HEK293F細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)PDGFR-β/Fc蛋白的條件優(yōu)化*

洪 坡，袁鳳媚，黃嘉慧，劉東晨，張 途，謝秋玲

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院//廣東省生物工程藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//基因工程藥物國(guó)家工程研究中心，廣東廣州510632)

過(guò)去10年中，瞬時(shí)基因表達(dá)系統(tǒng)快速生產(chǎn)復(fù)雜治療性蛋白技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用［1］，瞬時(shí)基因表達(dá) (Transient gene expression，TGE)是一種使用動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)快速生產(chǎn)毫克級(jí)至克級(jí)重組蛋白的方法，目前最常用的細(xì)胞株是CHO細(xì)胞和HEK 293細(xì)胞，這兩種細(xì)胞可適應(yīng)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)［2］。HEK293細(xì)胞憑借其易轉(zhuǎn)染、高表達(dá)、天然人糖基化修飾、允許蛋白正確折疊和相關(guān)翻譯后修飾等優(yōu)點(diǎn)使用最為廣泛［3－4］。聚乙烯亞胺(PEI)是一種在小規(guī)模到大規(guī)模蛋白表達(dá)中廣泛使用的轉(zhuǎn)染試劑，它具有高效性和經(jīng)濟(jì)性等優(yōu)點(diǎn)［2，4－5］。PEI是一種陽(yáng)離子聚合物，可與 DNA 結(jié)合凝聚成帶正電荷的納米顆粒，顆粒與細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖黏合，并通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，從而促進(jìn)細(xì)胞對(duì)DNA的攝?。?－7］。線型和支化的25000 PEI是使用最為廣泛的聚合物，其中線型PEI轉(zhuǎn)染效率更高、毒性更小，常被用于懸浮培養(yǎng)的 HEK293 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染［8－10］。

血小板源性生長(zhǎng)因子 (platelet derived growth factor，PDGF)具有誘導(dǎo)腫瘤中淋巴管生成和促進(jìn)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的功能，是潛在的治療腫瘤分子靶標(biāo)［11］?？扇苄匝“逶葱陨L(zhǎng)因子受體 (sPDGFR)可與細(xì)胞膜表面的PDGFR競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 PDGF，從而阻斷PDGF的生物學(xué)效應(yīng)，有望用于腫瘤的治療［12－13］。PDGFR主要包含兩種結(jié)構(gòu)相似的受體亞型PDGFR-α 和 PDGFR-β。PDGFR的 β 鏈膜外區(qū)與人IgG Fc片段的重組型可溶性融合蛋白sPDGFR-β/Fc受體作為一種新型的PDGF拮抗劑，具有很好的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)用 PEI介導(dǎo) PDGFR-β/Fc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293F細(xì)胞，影響轉(zhuǎn)染效率和蛋白表達(dá)的因素有活細(xì)胞接種密度、DNA濃度、PEI濃度、DNA與PEI聚合時(shí)間以及添加物［14］，本實(shí)驗(yàn)對(duì)上述因素進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞株

HEK293F細(xì)胞由南開(kāi)大學(xué)惠贈(zèng)，pXLG-PDGFR-β/Fc為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑及儀器

無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒 (NucleoBond Xtro Maxi Plus)購(gòu)自德國(guó) MN公司;PEI購(gòu)自 Polysciences公司;EX-CELL?293無(wú)血清培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司;RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;Goat anti-Human IgG(Fc)、Goat pAb to Hu IgG(AP)購(gòu)自Abcam公司;蛋白胨購(gòu)自O(shè)rganotechnie公司;TubeSpin一次性生物反應(yīng)器購(gòu)自TPP公司;ACCU-CHEK?血糖儀購(gòu)自Roche公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293F細(xì)胞接種于含10 mL EX-CELL?293無(wú)血清培養(yǎng)基 (含6 mmol/L谷氨酰胺)的50 mL TubeSpin管中，置于37℃，φ=6%CO2，180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)密度控制在0.5×106cells/mL至4×106cells/mL范圍內(nèi)。在轉(zhuǎn)染前1 d，將細(xì)胞離心 (1000 r/min，5 min)，新鮮培養(yǎng)基重懸至2×106cells/mL。

