牛蒡子苷純化工藝優(yōu)選研究＊

毛 郴 ，付元元 ，劉貴娟 ，趙 語

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400016;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 401331)

牛蒡子 Fructus arctii為菊科牛蒡?qū)僦参锱］?Arctium lappa L.的干燥成熟果實(shí)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，牛蒡子提取物有抗腫瘤、降血糖、抗炎、抗菌、抗流感、抗人類免疫缺陷病毒(HIV)和抑制血小板聚集等作用[1－4]。牛蒡子苷是牛蒡子的主要有效成分，對于糖尿病及其微血管病變的臨床應(yīng)用前景值得期待[5]。本研究中采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以牛蒡子苷含量為指標(biāo)，優(yōu)選出牛蒡子乙醇回流法的提取條件，再經(jīng)大孔吸附樹脂、硅膠H層析柱純化精制，得到高純度的牛蒡子苷。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜(HPLC)儀(美國Agilent 1100型);RE－5203A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);JY2002型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。牛蒡子苷對照品(中國食品藥品檢定研究院);牛蒡子藥材(重慶桐君閣股份有限公司);AB－8型大孔吸附樹脂(凈化級)，D101型大孔吸附樹脂(凈化級)，均為南開大學(xué)化工廠產(chǎn)品;HPLC用甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 粗提

通過文獻(xiàn)調(diào)研[6－8]，確定乙醇回流提取法為適宜的牛蒡子苷提取方法。牛蒡子藥材干燥，粉碎，過4號篩，索氏回流提取法，經(jīng)6倍量石油醚脫脂3次，揮干石油醚，稱重，得脫脂粉末;脫脂粉末經(jīng)8倍量70%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得乙醇提取液的濃縮浸膏。

2.2 含量測定

色譜條件:色譜柱為 Diamonsil TMODS－C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇 －水(1 ∶1.1);測定波長 280 nm;流速為0.6 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL;柱溫:室溫。理論塔板數(shù)按牛蒡子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1 500。

溶液制備:精密稱取牛蒡子苷對照品10.00 mg，加流動(dòng)相制備成40 g/L的牛蒡子苷對照品溶液。取濃縮浸膏，加流動(dòng)相溶解后，定容至25 mL容量瓶中，搖勻，即得供試品溶液。

含量測定:分別吸取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件測定，外標(biāo)法(面積歸一法)計(jì)算牛蒡子苷的含量。

2.3 醇提法正交試驗(yàn)

因素水平確定:根據(jù)預(yù)試驗(yàn)情況，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(因素A)、回流次數(shù)(因素 B)、提取時(shí)間(因素 C)、溶劑用量(因素 D)為考察因素，每個(gè)因素選3個(gè)水平，以牛蒡子苷含量為考核指標(biāo)，按 L9(34)正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 牛蒡子苷醇提工藝正交試驗(yàn)因素水平

正交試驗(yàn)方法:各稱取牛蒡子粗粉10.0 g(過4號篩)，石油醚脫脂后，按表1方法1次提取，每種方法平行制備供試品液2份，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩０?.2項(xiàng)下方法測定含量，計(jì)算極差，結(jié)果見表2，方差分析見表3。由表2可知，因素D的極差最小，數(shù)據(jù)處理時(shí)作為最小誤差項(xiàng)。由表3可知，各因素對牛蒡子苷醇提工藝影響程度依次為B＞A＞C＞D。

表2 牛蒡子苷醇提工藝正交試驗(yàn)安排表及結(jié)果分析

表3 牛蒡子苷醇提工藝正交試驗(yàn)方差分析表

最佳工藝確定:根據(jù)直觀分析，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，回流3次，回流時(shí)間2.5 h，10倍溶劑量為最佳工藝。但為了節(jié)省成本和操作方便，選定牛蒡子苷的醇提工藝為:A3B3C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，回流次數(shù)3次，回流時(shí)間2 h，加8倍溶劑量。

2.4 粗分離

吸附原液制備:取牛蒡子粗粉10.0 g，經(jīng)石油醚脫脂后，70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，濃縮干燥，經(jīng)10%乙醇充分溶解，定容至100 mL，50攝氏度超聲，靜置24 h，過濾，備用。原液中牛蒡子苷的質(zhì)量濃度約為5.08 g/L。

