層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅固定化辣根過氧化物酶及其催化性質(zhì)

張 鋒，王 輝，趙立芳

（寶雞文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院 陜西省植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 寶雞 721013）

層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅固定化辣根過氧化物酶及其催化性質(zhì)

張 鋒，王 輝，趙立芳

（寶雞文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院 陜西省植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 寶雞 721013）

利用層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅對(duì)辣根過氧化物酶(HRP)進(jìn)行固定化實(shí)驗(yàn)，通過紫外分析探討了固定化效果與HRP質(zhì)量濃度、體系pH的關(guān)系。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)做圖法測(cè)定了固定化HRP的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，考察了固定化HRP的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和重復(fù)利用性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體系pH=8.0、HRP質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的條件下，層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅對(duì)HRP的飽和固載量為100 mg/g，最大比活力為60.27 U/mg。固定化HRP的米氏常數(shù)(Km)、催化常數(shù)(Kcat)、酶活性(X )分別為3.23 mmol/L，42.5 s-1，57.5 U/mg。與游離HRP相比，固定化HRP的Km提高了44.2%，Kcat下降了74.0%，X 值下降了74.4%。儲(chǔ)存40 d 后，固定化HRP的活性為游離HRP的5.35倍。循環(huán)利用8次后，固定化HRP的活性保留率仍為79.6%。

層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅；酶催化；固定化；辣根過氧化物酶；動(dòng)力學(xué)常數(shù)

層狀化合物是一種重要的固體功能納米材料，由特定結(jié)構(gòu)單元堆積成為空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［1］。這種獨(dú)特結(jié)構(gòu)和層間化學(xué)反應(yīng)活性使其在化學(xué)、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域（如作為吸附劑、催化劑、陰離子交換劑、納米藥物載體、生物催化劑以及生物傳感器等）均具有較好的應(yīng)用前景，特別是層狀雙金屬氫氧化物（LDH）得到更多的關(guān)注［2-6］。因此，層狀化合物的合成及應(yīng)用一直是功能性材料領(lǐng)域中的熱點(diǎn)研究課題。

辣根過氧化物酶(HRP)是一種從植物中提取出來的過氧化物酶，在過氧化氫或其他有機(jī)過氧化物存在的條件下，可以催化芳香族化合物的氧化，因此被廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成［7］、聚合物合成［8］、含酚類化合物廢水的處理［9］等方面。酚類有機(jī)廢水危害性大、污染范圍廣，因此該類廢水的有效降解方法已引起研究者的密切關(guān)注［10-13］。HRP降解酚類污染物反應(yīng)條件溫和、專一性高，但天然HRP的穩(wěn)定性差，不易重復(fù)利用；而固定化HRP的穩(wěn)定性大幅提高，可重復(fù)利用，降低使用成本。酶固定化技術(shù)的核心關(guān)鍵在于載體材料的選擇與制備，不同類型的載體對(duì)固定化酶的性能有很大影響。因此，尋求性能優(yōu)良的載體十分重要。

LDH類層狀化合物具有離子交換能力和生物兼容性，可作為載體插層固定生物大分子，發(fā)展?jié)摿薮蟆５@類載體主要以無機(jī)層狀材料為主，在處理生物大分子時(shí)需加入交聯(lián)劑進(jìn)行處理，這對(duì)目標(biāo)分子的生物活性會(huì)造成較大抑制［14］。目前國內(nèi)外以LDH類層狀納米材料作為載體固定化HRP的研究并不多見。

本工作以自制的層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅為載體，研究了該載體對(duì)HRP的固定化，并對(duì)固定化條件及固定化HRP的催化性質(zhì)進(jìn)行了探討。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

HRP：比活力大于200 U/mg，上海雪滿生物科技有限公司；苯酚、30%(w)過氧化氫溶液、Zn(NO3)2·6H2O、鄰氨基苯甲酸、四氨基安替吡啉：AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

721-100 型分光光度計(jì)：上海第三分析儀器廠；791型磁力攪拌器：中西遠(yuǎn)大科技有限公司；TGL-16C型臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；Cary-50型紫外可見光分光光度計(jì)：Varian公司；JSM-5500S型掃描電子顯微鏡：日本電子株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅的制備