1.4 質(zhì)粒制備

用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。NanoDrop2000測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度和純度，A260/280在1.8～1.9，A260/230應(yīng)大于2.0。

1.5 轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞活率需在95%以上。將實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞量的細(xì)胞懸液離心(1000 r/min，5 min)，一定量RPMI1640培養(yǎng)基于50 mL TubeSpin管中重懸。同時(shí)，按實(shí)驗(yàn)組設(shè)置，將一定量的質(zhì)粒DNA和PEI溶液混勻聚合。將DNA與PEI聚合溶液加入細(xì)胞懸液混勻，置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h收樣檢測(cè)目的蛋白質(zhì)量濃度。

1.6 葡萄糖質(zhì)量濃度測(cè)定

采用ACCU-CHEK?血糖儀測(cè)定。

1.7 PDGFR-β/Fc蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定

采用ELISA方法測(cè)定。以羊抗人IgG-Fc包被96孔酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。按一定梯度稀釋IgG標(biāo)準(zhǔn)品和培養(yǎng)液上清樣品，加入孔中37℃孵育1 h，扣干、洗板后加入w=0.5%BSA稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG，37℃孵育1 h。加顯色液孵育15 min，405 nm波長(zhǎng)下酶標(biāo)儀檢測(cè)A值。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PDGFR-β蛋白質(zhì)量濃度。每孔做3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HEK293F細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基本條件的優(yōu)化

PEI介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法中，影響瞬時(shí)轉(zhuǎn)染條件的基本因素有細(xì)胞接種活細(xì)胞密度、質(zhì)粒DNA濃度、PEI濃度、DNA與PEI的聚合時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞接種密度設(shè)定2×106cells/mL和4×106cells/mL兩個(gè)水平，DNA濃度設(shè)定1.5 μg/106cells和 2.0 μg/106cells兩個(gè)水平，DNA∶PEI設(shè)定為1∶2、1∶3、1∶4 三個(gè)水平，聚合時(shí)間設(shè)定為 5、10、15 min 3個(gè)水平。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)表一進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)上述條件進(jìn)行優(yōu)化，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 HEK293F細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基本條件的優(yōu)化Table 1 The primary condition optimization of PDGFR-β/Fc expression for transient gene expression in HEK293F cells

結(jié)果顯示 (表1)，當(dāng)細(xì)胞接種密度為2×106cells/mL時(shí)，DNA濃度增加，蛋白表達(dá)量略有增加，這是因?yàn)槭艿郊?xì)胞密度的限制，細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒DNA的攝入已達(dá)到峰值。當(dāng)細(xì)胞接種密度為4×106cells/mL時(shí)，增大DNA濃度，蛋白表達(dá)量明顯增加。增大PEI與DNA的比例，蛋白表達(dá)量相對(duì)稍低，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，增大PEI的濃度，細(xì)胞毒性增加，細(xì)胞活率相對(duì)低。增加DNA與PEI聚合時(shí)間，蛋白表達(dá)量降低。經(jīng)過(guò)組合優(yōu)化，HEK293F細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)PDGFR-β融合蛋白最佳條件是細(xì)胞接種密度4×106cells/mL、DNA濃度2.0 μg/106cells、DNA/PEI比例1∶2、聚合時(shí)間 5 min，蛋白表達(dá)量可達(dá)15.6 mg/L。

2.2 HEK293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染其它條件的優(yōu)化

2.2.1 添加VPA濃度及添加時(shí)間的優(yōu)化 在前述優(yōu)化的基本條件下，本實(shí)驗(yàn)先對(duì)VPA添加濃度進(jìn)行優(yōu)化，VPA添加濃度為2、3、4、5 mmol/L，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h添加。然后對(duì)VPA的添加時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，VPA添加時(shí)間為轉(zhuǎn)染后0、24、48 h，探索添加時(shí)間的影響。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1 添加不同濃度VPA對(duì)PDGFR-β表達(dá)的影響Fig.1 Optimization of VPA concentration

