• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅固定化辣根過(guò)氧化物酶及其催化性質(zhì)

    2015-06-06 11:55:17趙立芳
    石油化工 2015年3期
    關(guān)鍵詞:體系

    張 鋒,王 輝,趙立芳

    (寶雞文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院 陜西省植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 寶雞 721013)

    層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅固定化辣根過(guò)氧化物酶及其催化性質(zhì)

    張 鋒,王 輝,趙立芳

    (寶雞文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院 陜西省植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 寶雞 721013)

    利用層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅對(duì)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)進(jìn)行固定化實(shí)驗(yàn),通過(guò)紫外分析探討了固定化效果與HRP質(zhì)量濃度、體系pH的關(guān)系。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)做圖法測(cè)定了固定化HRP的動(dòng)力學(xué)常數(shù),考察了固定化HRP的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和重復(fù)利用性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在體系pH=8.0、HRP質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的條件下,層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅對(duì)HRP的飽和固載量為100 mg/g,最大比活力為60.27 U/mg。固定化HRP的米氏常數(shù)(Km)、催化常數(shù)(Kcat)、酶活性(X )分別為3.23 mmol/L,42.5 s-1,57.5 U/mg。與游離HRP相比,固定化HRP的Km提高了44.2%,Kcat下降了74.0%,X 值下降了74.4%。儲(chǔ)存40 d 后,固定化HRP的活性為游離HRP的5.35倍。循環(huán)利用8次后,固定化HRP的活性保留率仍為79.6%。

    層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅;酶催化;固定化;辣根過(guò)氧化物酶;動(dòng)力學(xué)常數(shù)

    層狀化合物是一種重要的固體功能納米材料,由特定結(jié)構(gòu)單元堆積成為空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1]。這種獨(dú)特結(jié)構(gòu)和層間化學(xué)反應(yīng)活性使其在化學(xué)、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域(如作為吸附劑、催化劑、陰離子交換劑、納米藥物載體、生物催化劑以及生物傳感器等)均具有較好的應(yīng)用前景,特別是層狀雙金屬氫氧化物(LDH)得到更多的關(guān)注[2-6]。因此,層狀化合物的合成及應(yīng)用一直是功能性材料領(lǐng)域中的熱點(diǎn)研究課題。

    辣根過(guò)氧化物酶(HRP)是一種從植物中提取出來(lái)的過(guò)氧化物酶,在過(guò)氧化氫或其他有機(jī)過(guò)氧化物存在的條件下,可以催化芳香族化合物的氧化,因此被廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成[7]、聚合物合成[8]、含酚類化合物廢水的處理[9]等方面。酚類有機(jī)廢水危害性大、污染范圍廣,因此該類廢水的有效降解方法已引起研究者的密切關(guān)注[10-13]。HRP降解酚類污染物反應(yīng)條件溫和、專一性高,但天然HRP的穩(wěn)定性差,不易重復(fù)利用;而固定化HRP的穩(wěn)定性大幅提高,可重復(fù)利用,降低使用成本。酶固定化技術(shù)的核心關(guān)鍵在于載體材料的選擇與制備,不同類型的載體對(duì)固定化酶的性能有很大影響。因此,尋求性能優(yōu)良的載體十分重要。

    LDH類層狀化合物具有離子交換能力和生物兼容性,可作為載體插層固定生物大分子,發(fā)展?jié)摿薮蟆5@類載體主要以無(wú)機(jī)層狀材料為主,在處理生物大分子時(shí)需加入交聯(lián)劑進(jìn)行處理,這對(duì)目標(biāo)分子的生物活性會(huì)造成較大抑制[14]。目前國(guó)內(nèi)外以LDH類層狀納米材料作為載體固定化HRP的研究并不多見。

    本工作以自制的層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅為載體,研究了該載體對(duì)HRP的固定化,并對(duì)固定化條件及固定化HRP的催化性質(zhì)進(jìn)行了探討。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 試劑與儀器

    HRP:比活力大于200 U/mg,上海雪滿生物科技有限公司;苯酚、30%(w)過(guò)氧化氫溶液、Zn(NO3)2·6H2O、鄰氨基苯甲酸、四氨基安替吡啉:AR,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

    721-100 型分光光度計(jì):上海第三分析儀器廠;791型磁力攪拌器:中西遠(yuǎn)大科技有限公司;TGL-16C型臺(tái)式離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;Cary-50型紫外可見光分光光度計(jì):Varian公司;JSM-5500S型掃描電子顯微鏡:日本電子株式會(huì)社。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅的制備