大孔吸附樹脂預(yù)處理:將大孔吸附樹脂(凈化級)用95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹后濕法裝柱(300 mm×20 mm)，繼而用95%乙醇洗至流出液與水混合不產(chǎn)生渾濁，再用大量蒸餾水洗至無醇味，備用。

上樣:將吸附原液緩慢滴加至大孔吸附樹脂柱(徑高比1∶8)中，吸附流速為1 BV/h。

水洗:原液吸附完成后，用蒸餾水洗，洗脫流速為1 BV/h，洗脫至molish反應(yīng)呈陰性停止。用量約為1.5倍上樣量。

醇洗:選擇50%乙醇洗脫，洗脫流速為2 BV/h，用量為4倍上樣量。

洗脫液濃縮:收集50%乙醇洗脫液，70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮干殘留洗脫液。

2.5 純化

硅膠H層析柱純化牛蒡子苷:濕法裝硅膠H層析柱，平衡1 h，吸取柱中多余洗脫劑，緩慢滴加用少量洗脫劑溶解大孔吸附樹脂的粗分干燥物，等度洗脫，薄層色譜跟蹤，與標(biāo)準(zhǔn)品對照收集單點(diǎn)流分。

重結(jié)晶收集牛蒡子苷純品:45℃旋蒸已收集的單點(diǎn)流分，移取含有剩余少量洗脫劑的懸蒸產(chǎn)物，加入3B量的甲醇－水(1∶1.1)混合溶劑，重結(jié)晶，即得牛蒡子苷純品。HPLC檢測結(jié)果見圖1，牛蒡子苷純度為98.23%。

圖1 HPLC檢測牛蒡子苷色譜圖

3 討論

牛蒡子苷多經(jīng)水或乙醇自牛蒡子干燥藥材中提取得到[6－8]。本研究中采用正交試驗(yàn)方法，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、回流次數(shù)、提取時(shí)間及溶劑用量4個(gè)因素進(jìn)行考察，篩選出最優(yōu)提取方案，所得粗提物中牛蒡子苷的純度達(dá)90%以上。

大孔吸附樹脂是一類人工合成的有機(jī)高聚物吸附劑，因其具有多孔性結(jié)構(gòu)而具篩選性，又通過表面吸附、表面電性或形成氫鍵而具吸附性。程順峰等[9]及孫瑜[10]等利用其對牛蒡子苷進(jìn)行分離純化。根據(jù)大孔吸附樹脂的性質(zhì)和文獻(xiàn)分析，筆者選擇常用于木脂素類化合物分離的AB－8型和D101型大孔吸附樹脂進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，動(dòng)態(tài)吸附檢測發(fā)現(xiàn)，D101型后者的流速較慢，且易堵柱，效率較低，故選擇AB－8型進(jìn)行牛蒡子苷的分離研究。本研究中對吸附原液的溶劑濃度進(jìn)行優(yōu)化，另外選擇純水作為粗分離時(shí)吸附原液的溶劑，除去水不溶物，提高了分離純度。但由于牛蒡子的醇提物中含有大量的糖類，用水溶解會(huì)發(fā)生樹脂化現(xiàn)象，大大降低牛蒡子苷的收率。

牛蒡子苷的純化采用硅膠H層析柱、等度洗脫。牛蒡子苷極性較大，通過觀察硅膠H層析柱的色帶情況，判斷開始收集含牛蒡子苷流分的時(shí)間，同時(shí)薄層色譜跟蹤，合并單點(diǎn)流分。本研究中發(fā)現(xiàn)，層析柱的徑高比、洗脫溶劑的配比選擇等對牛蒡子苷的分離純化效果影響較大，可根據(jù)試驗(yàn)具體條件逐一優(yōu)化。

綜上所述，本研究方法制備的牛蒡子苷純度較高，但收率較低，不適合大量生產(chǎn)和制備，僅適用于對純度要求較高的實(shí)驗(yàn)室或小規(guī)模研究。

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