HPLC法測定藏藥仁青芒覺膠囊中西紅花苷－I和西紅花苷－Ⅱ的含量

楊博涵朱旭江

1.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020；2.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730070

HPLC法測定藏藥仁青芒覺膠囊中西紅花苷－I和西紅花苷－Ⅱ的含量

楊博涵1朱旭江2*

1.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020；2.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730070

目的：建立仁青芒覺膠囊中西紅花的含量測定方法。方法：采用HPLC法，用光電二極管陣列檢測器 （DAD），流動相為甲醇－水（50∶50），流速1.0 ml／min，檢測波長440nm，柱溫25℃，對西紅花苷－Ⅰ、西紅花苷－Ⅱ進(jìn)行定量測定。結(jié)果：西紅花苷－Ⅰ在0.0336～0.4987μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r＝0.9999，加樣回收率為97.43%，RSD＝2.18%；西紅花苷－Ⅱ在0.0129～0.1818μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r＝0.9998，加樣回收率為99.75%，RSD＝1.53%結(jié)論：該方法操作簡便、專屬性、重現(xiàn)性好，可有效地控制仁青芒覺膠囊的質(zhì)量。

仁青芒覺膠囊；HPLC；西紅花苷－Ⅰ；西紅花苷－Ⅱ

仁青芒覺始載于 《盤德瓊乃》，是藏族驗(yàn)方。仁青芒覺膠囊由毛訶子、蒲桃、西紅花、木香、丁香、朱砂、馬錢子等藥材組成的復(fù)方制劑，具有清熱解毒，益肝養(yǎng)胃，明目醒神，愈瘡，滋補(bǔ)強(qiáng)身的功效。其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（YBZ07062005－2010Z），含量測定項(xiàng)為檢查沒食子酸的含量，但處方中多味藥材含有沒食子酸，故該法的專屬性不強(qiáng)。仁青芒覺膠囊處方組成比較復(fù)雜，含量測定存在一定難度，導(dǎo)致該藥含量測定研究報(bào)道較少［1－3］。處方中的西紅花為鳶尾科植物番紅花 （Crocus sativus L.）的干燥柱頭，系貴重藥材，具有活血化瘀，清熱解毒，解郁安神的作用，且仁青芒覺膠囊為保密處方，處方量不明確。為了保證用藥的有效性，試驗(yàn)采用高效液相色譜法建立了仁青芒覺膠囊中西紅花苷－I和西紅花苷－Ⅱ的含量測定方法，該法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量的控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀（Waters 2998 DAD檢測器，Empower色譜工作站，美國Waters公司）；Mettler AE 240電子天平（瑞士梅特勒）；Sartorius R200D電子天平（德國賽多利斯公司）；KH－500DE超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；HGC－24A氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試藥 西紅花苷－I（批號：111588－200501）和西紅花苷－Ⅱ（批號：110589－201304，含量92.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；仁青芒覺膠囊 （批號：100501、120001、130101）由甘肅省某藏藥企業(yè)提供。甲醇 （色譜純，德國默克Merck公司）；水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250mm，5μm），Waters Symmetry C18（4.6mm× 250mm，5μm），Thermo scientific BDS HYPERSIL C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇－水（50：50）；流速：1ml／min；柱溫：25℃；檢測波長：440nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取西紅花苷－Ⅰ對照品8.28mg，至50ml棕色量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，作為西紅花苷－Ⅰ對照品儲備液。精密稱取西紅花苷－Ⅱ?qū)φ掌?.20mg，至50ml棕色量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，作為西紅花苷－Ⅱ?qū)φ掌穬湟?。分別精密吸取西紅花苷－Ⅰ對照品儲備液5ml和西紅花苷－Ⅱ?qū)φ掌穬湟?ml至50ml容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，制成混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置50ml棕色量瓶中，加稀乙醇適量，置冰浴中超聲處理 （功率200 W，頻率60KHz）30min，放至室溫，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性供試品的制備 按照供試品溶液的制備方法，分別制備缺西紅花的陰性供試品溶液。

2.2.4 樣品的測定 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液各5～10μl，注入液相色譜儀，測得液相色譜圖，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，西紅花苷－Ⅰ、西紅花苷－Ⅱ色譜分離良好，且陰性對測定結(jié)果無干擾。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系的考察 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件，分別進(jìn)樣2、4、8、10、14、18、22、26、30μl，測定西紅花苷－Ⅰ、西紅花苷－Ⅱ的峰面積，以進(jìn)樣對照品質(zhì)量 （μg）為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，西紅花苷－Ⅰ和西紅花苷－Ⅱ在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 高效液相色譜圖

表1 西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的線性回歸方程

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值，西紅花苷－Ⅰ和西紅花苷－Ⅱ的RSD分別為0.5%和0.4%，結(jié)果表明進(jìn)樣精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號：130001）分別在0、2、4、6、8、24 h，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件各進(jìn)樣1次，記錄峰面積積分值，西紅花苷－Ⅰ和西紅花苷－Ⅱ的RSD分別為1.4和1.3%，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品（批號：130001）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，“2.1”項(xiàng)的色譜條件測定含量。結(jié)果西紅花苷－Ⅰ和西紅花苷－Ⅱ的RSD分別為0.98%和1.02%。

2.3.5 加樣回收率 精密量取西紅花苷－Ⅰ對照品儲備液（0.1656mg／ml）1.5、2.0、2.5ml各3份和西紅花苷－Ⅱ?qū)φ掌穬湟海?.06061mg／ml）0.8、1.0、1.2ml各3份，置50ml棕色量瓶中，溶劑采用氮吹儀吹干，再分別精密稱取已知含量同一批號（批號：130001，西紅花苷－Ⅰ含量1.2605 mg／g；西紅花苷－Ⅱ含量0.4376 mg／g）的供試品9份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，計(jì)算西紅花苷－Ⅰ和西紅花苷－Ⅱ的回收率。結(jié)果見表2、表3。