    室溫下,將250 mL的NaOH溶液(0.24 mol/L)在充分?jǐn)嚢柘戮徛尤?50 mL的Zn(NO3)2·6H2O溶液(0.12 mol/L)中,待反應(yīng)物完全混合后,繼續(xù)攪拌0.5 h,然后將溶液陳化4 h;抽濾,于40 ℃下真空干燥24 h,得到制備層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅化合物的初始原料。取初始原料0.545 1 g (含鋅3.2 mmol)并加入一定量的鄰氨基苯甲酸和15 mL蒸餾水,在不銹鋼反應(yīng)釜(75 mL)中進(jìn)行水熱合成反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后抽濾、洗滌,于40 ℃下干燥24 h,得到合成產(chǎn)物待用。

    1.2.2 固定化HRP的制備

    將0.5 g層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅分散在40 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L,pH=8.0)中,超聲波振蕩30 min,加入HRP溶液(5 mg/mL)10 mL,冰浴冷卻下攪拌8 h。離心分離,將沉淀用磷酸鹽緩沖溶液洗滌至pH=7.0,在0 ℃下保存待用,保留上清液測(cè)定HRP的含量。

    1.2.3 HRP固載量的測(cè)定

    首先配制一組不同濃度的HRP標(biāo)準(zhǔn)液,將其加入1 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L,pH=7.0)中,該緩沖溶液中苯酚、四氨基安替吡啉、過(guò)氧化氫的濃度依次為60,14.4,1.2 mmol/L。待反應(yīng)完全后,測(cè)定產(chǎn)物在510 nm 處的吸光度( A510)。以HRP濃度為橫坐標(biāo)、A510為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后取固定化實(shí)驗(yàn)后保留的上清液按上述實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)定A510,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中殘留HRP的質(zhì)量,按式(1)計(jì)算HRP的固載量。

    式中,E為HRP的固載量,mg/g;mi為初始加入反應(yīng)體系中的HRP的質(zhì)量,mg;ms為加入載體的質(zhì)量,g;ρf為固載后上清液中HRP的質(zhì)量濃度,mg/ mL;V為固載體系的體積,mL。

    1.2.4 HRP活性的測(cè)定

    HRP的活性采用Worthington 法測(cè)定[15],測(cè)定體系同1.2.3節(jié)。測(cè)定HRP催化苯酚氧化產(chǎn)物在510 nm處的吸光度變化率并換算成酶活力單位(U)。本實(shí)驗(yàn)中定義1個(gè)酶活力單位為在前述測(cè)定體系下單位時(shí)間(1 min)內(nèi)催化1 μmol 苯酚轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的HRP的質(zhì)量。按式(2)計(jì)算HRP的活性。

    式中,X為酶活性,U/mg;U為酶活力單位,μmol/min;ε為產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù),L/(mol·cm);L為液層厚度,cm;t為反應(yīng)時(shí)間,min;m為測(cè)定體系中HRP的質(zhì)量,mg。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 載體的表征結(jié)果

    制備的層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅試樣的SEM照片見圖1,孔結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)見表1。由圖1可看出,所制備的試樣具有板層狀的形貌特征,且顆粒大小均勻,層間距適宜(為1.33 nm);同時(shí)由表1可看出,該試樣具有較大的比表面積、孔體積和孔徑,能提供更多的結(jié)合位點(diǎn),確保載體獲得高固載量酶蛋白,滿足固定化酶載體的要求。

    圖1 層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅的SEM照片F(xiàn)ig. 1 SEM image of layered zinc aminobenzoate hydroxide(LHZA).

    表1 層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅的孔結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)Table 1 Pore structure of LHZA

    2.2 HRP的固定化過(guò)程

    HRP的固定化過(guò)程示意圖見圖2。

    圖2 HRP的固定化過(guò)程示意Fig.2 Immobilization process of HRP.HRP:horseradish peroxidase.

