Box－Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化玄參的提取工藝

孫莉君馬 婧楊 靜胡海濤王 越

1.大慶市人民醫(yī)院，黑龍江 大慶 163316；2.大慶市食品藥品檢測(cè)中心，黑龍江 大慶 163316

Box－Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化玄參的提取工藝

孫莉君1馬 婧1楊 靜1胡海濤2王 越1

1.大慶市人民醫(yī)院，黑龍江 大慶 163316；2.大慶市食品藥品檢測(cè)中心，黑龍江 大慶 163316

目的：應(yīng)用Box－Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化玄參的提取工藝。方法：以乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶媒比、提取時(shí)間為自變量，以總評(píng)“歸一值”（包括安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷的含量及浸膏率）作為因變量，對(duì)自變量的各個(gè)水平采用二項(xiàng)式擬合，用Box－Behnken效應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：玄參的最優(yōu)提取工藝為：提取時(shí)間75min，溶媒比為8倍，82%的乙醇，提取2次。二項(xiàng)式擬合復(fù)相關(guān)系數(shù)高（r＝0.9777），回歸模型的預(yù)測(cè)值與測(cè)定值的偏差率為－2.51%。結(jié)論：Box－Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選的玄參提取工藝，合理可行，操作簡(jiǎn)便。

玄參；提取工藝；Box－Behnken效應(yīng)面法

玄參（Radix Scrophulariae）為玄參科（Scrophulariaceae）玄參屬植物玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的干燥根［1］。玄參味甘、苦、咸，性微寒，具有清熱涼血，瀉火解毒，滋陰的功效。臨床主要用于溫邪入營(yíng)，內(nèi)陷心包，溫毒發(fā)斑，熱病傷陰、舌絳煩渴等癥。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，玄參根中含生物堿、糖類、氨基酸、甾醇、脂肪酸等成分［2］，具有保肝［3］、降血壓、保護(hù)心臟［4］、抗菌［5］、降血糖［6］等多種藥理活性。為了合理利用玄參的藥用資源，實(shí)驗(yàn)以玄參中主要藥效成分安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷的含量及浸膏率為考察指標(biāo)，應(yīng)用Box－Behnken響應(yīng)面法對(duì)玄參進(jìn)行工藝優(yōu)化，旨在為玄參的合理應(yīng)用與開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC－20AT型高效液相色譜儀（N2000雙通道色譜工作站，日本島津）；METTLER ME104電子分析天平（上海梅特勒－托利多儀器有限公司）；101A－3B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（武漢亞華電爐有限公司）、PL－S30型超聲波清洗器 （東莞康士潔超聲波科技有限公司）。

1.2 材料 玄參藥材購(gòu)自黑龍江省藥材公司，經(jīng)大慶食品藥品檢驗(yàn)中心鑒定為玄參科植物玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的干燥根。哈巴俄苷對(duì)照品（批號(hào)：111730－201205，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；安格洛苷C對(duì)照品（批號(hào)：061209）、哈巴苷對(duì)照品（批號(hào)：090320）均購(gòu)自上海尚誼化工科技有限公司。乙腈為色譜 （天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司），水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷含量的測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex luna（250mm× 4.6mm，5.0μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）－水（B）梯度洗脫（0～5min，A：5%→30%；5～7min，A：30%→50%；7～ 20min，A：50%→60%；20～25min，A相60%→75%）；檢測(cè)波長(zhǎng)：哈巴俄苷、安格洛苷C為280nm，哈巴苷為210nm；流速：1.0ml／min；進(jìn)樣量：10μl，柱溫：35℃。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷對(duì)照品適量，置于5ml量瓶，用甲醇溶解后稀釋到刻度，搖勻，即制成安格洛苷C 0.62mg／ml，哈巴苷0.46mg／m l，哈巴俄苷0.58mg／ml的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取玄參5g，置于250ml圓底燒瓶，加適量乙醇，回流法提取適當(dāng)時(shí)間，過(guò)濾，殘?jiān)ㄌ崛?，合并濾液后減壓濃縮，甲醇溶解并定容至20m l，搖勻，過(guò)微孔濾膜，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml置10ml量瓶，甲醇定容，搖勻。取10μl按“2.1.1”色譜條件測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程如下：哈巴苷Y＝95384X＋226941（r＝0.9997），在0.023～0.46mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；安格洛苷C Y＝592655X－43685（r＝0.9998），在0.031～0.62mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；哈巴俄苷Y＝536974X＋201232（r＝0.9993），在0.029～0.58mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果哈巴俄苷、哈巴苷、安格洛苷C峰面積的RSD值分別為1.3%、0.98%、1.25%，表明該儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、3、6、12、24h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C峰面積的RSD分別為1.26%、1.05%、0.91%，說(shuō)明該樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一樣品，平行制備得到供試溶液6份，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C含量平均值（n＝6）分別為2.62%、0.285%、0.183%，RSD分別為0.99%、1.2%、1.4%，表明該方法具有良好重復(fù)性。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取9份已知哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C含量的玄參藥材粗粉各5g。分別準(zhǔn)確加入哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C對(duì)照品溶液適量，制備低、中、高三個(gè)質(zhì)量濃度樣品，按上述 “2.1.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件測(cè)定。哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C平均回收率分別為98.27%（RSD為1.3%）、101.5%（RSD為1.7%）、100.8%（RSD為1.6%）。說(shuō)明該方法回收率良好。