室溫下，將250 mL的NaOH溶液(0.24 mol/L)在充分?jǐn)嚢柘戮徛尤?50 mL的Zn(NO3)2·6H2O溶液（0.12 mol/L）中，待反應(yīng)物完全混合后，繼續(xù)攪拌0.5 h，然后將溶液陳化4 h；抽濾，于40 ℃下真空干燥24 h，得到制備層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅化合物的初始原料。取初始原料0.545 1 g (含鋅3.2 mmol)并加入一定量的鄰氨基苯甲酸和15 mL蒸餾水，在不銹鋼反應(yīng)釜（75 mL）中進(jìn)行水熱合成反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后抽濾、洗滌，于40 ℃下干燥24 h，得到合成產(chǎn)物待用。

1.2.2 固定化HRP的制備

將0.5 g層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅分散在40 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=8.0)中，超聲波振蕩30 min，加入HRP溶液（5 mg/mL）10 mL，冰浴冷卻下攪拌8 h。離心分離，將沉淀用磷酸鹽緩沖溶液洗滌至pH=7.0，在0 ℃下保存待用，保留上清液測(cè)定HRP的含量。

1.2.3 HRP固載量的測(cè)定

首先配制一組不同濃度的HRP標(biāo)準(zhǔn)液，將其加入1 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=7.0)中，該緩沖溶液中苯酚、四氨基安替吡啉、過氧化氫的濃度依次為60，14.4，1.2 mmol/L。待反應(yīng)完全后，測(cè)定產(chǎn)物在510 nm 處的吸光度( A510)。以HRP濃度為橫坐標(biāo)、A510為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后取固定化實(shí)驗(yàn)后保留的上清液按上述實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)定A510，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中殘留HRP的質(zhì)量，按式（1）計(jì)算HRP的固載量。

式中，E為HRP的固載量，mg/g；mi為初始加入反應(yīng)體系中的HRP的質(zhì)量，mg；ms為加入載體的質(zhì)量，g；ρf為固載后上清液中HRP的質(zhì)量濃度，mg/ mL；V為固載體系的體積，mL。

1.2.4 HRP活性的測(cè)定

HRP的活性采用Worthington 法測(cè)定［15］，測(cè)定體系同1.2.3節(jié)。測(cè)定HRP催化苯酚氧化產(chǎn)物在510 nm處的吸光度變化率并換算成酶活力單位（U）。本實(shí)驗(yàn)中定義1個(gè)酶活力單位為在前述測(cè)定體系下單位時(shí)間（1 min）內(nèi)催化1 μmol 苯酚轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的HRP的質(zhì)量。按式（2）計(jì)算HRP的活性。

式中，X為酶活性，U/mg；U為酶活力單位，μmol/min；ε為產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)，L/(mol·cm)；L為液層厚度，cm；t為反應(yīng)時(shí)間，min；m為測(cè)定體系中HRP的質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 載體的表征結(jié)果

制備的層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅試樣的SEM照片見圖1，孔結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)見表1。由圖1可看出，所制備的試樣具有板層狀的形貌特征，且顆粒大小均勻，層間距適宜（為1.33 nm）；同時(shí)由表1可看出，該試樣具有較大的比表面積、孔體積和孔徑，能提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，確保載體獲得高固載量酶蛋白，滿足固定化酶載體的要求。

圖1 層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅的SEM照片F(xiàn)ig. 1 SEM image of layered zinc aminobenzoate hydroxide(LHZA).

表1 層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅的孔結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)Table 1 Pore structure of LHZA

2.2 HRP的固定化過程

HRP的固定化過程示意圖見圖2。

圖2 HRP的固定化過程示意Fig.2 Immobilization process of HRP.HRP：horseradish peroxidase.