    由圖2可看出,合成的層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅具有類α-Ni(OH)2的結(jié)構(gòu),鄰氨基苯甲酸根與Zn配位;而當(dāng)HRP溶液與載體混合時(shí),HRP上的氨基與載體上剩余的氨基之間能以氫鍵形式結(jié)合在一起,從而將HRP固定在氫氧化氨基苯甲酸鋅載體上。

    2.3 HRP質(zhì)量濃度對(duì)HRP固定化過(guò)程的影響

    固定化處理后分離出的上清液的紫外譜圖見圖3A。由圖3A可看出,270,403 nm處的吸收峰隨體系中游離HRP質(zhì)量濃度的增大出現(xiàn)明顯的突躍。這兩處的吸收峰分別為HRP中氨基酸和鐵卟啉輔基的特征吸收峰。說(shuō)明上清液中存在游離態(tài)的HRP,而吸收峰的突躍則說(shuō)明載體固定化HRP的能力趨向于飽和,體系中的多余游離HRP全部保留在上清液中。圖3B為固定化HRP活性測(cè)試的紫外譜圖。由圖3B可看出,510 nm處的吸收峰為HRP催化苯酚氧化產(chǎn)物與4-氨基安替吡啉偶聯(lián)形成的吲哚染料醌亞胺的特征吸收峰。該處出現(xiàn)吸收峰證明載體上確實(shí)固載了HRP,且510 nm處的吸光度隨體系中游離HRP質(zhì)量濃度的增大而達(dá)到最大值,說(shuō)明載體上的HRP達(dá)到了飽和固載量。

    圖3 上清液(A)和固定化HRP活性測(cè)試(B)的紫外譜圖Fig. 3 UV spectra of supernatant liquid(A) and immobilized HRP(B).ρ(HRP)/(mg·mL-1):a 0.1;b 0.3;c 0.5;d 1.5

    HRP的飽和固載量見圖4a。由圖4a可看出,隨體系中游離HRP濃度的增大,固載量逐漸增大;當(dāng)游離HRP質(zhì)量濃度超過(guò)1.0 mg/mL后,固載量基本保持不變,表明載體的固載能力接近飽和,飽和固載量為100 mg/g。不同學(xué)者的相關(guān)研究結(jié)果表明,選用不同載體時(shí),固載量差異較大。Gomez等[16]將大豆過(guò)氧化物酶和HRP固定在用氨丙基修飾的玻璃球上,飽和固載量為18.4 mg/g;Azevedo等[17]做了類似的研究,飽和固載量為21 mg/g;Zhai等[18]則將殼聚糖與層狀納米管的結(jié)合體作為載體進(jìn)行HRP的固定化研究,飽和固載量為21.5 mg/g。

    固定化HRP的比活力測(cè)試結(jié)果見圖4b。由圖4b可看出,固定化HRP的比活力隨固載量的增加逐漸升高,最大值為60.27 U/mg;但固載量超過(guò)70 mg/g后,固定化HRP的比活力逐漸下降;當(dāng)達(dá)到飽和固載量后,固定化HRP的比活力降至45.91 U/mg。Lai等[19]將HRP固定在用氨丙基修飾的多孔玻璃珠上,也得到類似的結(jié)果,當(dāng)接近飽和固載量(9.60 mg/g)時(shí),固定化HRP的比活力比未達(dá)飽和固載量時(shí)下降了30%。固定化酶的比活力下降在文獻(xiàn)報(bào)道中較為普遍。Sepa等[20]將HRP固定在SiO2納米棒上,每100 mg固定化酶的催化能力僅相當(dāng)于0.13 mg游離酶,比活力下降幅度超過(guò)99%。Teng等[21]將HRP固定在不同規(guī)格的聚二酰亞胺納米纖維上,飽和固載量為7.92 mg/g,比活力為游離酶的12.5%。大部分文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)操作中均使用交聯(lián)劑戊二醛來(lái)實(shí)現(xiàn)載體與HRP的連接,造成載體預(yù)處理過(guò)程復(fù)雜,固定化HRP的催化活性和比活力低。

    圖4 固定化HRP的飽和固載量(a)和比活力(b)Fig.4 Maximum load capacity(a) and specific activity(b) of the immobilized HRP. Reaction conditions: ρ(LHZA)=10 mg/mL,pH=8.0,0 ℃,stirring speed 120 r/min.