2.2 玄參提取工藝的優(yōu)選

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶媒比、提取時(shí)間和提取次數(shù)為考察因素。由于提取次數(shù)屬于非連續(xù)變量，難以回歸分析，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用及文獻(xiàn)［7－9］，將提取次數(shù)定為2次。每個(gè)自變量的低、中、高水平分別以－1，0，1進(jìn)行編碼，因素水平見(jiàn)表1。以玄參中主要有效成分哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C的含量及浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。采用 “歸一化法”［10］和Hassan方法［11］對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，計(jì)算公式如式①：

di＝（Yi-Y min）／（Y max-Y min） ①總評(píng)“歸一值”（overall desirability，OD），計(jì)算公式如式OD＝（d1×d2……dn）1／n ②

表1 Box－Behnken因素設(shè)計(jì)水平

表2 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 模型和方差分析 使用Design－Expert 7.0軟件進(jìn)行二項(xiàng)式擬合，模型如下：

Y＝0.55＋1.25×10－3X1＋0.14X2－0.15X3＋0.045X1X2－0.099X1X3＋0.035X2X3－0.086X12－0.087X22－0.16X32（r＝0.9777）

由表3可知，提取時(shí)間和溶媒比對(duì)結(jié)果的影響非常顯著，X32的偏回歸系數(shù)非常顯著，X12和X22的偏回歸系數(shù)顯著。模型擬合檢驗(yàn)結(jié)果非常顯著能夠說(shuō)明該方程較為符合實(shí)際情況?；貧w方程失擬檢驗(yàn)不顯著，說(shuō)明模型誤差較小，模型可用。

表3 回歸方程的方差分析

2.2.3 工藝條件優(yōu)化與預(yù)測(cè) 根據(jù)二次多項(xiàng)式模型，作響應(yīng)曲面圖，根據(jù)所擬合的響應(yīng)曲面形狀，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、溶媒比對(duì)玄參中各主要成分含量及浸膏得率的影響，響應(yīng)面圖見(jiàn)圖1～3。根據(jù)已建的模型，得最佳條件

圖1 提取時(shí)間，體積分?jǐn)?shù)及其相互作用對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)面

圖3 溶媒比，提取時(shí)間及其相互作用對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)面

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照以上得到的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（n＝3），結(jié)果得到安格洛苷C含量為0.236%（RSD為2.36%）；哈巴苷含量為3.136%（RSD為1.96%）；哈巴俄苷含量為0.362%（RSD為1.82%）；浸膏得率為22.18%（RSD為1.69%）；總評(píng)歸一值為0.622，最大預(yù)測(cè)值為0.638，偏差率為－2.51%，說(shuō)明本模型可靠，具有較好的預(yù)測(cè)性。

3 討論

目前，中藥及復(fù)方的提取工藝多采用正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)，但二者的實(shí)驗(yàn)次數(shù)偏少，存在精度低的缺點(diǎn)［12］。響應(yīng)面法因模型擬合度高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，在中藥及復(fù)方的提取工藝中越來(lái)越受到關(guān)注。實(shí)驗(yàn)采用Box－Behnken效應(yīng)為提取時(shí)間74.66min，溶媒比7.86倍，體積分?jǐn)?shù)為82.11%?？紤]實(shí)際生產(chǎn)情況及操作的可行性，將各因素條件進(jìn)行微調(diào)，最終確定玄參最佳提取工藝為溶媒比8倍，乙醇體積分?jǐn)?shù)82%，提取2次，每次75min。面法對(duì)玄參的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到的結(jié)果準(zhǔn)確，模型預(yù)測(cè)性良好，為玄參的工業(yè)化提取提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為起臨床的合理應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖2 溶媒比，體積分?jǐn)?shù)及其相互作用對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)面

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Optim ization of Extraction Technology for Radix Scrophulariae by Box－Behnken Response Surface M ethodology

SUN Lijun1MA Jingi1YANG Jing1HU Haitao2WANG Yue1
1.Daqing People's ital Heilongjiang Daqing 163316 China；2.Daqing Municipal Food and Drug Inspection Center Heilongjiang Daqing 163316 China

Objective：To optimize extraction technology of Radix Scrophulariae by Box－Behnken design.M ethods：To take the extraction time，solvent ratio and the ethanol concentration as independent variables，and take overall desirability as dependent variable（including the content of angorosideC，harpagide，harpagoside and extract yield），binomial formula was used to fit each level of independent variables，optimizing extraction process by Box－Behnken design and prediction was carried out through comparing observed and forecasted results.Results：Optimal extraction technology as follows：extracted 2 times for 75 minutes each time with 8 times amount of 82%ethanol.Regression coefficient of binomial fitting complexmode1 was as high as 0.9777.Bias between observed and predicted valueswas－2.51%.Conclusion：Optimal extraction process of Radix Scrophulariae was stable and reasonable.

Radix Scrophulariae；extraction proces；Box－Behnken response surfacemethod

R284.2

A

1007－8517（2015）20－0011－03

2015.07.17）