由圖2可看出，合成的層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅具有類α-Ni(OH)2的結(jié)構(gòu)，鄰氨基苯甲酸根與Zn配位；而當(dāng)HRP溶液與載體混合時(shí)，HRP上的氨基與載體上剩余的氨基之間能以氫鍵形式結(jié)合在一起，從而將HRP固定在氫氧化氨基苯甲酸鋅載體上。

2.3 HRP質(zhì)量濃度對(duì)HRP固定化過程的影響

固定化處理后分離出的上清液的紫外譜圖見圖3A。由圖3A可看出，270，403 nm處的吸收峰隨體系中游離HRP質(zhì)量濃度的增大出現(xiàn)明顯的突躍。這兩處的吸收峰分別為HRP中氨基酸和鐵卟啉輔基的特征吸收峰。說明上清液中存在游離態(tài)的HRP，而吸收峰的突躍則說明載體固定化HRP的能力趨向于飽和，體系中的多余游離HRP全部保留在上清液中。圖3B為固定化HRP活性測(cè)試的紫外譜圖。由圖3B可看出，510 nm處的吸收峰為HRP催化苯酚氧化產(chǎn)物與4-氨基安替吡啉偶聯(lián)形成的吲哚染料醌亞胺的特征吸收峰。該處出現(xiàn)吸收峰證明載體上確實(shí)固載了HRP，且510 nm處的吸光度隨體系中游離HRP質(zhì)量濃度的增大而達(dá)到最大值，說明載體上的HRP達(dá)到了飽和固載量。

圖3 上清液(A)和固定化HRP活性測(cè)試(B)的紫外譜圖Fig. 3 UV spectra of supernatant liquid(A) and immobilized HRP(B).ρ(HRP)/(mg·mL-1)：a 0.1；b 0.3；c 0.5；d 1.5

HRP的飽和固載量見圖4a。由圖4a可看出，隨體系中游離HRP濃度的增大，固載量逐漸增大；當(dāng)游離HRP質(zhì)量濃度超過1.0 mg/mL后，固載量基本保持不變，表明載體的固載能力接近飽和，飽和固載量為100 mg/g。不同學(xué)者的相關(guān)研究結(jié)果表明，選用不同載體時(shí)，固載量差異較大。Gomez等［16］將大豆過氧化物酶和HRP固定在用氨丙基修飾的玻璃球上，飽和固載量為18.4 mg/g；Azevedo等［17］做了類似的研究，飽和固載量為21 mg/g；Zhai等［18］則將殼聚糖與層狀納米管的結(jié)合體作為載體進(jìn)行HRP的固定化研究，飽和固載量為21.5 mg/g。

固定化HRP的比活力測(cè)試結(jié)果見圖4b。由圖4b可看出，固定化HRP的比活力隨固載量的增加逐漸升高，最大值為60.27 U/mg；但固載量超過70 mg/g后，固定化HRP的比活力逐漸下降；當(dāng)達(dá)到飽和固載量后，固定化HRP的比活力降至45.91 U/mg。Lai等［19］將HRP固定在用氨丙基修飾的多孔玻璃珠上，也得到類似的結(jié)果，當(dāng)接近飽和固載量（9.60 mg/g）時(shí)，固定化HRP的比活力比未達(dá)飽和固載量時(shí)下降了30%。固定化酶的比活力下降在文獻(xiàn)報(bào)道中較為普遍。Sepa等［20］將HRP固定在SiO2納米棒上，每100 mg固定化酶的催化能力僅相當(dāng)于0.13 mg游離酶，比活力下降幅度超過99%。Teng等［21］將HRP固定在不同規(guī)格的聚二酰亞胺納米纖維上，飽和固載量為7.92 mg/g，比活力為游離酶的12.5%。大部分文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)操作中均使用交聯(lián)劑戊二醛來實(shí)現(xiàn)載體與HRP的連接，造成載體預(yù)處理過程復(fù)雜，固定化HRP的催化活性和比活力低。

圖4 固定化HRP的飽和固載量(a)和比活力(b)Fig.4 Maximum load capacity(a) and specific activity(b) of the immobilized HRP. Reaction conditions: ρ(LHZA)=10 mg/mL，pH=8.0，0 ℃，stirring speed 120 r/min.