表2 西紅花苷－Ⅰ加樣回收率

表3 西紅花苷－Ⅱ加樣回收率

2.4 樣品測定結(jié)果 按供試品溶液的制備方法和測定方法，對樣品進(jìn)行制備和測定，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中西紅花苷－Ⅰ和西紅花苷－Ⅱ含量，測定3批供試品的含量，結(jié)果見表4。

表4 仁青芒覺膠囊含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 提取方法的選擇 參考中國藥典［4］及有關(guān)文獻(xiàn)［5－6］，提取溶劑選定為稀乙醇。西紅花苷文獻(xiàn)報(bào)道較多［7－8］，大多采用超聲提取方法。西紅花苷為水溶性類胡蘿卜素類成分，分子中具有多個共軛雙鍵，導(dǎo)致其穩(wěn)定性差，且對溫度非常敏感［9］。研究對供試品在冰浴中和常溫下超聲處理方法進(jìn)行了對比研究。結(jié)果表明，冰浴比常溫提取所測得的西紅花苷－Ⅰ和西紅花苷－Ⅱ峰面積略高，故采用冰浴超聲提取作為仁青芒覺膠囊中西紅花苷－Ⅰ和西紅花苷－Ⅱ的提取方法。

3.2 超聲時間的選擇 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，供試品制備采用冰浴中分別超聲（功率200 W，頻率60 KHz）20、25、30、40、50 min，依法測定峰面積，結(jié)果表明，超聲提取30 min時的測定值略高，故選擇提取時間為30 min。

3.3 測定波長的選擇 對西紅花苷－Ⅰ和西紅花苷－Ⅱ進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果在440 nm波長處有最大吸收，故選擇440nm作為測定波長。

3.4 方法適用性試驗(yàn) 取同一批樣品按供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備，分別采用三種品牌的色譜柱測定，西紅花苷－Ⅰ和西紅花苷－Ⅱ測得含量的RSD分別為1.92%和1.56%，結(jié)果無明顯差別，說明該方法適用性較好。

3.5 小結(jié) 樣品各批次間西紅花苷－Ⅰ和西紅花苷－Ⅱ的含量差異較大，說明現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能控制產(chǎn)品質(zhì)量，使各批樣品的投料量存在差異。實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時測定仁青芒覺膠囊中西紅花苷－Ⅰ和西紅花苷－Ⅱ的含量，此法方便可靠、重現(xiàn)性好，為仁青芒覺膠囊的質(zhì)量控制與評價(jià)提供了參考資料。

［1］田薇，陳朝暉.薄層色譜法檢查仁青芒覺膠囊中烏頭堿、士的寧的限量［C］.甘肅省化學(xué)會成立六十周年學(xué)術(shù)報(bào)告會暨二十三屆年會論文集，2003，419.

［2］馬寧，朱旭江，楊錫，等.仁青芒覺膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 ［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（6）：72－75.

［3］房少新，趙利平.藏藥仁青芒覺中微量元素的測定 ［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2013，30（2）：916－919.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 （一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［5］周素娣，仲惠娟.HPLC測定西紅花提取物及其片劑中各西紅花苷含量［J］.藥物分析雜志，1998，18（3）：159－162.

［6］李彬，周素娣，周錦祥.中藥西紅花指紋圖譜研究 ［J］.海峽藥學(xué)，2005，17（3）：83－85.

［7］尼珍，阿萍，格桑索朗.HPLC法測定藏藥二十五味珍珠丸中西紅花苷Ⅰ的含量［J］.藥物分析雜志，2011，31（1）：151－153.

［8］繆玉山，黃根林，倪沖，等.反相高效液相色譜法對不同來源西紅花藥材中西紅花苷－1、苷－2的定量分析［J］.中國藥學(xué)雜志，2002，22（11）：654－656.

［9］付小梅，王崢濤.西紅花苷－Ⅰ的穩(wěn)定性研究［J］.食品科學(xué)，2012，33（5）：71－73.：

HPLC determ ination of crocin－Ⅰand crocin－Ⅱin Renqing M angjue capsules

YANG Bohan1ZHU Xujiang*
1.Tianjin Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences，Tianjin 300020，China；2.Gansu Institute for Drug Control，Lanzhou 730070，China

Objective To set up the quality standard of Renqing Mangjue capsules.M ethods The content of crocin－Ⅰand crocin－Ⅱwere determined by HPLC，which conducted with a DAD detector and the detection wavelength set at440nm.The column was C18（4.6mm×250mm，5μm）withmobile phase consisted ofmethanol－water（50：55）and the flow rate was 1.0 ml·min－1. The column temperaturemaintained at 25℃.Results HPLC determined that crocin－Ⅰwas in range from 0.0336 to 0.4987μg，which presented a good linear relationship（r＝0.9999）.The average recovery was 97.43%，RSD was 2.18%.HPLC determined that crocin－Ⅱwas in range from 0.0129 to 0.1818μg，which presented a good linear relationship（r＝0.9998）.The average recovery was 99.75%，RSD was1.53%.Conclusion Themethod is simple in operation.The results are accurate，reliable and good in reproducibility.Themethod can effectively control the quality of Renqing Mangjue capsules.

Renqing Mangjue capsules；HPLC；crocin－Ⅰ；crocin－Ⅱ

R284.1

A

1007－8517（2015）20－0016－03

2015.07.10）

楊博涵，女，學(xué)士。E－mail：1132563453＠qq.com

朱旭江，博士，主任藥師。主要從事藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、色譜學(xué)及相關(guān)技術(shù)。E－mail：gszhuxujiang＠163.com