侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特性之一，是惡性腫瘤難以治愈的關(guān)鍵因素。許多證據(jù)顯示HSP與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移方面密切相關(guān)，如Jaattela等的研究HSP27的過表達(dá)會(huì)在一些生物中提高同源細(xì)胞的致癌潛能，也會(huì)提高哺乳動(dòng)物腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[8]；Rousseau等發(fā)現(xiàn)HTRA1和HMGB1被抑制后可以抑制腫瘤細(xì)胞生成和移動(dòng)[9]；Rutherford等的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)HTRA1和HMGB1功能被抑制后可以抑制E的甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[10]。本實(shí)驗(yàn)中， 宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移模型組中，免疫組化和Real-time PCR 結(jié)果均顯示發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的淋巴組織中HTRA1和HMGB1的表達(dá)量均高于正常淋巴組織(Fig2)， 提示，HTRA1和HMGB1可能與患者宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。進(jìn)一步，利用HTRA1和HMGB1 抑制劑17-AAG進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)，17-AAG在抑制HTRA1和HMGB1表達(dá)量的同時(shí)，明顯抑制了宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移能力，并且HE染色顯示17-AAG降低淋巴組織被破壞的程度， 因此，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了HTRA1和HMGB1 在宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移過程中的作用，表明HTRA1和HMGB1表達(dá)水平的升高與癌癥轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。

HTRA1也是一個(gè)研究相當(dāng)多的細(xì)胞因子，它在各種腫瘤中都具有比較高的表達(dá)，包括在宮頸癌中具有高表達(dá)，說明HTRA1在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中具有促進(jìn)作用，但是具體的作用機(jī)制并不清楚，但是HTRA1在Th17細(xì)胞的分化和增殖中具有重要作用[11-12]。而Th17能夠生同屬HTRA1家族的蛋白，具有抑制腫瘤的作用。另外一個(gè)關(guān)鍵作用蛋白HMGB1，在宮頸癌的病理發(fā)生中起著極其重要的作用，通過遷移，調(diào)節(jié)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的平衡，同時(shí)影響宮頸黏膜屏障的完整性[13]。

綜上所說，HTRA1和HMGB1在腫瘤的發(fā)生過程中均具有一定的功能。這些蛋白在腫瘤細(xì)胞的生長、增殖中發(fā)揮著重要作用，甚至決定性作用。因此，我們推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中HTRA1和HMGB1可能是通過下游受體蛋白參與到宮頸癌細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移過程中，但具體的分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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(編輯：甘 艷)

Expression of HtrA1 and HMGB1 mRNA in Peripheral Blood of Early Cervical Cancer and its Clinical Significance

ZHAOXuechun.

Objective To investigate the expression of HtrA1 and HMGB1 mRNA in peripheral blood of early cervical cancer and Its clinical significance.Methods 60 cases of early(ⅠA2～ⅡA) cervical cancer patients were the experimental group，30 patients with uterine myoma and 30 healthy volunteers were the negative control group，30 cases of advanced(ⅡB～ⅢB) cervical cancer patients were the positive control group.Peripheral blood samples before radical resection in the experimental group，and the same samples before treatment of the control groups were collected.The change of expression level and positive rate of HTRA1 and HMGB1 in peripheral blood were analyzed using qRT-PCR technique，and its correlation with clinicopathological parameters and prognosis was further analyzed.Results Compared with the negative control group,the expression level of HTRA1 and HMGB1 mRNA in the peripheral blood of the experimental group and the positive control group were significantly higher than those of the negative control group (P<0.05).Real time quantitative PCR assay showed that the expression level of HtrA1 and HMGB1 mRNA in the experimental group was significantly higher than that of the negative control group,and the expression level of HtrA1 and HMGB1 mRNA in cervical cancer lymph nodes metastasis was significantly higher than that of the non metastatic lymph nodes (P<0.05).The pathological results showed that the expression of HtrA1and HMGB1 mRNA in patients with lymph node metastasis was higher.Conclusion Expression of HtrA1 and HMGB1 mRNA in peripheral blood before radical hysterectomy can be tumor markers in the diagnosis of early cervical cancer,and can be adjuvant indicators in predicting relapse,metastasis and prognosis.

Cervical cancer；Lymph metastasis；HtrA1；HMGB

545005 廣西壯族自治區(qū)腦科醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2015.11.006

R737.33

A

1001-5930(2015)11-1602-04

2015-07-20

2015-10-09)

TheGuangxiZhuangAutonomousRegionBrainHospital,Liuzhou,545005