    相比上述載體,氫氧化氨基苯甲酸鋅作為L(zhǎng)DH類層狀化合物具有較強(qiáng)的離子交換能力,HRP受到金屬離子靜電吸引可與載體中的陰離子發(fā)生離子交換而進(jìn)入層間,同時(shí)層間HRP的氨基與配體中的氨基之間也可以形成氫鍵。電荷相互吸引及氫鍵的共同作用,使得層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅對(duì)HRP的固定化處理過(guò)程簡(jiǎn)單、固載效率高,且未引入戊二醛,使得HRP的空間構(gòu)象不會(huì)發(fā)生較大改變,有利于保持較高的催化活性。

    2.4 體系pH對(duì)HRP固定化過(guò)程的影響

    體系pH對(duì)HRP固定化效率的影響見圖5。由圖5可看出,隨體系pH的增加,HRP固定化效率逐漸增加。因?yàn)镠RP的等電點(diǎn)(pI)為7.2,當(dāng)體系pH>7.2時(shí),HRP帶負(fù)電荷,可通過(guò)與層間氨基苯甲酸根離子發(fā)生離子交換進(jìn)入層間,結(jié)合在載體上;而當(dāng)體系pH<7.2時(shí),HRP帶正電荷,因此固定化效率較低,但仍有一定量的HRP與載體結(jié)合,證實(shí)了載體與HRP的結(jié)合除靜電作用外,載體中的官能團(tuán)與HRP表面氨基之間的氫鍵作用對(duì)HRP的固定化也有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)體系pH>8.0時(shí),HRP的固定化效率變化幅度較小。為避免強(qiáng)堿性體系對(duì)HRP活性的影響,選擇pH=8.0作為固定化體系的最佳pH。

    圖5 體系pH對(duì)HRP固定化效率的影響Fig.5 Effect of pH on the HRP immobilization efficiency.Reaction conditions: ρ(LHZA) 10 g/mL,ρ(HRP)=1.0 mg/mL,0 ℃,stirring speed 120 r/min.

    2.5 固定化HRP的性質(zhì)

    2.5.1 動(dòng)力學(xué)參數(shù)

    固定化酶的催化活性是其核心性質(zhì)。為考察固定化HRP的催化活性,對(duì)固定化HRP的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(包括米氏常數(shù)(Km)、催化常數(shù)(Kcat)、X進(jìn)行了測(cè)定。通過(guò)維持催化體系中過(guò)氧化氫濃度不變、改變苯酚濃度的方法測(cè)定酶催化速率;利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)做圖法線性擬合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,計(jì)算出Km和Kcat,并按式(2)計(jì)算X值,計(jì)算結(jié)果見圖6和表2。

    圖6 不同苯酚濃度下的酶催化速率(a)和Lineweaver-Burk曲線(b)Fig.6 Rates(a) and Lineweaver-Burk plots(b) of enzyme catalysis for the oxidation of phenol with different concentration. Reaction conditions: 4-aminoantipyrine 14.4 mmol/L,hydrogen peroxide 1.2 mmol/L,pH=7.0,25 ℃,ρ(free HRP)=0.056 μg/mL,ρ(immobilized HRP)=0.15 μg/mL.Km:Michaelis constant;v:reaction speed.Immobilized enzyme;Free enzyme

    表2 固定化HRP與游離HRP的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of the immobilized and free HRP

    由表2可知,固定化HRP的Km比游離HRP增大了44.2%,而Kcat和U值分別下降了74.0%和74.4%。表3為部分文獻(xiàn)中報(bào)道的固定化酶的催化活性數(shù)據(jù)。由表3可看出,固定化后酶的催化活性普遍降低,且利用不同基底材料固定化HRP的固載體系的催化特點(diǎn)各不相同。層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅的層間距為1.33 nm,HRP在進(jìn)入層間的結(jié)合過(guò)程中空間構(gòu)象發(fā)生改變,造成活性中心內(nèi)收,這造成HRP在參與催化反應(yīng)過(guò)程中需消耗更多的底物來(lái)實(shí)現(xiàn)底物與活性中心的有效結(jié)合,從而使得固定化HRP的Km增大;此外,由于插層式固定化的原因,底物進(jìn)入層間的有效濃度也決定了催化反應(yīng)速率,這也有可能是造成固定化HRP的Km變大的原因。雖然氫鍵和電荷相互作用影響了HRP的三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)而降低了其催化活性,但層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅載體上飽和固載量大的優(yōu)點(diǎn)可以部分彌補(bǔ)實(shí)際應(yīng)用中固定化HRP催化活性不足的問(wèn)題。

    表3 文獻(xiàn)中報(bào)道的固定化酶的催化活性與重復(fù)利用性Table 3 Catalytic activity and reusability of immobilized enzyme reported in literatures