圖2 不同時(shí)間添加VPA對(duì)PDGFR-β表達(dá)的影響Fig.2 Optimization of time for adding VPA

不同濃度的VPA對(duì)細(xì)胞表達(dá)PDGFR-β蛋白均有促進(jìn)作用 (圖1)，在3～4 mmol/L的VPA的效果最好。在添加3 mmol/L VPA時(shí)，PDGFR-β蛋白表達(dá)量最高 (30 mg/L)，約為對(duì)照組的2倍。細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，在48 h內(nèi)的不同時(shí)間添加VPA，蛋白表達(dá)量相近 (約28 mg/L)，表明轉(zhuǎn)染后48 h內(nèi)的不同時(shí)間添加VPA對(duì)蛋白表達(dá)影響不大 (圖2)。

2.2.2 添加碳氮源對(duì)細(xì)胞表達(dá)PDGFR-β/Fc蛋白的影響

1)添加不同種類蛋白胨及其質(zhì)量濃度的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)選取6種蛋白胨進(jìn)行篩選，分別為Tryptone N1(胰蛋白胨，TN1)、Casein peptone E1(酪蛋白胨，CE1)、Meat peptone N1(肉蛋白胨，MN1)、Wheat peptone E1(小麥蛋白胨，WE1)、Soy peptone A3SC(大豆蛋白胨，SA3SC)、Soy peptone A2SC(大豆蛋白胨SA2SC)。在最優(yōu)的基本條件下，HEK293F細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第3天添加葡萄糖和蛋白胨，葡萄糖終質(zhì)量濃度為4 mg/L，蛋白胨終質(zhì)量濃度為1 g/L。

圖3 添加不同蛋白胨對(duì)PDGFR-β/Fc表達(dá)的影響Fig.3 The effect of adding different peptone

圖4 不同質(zhì)量濃度TN1對(duì)PDGFR-β/Fc表達(dá)的影響Fig.4 The effect of concentrations of TN1

添加不同種類蛋白胨，細(xì)胞蛋白表達(dá)量均有提高 (圖3)，其由高到低依次為TN1＞MN1＞SA2SC＞ER2＞W(wǎng)E1＞SA3SC。添加 TNI蛋白表達(dá)量最高，約為35 mg/L，較對(duì)照組提高2倍以上。

添加不同質(zhì)量濃度的蛋白胨 (TN1)對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)有明顯影響 (圖4)，在1 g/L到15 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著蛋白胨質(zhì)量濃度的增加，蛋白表達(dá)量下降。添加1 g/L和5 g/L質(zhì)量濃度時(shí)，均能促進(jìn)蛋白表達(dá)量，當(dāng)添加質(zhì)量濃度超過(guò)10 g/L，蛋白表達(dá)量反而較對(duì)照組低，細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示細(xì)胞活率相對(duì)較低，可能高質(zhì)量濃度蛋白胨的添加增大了培養(yǎng)液滲透壓，不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，添加的蛋白胨質(zhì)量濃度需要有一個(gè)合適的范圍，本實(shí)驗(yàn)當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)，蛋白表達(dá)量最高，達(dá)到35 mg/L。

2)添加葡萄糖和蛋白胨對(duì)細(xì)胞表達(dá)PDGFR-β/Fc蛋白的影響

HEK293F細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，第3天后葡萄糖低于2 mg/L(圖5)，故在第3天補(bǔ)充葡萄糖和蛋白胨，葡萄糖終質(zhì)量濃度為4 mg/L，蛋白胨 (Tryptone N1)終質(zhì)量濃度為1 g/L。

圖5 HEK293F細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基中葡萄糖含量Fig.5 The concentration of glucose after transfection