相比上述載體，氫氧化氨基苯甲酸鋅作為L(zhǎng)DH類層狀化合物具有較強(qiáng)的離子交換能力，HRP受到金屬離子靜電吸引可與載體中的陰離子發(fā)生離子交換而進(jìn)入層間，同時(shí)層間HRP的氨基與配體中的氨基之間也可以形成氫鍵。電荷相互吸引及氫鍵的共同作用，使得層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅對(duì)HRP的固定化處理過程簡(jiǎn)單、固載效率高，且未引入戊二醛，使得HRP的空間構(gòu)象不會(huì)發(fā)生較大改變，有利于保持較高的催化活性。

2.4 體系pH對(duì)HRP固定化過程的影響

體系pH對(duì)HRP固定化效率的影響見圖5。由圖5可看出，隨體系pH的增加，HRP固定化效率逐漸增加。因?yàn)镠RP的等電點(diǎn)（pI）為7.2，當(dāng)體系pH＞7.2時(shí)，HRP帶負(fù)電荷，可通過與層間氨基苯甲酸根離子發(fā)生離子交換進(jìn)入層間，結(jié)合在載體上；而當(dāng)體系pH＜7.2時(shí)，HRP帶正電荷，因此固定化效率較低，但仍有一定量的HRP與載體結(jié)合，證實(shí)了載體與HRP的結(jié)合除靜電作用外，載體中的官能團(tuán)與HRP表面氨基之間的氫鍵作用對(duì)HRP的固定化也有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)體系pH＞8.0時(shí)，HRP的固定化效率變化幅度較小。為避免強(qiáng)堿性體系對(duì)HRP活性的影響，選擇pH=8.0作為固定化體系的最佳pH。

圖5 體系pH對(duì)HRP固定化效率的影響Fig.5 Effect of pH on the HRP immobilization efficiency.Reaction conditions: ρ(LHZA) 10 g/mL，ρ(HRP)=1.0 mg/mL，0 ℃，stirring speed 120 r/min.

2.5 固定化HRP的性質(zhì)

2.5.1 動(dòng)力學(xué)參數(shù)

固定化酶的催化活性是其核心性質(zhì)。為考察固定化HRP的催化活性，對(duì)固定化HRP的動(dòng)力學(xué)參數(shù)（包括米氏常數(shù)(Km)、催化常數(shù)(Kcat)、X進(jìn)行了測(cè)定。通過維持催化體系中過氧化氫濃度不變、改變苯酚濃度的方法測(cè)定酶催化速率；利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)做圖法線性擬合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算出Km和Kcat，并按式（2）計(jì)算X值，計(jì)算結(jié)果見圖6和表2。

圖6 不同苯酚濃度下的酶催化速率(a)和Lineweaver-Burk曲線(b)Fig.6 Rates(a) and Lineweaver-Burk plots(b) of enzyme catalysis for the oxidation of phenol with different concentration. Reaction conditions: 4-aminoantipyrine 14.4 mmol/L，hydrogen peroxide 1.2 mmol/L，pH=7.0，25 ℃，ρ(free HRP)=0.056 μg/mL，ρ(immobilized HRP)=0.15 μg/mL.Km：Michaelis constant；v：reaction speed.Immobilized enzyme；Free enzyme

表2 固定化HRP與游離HRP的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of the immobilized and free HRP

由表2可知，固定化HRP的Km比游離HRP增大了44.2%，而Kcat和U值分別下降了74.0%和74.4%。表3為部分文獻(xiàn)中報(bào)道的固定化酶的催化活性數(shù)據(jù)。由表3可看出，固定化后酶的催化活性普遍降低，且利用不同基底材料固定化HRP的固載體系的催化特點(diǎn)各不相同。層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅的層間距為1.33 nm，HRP在進(jìn)入層間的結(jié)合過程中空間構(gòu)象發(fā)生改變，造成活性中心內(nèi)收，這造成HRP在參與催化反應(yīng)過程中需消耗更多的底物來實(shí)現(xiàn)底物與活性中心的有效結(jié)合，從而使得固定化HRP的Km增大；此外，由于插層式固定化的原因，底物進(jìn)入層間的有效濃度也決定了催化反應(yīng)速率，這也有可能是造成固定化HRP的Km變大的原因。雖然氫鍵和電荷相互作用影響了HRP的三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)而降低了其催化活性，但層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅載體上飽和固載量大的優(yōu)點(diǎn)可以部分彌補(bǔ)實(shí)際應(yīng)用中固定化HRP催化活性不足的問題。