圖6 添加葡萄糖和蛋白胨對(duì)PDGFR-β表達(dá)的影響Fig.6 The effect of adding glucose and peptone

圖6結(jié)果表明，添加葡萄糖對(duì)細(xì)胞表達(dá)蛋白有促進(jìn)作用，同時(shí)補(bǔ)加葡萄糖和蛋白胨，蛋白表達(dá)量明顯增加，達(dá)到55 mg/L，是對(duì)照組的2倍以上。

綜上所述，以細(xì)胞接種密度4×106cells/mL、DNA 濃度 2.0 μg/106cells、DNA/PEI比例 1∶2、聚合時(shí)間5 min條件轉(zhuǎn)染后，48 h內(nèi)補(bǔ)加3 mmol/L VPA、第3天添加1 g/L的TN1，當(dāng)葡糖糖濃度低于2 mg/L時(shí)補(bǔ)至4 mg/L，可使PDGFR-β/Fc融合蛋白的表達(dá)量明顯提高。

3 討論

瞬時(shí)基因表達(dá)技術(shù)在重組藥物蛋白研發(fā)中已得到廣泛應(yīng)用，不但用于快速生產(chǎn)蛋白進(jìn)行成藥性評(píng)價(jià)，還用于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白。目前，PEI介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)單克隆抗體可以達(dá)到1 g/L以上的產(chǎn)量［15］。

細(xì)胞密度、DNA濃度和DNA∶PEI比例是影響細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素。一定范圍內(nèi)，增大細(xì)胞起始密度和DNA量可提高蛋白表達(dá)量。但是，細(xì)胞密度增加，細(xì)胞生長(zhǎng)周期縮短;DNA量增加，PEI的量也相應(yīng)增加，但是PEI對(duì)細(xì)胞有很大的毒性，導(dǎo)致細(xì)胞活率明顯下降，所以尋找DNA密度、DNA量、PEI濃度3個(gè)因素的最適水平至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)對(duì)3個(gè)因素水平進(jìn)行優(yōu)化，明顯提高了蛋白表達(dá)量。

丙戊酸鈉是臨床上常用的抗癲癇藥物，在有效治療濃度時(shí)表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制組蛋白去乙酰化酶的活性［16］。VPA通過(guò)抑制組蛋白去乙?；?(histone deacetylases，HDACs)活性或表達(dá)，可誘導(dǎo)HEK293F細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，細(xì)胞處于G1期的特點(diǎn)是物質(zhì)代謝活躍，迅速合成RNA和蛋白質(zhì)，細(xì)胞體積顯著增大。但是VPA抑制細(xì)胞增殖作用與添加濃度相關(guān)，適當(dāng)?shù)臐舛饶苁谷考?xì)胞處于G1期，大量合成蛋白質(zhì);超量使細(xì)胞生長(zhǎng)受到過(guò)度抑制，細(xì)胞死亡［17－18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加3 mmol/L VPA抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和提高蛋白表達(dá)量效果最好，48 h內(nèi)不同時(shí)間添加VPA對(duì)提高細(xì)胞蛋白表達(dá)量沒(méi)有顯著差異。

近幾年有文獻(xiàn)表明，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間添加不同種類的蛋白胨對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)有明顯差異。細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，在細(xì)胞懸液中添加DNA與PEI后，立刻加入蛋白胨，細(xì)胞轉(zhuǎn)染終止，轉(zhuǎn)染效率下降，這與蛋白胨中某些成分阻止了DNA/PEI復(fù)合物接觸細(xì)胞表面，或影響細(xì)胞對(duì)復(fù)合物的胞吞作用有關(guān)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，適當(dāng)?shù)臅r(shí)間添加一定量的蛋白胨除了為細(xì)胞補(bǔ)充氮源，還具有刺激細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)蛋白的作用［19］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)6種蛋白胨進(jìn)行篩選，探索最佳添加濃度，取得了良好效果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)活細(xì)胞接種密度、DNA濃度、PEI濃度、DNA與PEI聚合時(shí)間以及添加VPA、蛋白胨進(jìn)行了優(yōu)化，為大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)PDGFR-β/Fc蛋白奠定了基礎(chǔ)，也對(duì)HEK293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法具有一定的指導(dǎo)意義。

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