表3 文獻(xiàn)中報(bào)道的固定化酶的催化活性與重復(fù)利用性Table 3 Catalytic activity and reusability of immobilized enzyme reported in literatures

2.5.2 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將制備好的固定化HRP與游離HRP分散在0.2 mol/L、pH=8.0 的磷酸鹽緩沖液中于-10 ℃下儲(chǔ)存，每隔一定時(shí)間解凍少量并測(cè)定其活性。以儲(chǔ)存時(shí)間為橫坐標(biāo)、相對(duì)活性為縱坐標(biāo)，得到固定化HRP在不同儲(chǔ)存時(shí)間下的活性變化曲線，同時(shí)與游離HRP進(jìn)行對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 固定化HRP與游離HRP的儲(chǔ)存穩(wěn)定性比較Fig.7 Storage stability of the immobilized HRP and free HRP. Storage conditions: ρ(HRP)=1 mg/mL，pH=8.0，-10 ℃.Immobilized HRP；Free HRP

由圖7可看出，在相同的儲(chǔ)存條件下，固定化HRP的活性下降速率更緩慢。-10 ℃下儲(chǔ)存40 d后，固定化HRP的活性為初始活性的56.2%，為游離HRP的5.35倍。通過加入交聯(lián)劑制備的固定化HRP一般具有更長(zhǎng)的儲(chǔ)存穩(wěn)定期。但戊二醛之類的交聯(lián)劑對(duì)HRP空間構(gòu)型及原始催化活性產(chǎn)生較大的影響，而以本實(shí)驗(yàn)制備的層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅為載體對(duì)HRP的活性影響較小，插層式結(jié)構(gòu)有利于提高HRP空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，降低了長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存可能造成的發(fā)生構(gòu)象變化的幾率，保護(hù)HRP的特定活性位點(diǎn)不被扭曲，從而提高HRP的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

2.5.3 重復(fù)利用性

固定化酶的重復(fù)利用性使其在反應(yīng)結(jié)束后能從反應(yīng)體系中分離出來并二次使用，在實(shí)際生產(chǎn)中能減少酶的用量，降低成本。因此，對(duì)制備的固定化HRP的重復(fù)利用性進(jìn)行了考察。收集使用后的固定化HRP用緩沖溶液充分洗滌后重復(fù)測(cè)定其活性，得到活性隨重復(fù)使用次數(shù)的變化曲線，見圖8。

由圖8可看出，固定化HRP的活性隨循環(huán)使用次數(shù)的增加而逐漸降低，但循環(huán)利用8次后，固定化HRP的活性保留率仍為79.6%。而由表3可看出，大部分固定化酶重復(fù)使用6次后活性均降至原來的30%以下。固定化HRP失活的原因主要有以下幾方面：1）HRP形成沒有活性的惰性中間產(chǎn)物；2）酚氧自由基對(duì)HRP活性中心的進(jìn)攻；3）聚合物堆積在固定化HRP表面阻礙HRP與底物的進(jìn)一步接觸；4）固定化HRP從載體上脫落；5）載體材料的損失。在上述原因中，前兩點(diǎn)與催化機(jī)理有關(guān)，不易改變；而后三點(diǎn)則與載體材料的性能和固定化條件有關(guān)。本課題組［27-28］以納米氧化鋅、氧化石墨烯作為載體材料進(jìn)行HRP固定化實(shí)驗(yàn)，固定化HRP重復(fù)利用4次后活性分別為原來的15% 和35%。納米氧化鋅固定化HRP在重復(fù)利用過程中容易從載體上脫落，氧化石墨烯固定化HRP則在離心過程中容易損失材料，因此重復(fù)利用性不高。而LDH類層狀化合物固定化HRP借助離子交換及氫鍵的共同作用，使得HRP的吸附效率高，催化過程中不易脫落；并且插層式結(jié)構(gòu)使得反應(yīng)中間過程的酚氧自由基、催化形成的聚合物不易直接與HRP結(jié)合，從而有利于保護(hù)固定化HRP的催化活性。因此，LDH類層狀化合物作為固定化酶載體材料具有一定優(yōu)勢(shì)。如何進(jìn)一步在催化反應(yīng)過程中降低HRP的失活，提高固載HRP的重復(fù)利用性，以加強(qiáng)固載HRP在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用仍值得深入研究。

圖8 固定化HRP的重復(fù)利用性Fig.8 Reusability of the immobilized HRP.Reaction conditions: 4-aminoantipyrine 14.4 mmol/L，hydrogen peroxide 1.2 mmol/L，pH=7.0，25 ℃,ρ(immobilized HRP)=0.60 μg/mL.

3 結(jié)論

1）利用自制層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅進(jìn)行了HRP固定化實(shí)驗(yàn)。紫外分析證明，層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅能固定化HRP，在pH=8.0、HRP質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的條件下，飽和固載量、最大比活力分別為100 mg/g和60.27 U/mg。

2）利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)做圖法測(cè)定了固定化HRP的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，Km，Kcat，X分別為3.23 mmol/L，42.5 s-1，57.5 U/mg。與游離HRP相比，固定化HRP的Km提高了44.2%，Kcat下降了74.0%，X值下降了74.4%。

3）制備的固定化HRP具有較好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和重復(fù)利用性。在-10 ℃下儲(chǔ)存40 d 后，固定化HRP的活性為游離HRP的5.35倍。循環(huán)利用8次后，固定化HRP的活性保留率仍為79.6%。

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(編輯 安 靜)

Immobilization of Horseradish Peroxidase on Layered Zinc Aminobenzoate Hydroxide and Its Catalysis

Zhang Feng，Wang Hui，Zhao Lifang
(Shaanxi Key Laboratory of Phytochemistry，Department of Chemistry and Chemical Engineering，Baoji University of Arts and Sciences，Baoji Shaanxi 721013，China)

The immobilization of horseradish peroxidase(HRP) on layered zinc aminobenzoate hydroxide support was conducted. The effects of the HRP mass concentration and pH on the immobilization were investigated by means of UV analysis. The kinetics constants of the HRP immobilization were determined by Lineweaver-Burk double-reciprocal plot method. The storage stability and reusability of the immobilized HRP were studied. The experiment results showed that the immobilized HRP on layered zinc aminobenzoate hydroxide with a maximum immobilization capacity of 100 mg/g and specific activity of 60.27 U/mg could be prepared under the optimal conditions of pH 8.0 and HRP mass concentration 1.0 mg/mL. The michaelis constant(Km)，catalytic constant(Kcat) and enzyme activity (X ) of the immobilized HRP were 3.23 mmol/L，42.5 s-1and 57.5 U/mg，respectively. Compared with free enzyme，Kmof the immobilized enzyme increased by 44.2%，while its Kcatand X decreased by 74.0% and 74.4%，respectively. The activity of the immobilized enzyme was 5.35 times that of free enzyme after they were stored 40 d，and still reached 79.6% of its original activity after being reused eight times.

layered zinc aminobenzoate hydroxide；enzyme catalysis；horseradish peroxidase；kinetics constant

1000-8144（2015）03-0332-07

TQ 033

A

2014-09-15；［修改稿日期］ 2014-11-21。

張鋒（1982—），男，陜西省寶雞市人，碩士，講師，電話 18791704159，電郵 jimmy0217@126.com。

陜西省科技廳工業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（2014K08-36）; 寶雞市科技局項(xiàng)目（2013R7-4）; 陜西省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（12JK0843）;陜西省植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（14JS005, 12JS008）; 寶雞文理學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目（ZK12033，ZK12032）。