    2.5.2 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

    將制備好的固定化HRP與游離HRP分散在0.2 mol/L、pH=8.0 的磷酸鹽緩沖液中于-10 ℃下儲(chǔ)存,每隔一定時(shí)間解凍少量并測(cè)定其活性。以儲(chǔ)存時(shí)間為橫坐標(biāo)、相對(duì)活性為縱坐標(biāo),得到固定化HRP在不同儲(chǔ)存時(shí)間下的活性變化曲線,同時(shí)與游離HRP進(jìn)行對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。

    圖7 固定化HRP與游離HRP的儲(chǔ)存穩(wěn)定性比較Fig.7 Storage stability of the immobilized HRP and free HRP. Storage conditions: ρ(HRP)=1 mg/mL,pH=8.0,-10 ℃.Immobilized HRP;Free HRP

    由圖7可看出,在相同的儲(chǔ)存條件下,固定化HRP的活性下降速率更緩慢。-10 ℃下儲(chǔ)存40 d后,固定化HRP的活性為初始活性的56.2%,為游離HRP的5.35倍。通過(guò)加入交聯(lián)劑制備的固定化HRP一般具有更長(zhǎng)的儲(chǔ)存穩(wěn)定期。但戊二醛之類的交聯(lián)劑對(duì)HRP空間構(gòu)型及原始催化活性產(chǎn)生較大的影響,而以本實(shí)驗(yàn)制備的層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅為載體對(duì)HRP的活性影響較小,插層式結(jié)構(gòu)有利于提高HRP空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,降低了長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存可能造成的發(fā)生構(gòu)象變化的幾率,保護(hù)HRP的特定活性位點(diǎn)不被扭曲,從而提高HRP的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

    2.5.3 重復(fù)利用性

    固定化酶的重復(fù)利用性使其在反應(yīng)結(jié)束后能從反應(yīng)體系中分離出來(lái)并二次使用,在實(shí)際生產(chǎn)中能減少酶的用量,降低成本。因此,對(duì)制備的固定化HRP的重復(fù)利用性進(jìn)行了考察。收集使用后的固定化HRP用緩沖溶液充分洗滌后重復(fù)測(cè)定其活性,得到活性隨重復(fù)使用次數(shù)的變化曲線,見圖8。

    由圖8可看出,固定化HRP的活性隨循環(huán)使用次數(shù)的增加而逐漸降低,但循環(huán)利用8次后,固定化HRP的活性保留率仍為79.6%。而由表3可看出,大部分固定化酶重復(fù)使用6次后活性均降至原來(lái)的30%以下。固定化HRP失活的原因主要有以下幾方面:1)HRP形成沒有活性的惰性中間產(chǎn)物;2)酚氧自由基對(duì)HRP活性中心的進(jìn)攻;3)聚合物堆積在固定化HRP表面阻礙HRP與底物的進(jìn)一步接觸;4)固定化HRP從載體上脫落;5)載體材料的損失。在上述原因中,前兩點(diǎn)與催化機(jī)理有關(guān),不易改變;而后三點(diǎn)則與載體材料的性能和固定化條件有關(guān)。本課題組[27-28]以納米氧化鋅、氧化石墨烯作為載體材料進(jìn)行HRP固定化實(shí)驗(yàn),固定化HRP重復(fù)利用4次后活性分別為原來(lái)的15% 和35%。納米氧化鋅固定化HRP在重復(fù)利用過(guò)程中容易從載體上脫落,氧化石墨烯固定化HRP則在離心過(guò)程中容易損失材料,因此重復(fù)利用性不高。而LDH類層狀化合物固定化HRP借助離子交換及氫鍵的共同作用,使得HRP的吸附效率高,催化過(guò)程中不易脫落;并且插層式結(jié)構(gòu)使得反應(yīng)中間過(guò)程的酚氧自由基、催化形成的聚合物不易直接與HRP結(jié)合,從而有利于保護(hù)固定化HRP的催化活性。因此,LDH類層狀化合物作為固定化酶載體材料具有一定優(yōu)勢(shì)。如何進(jìn)一步在催化反應(yīng)過(guò)程中降低HRP的失活,提高固載HRP的重復(fù)利用性,以加強(qiáng)固載HRP在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用仍值得深入研究。

    圖8 固定化HRP的重復(fù)利用性Fig.8 Reusability of the immobilized HRP.Reaction conditions: 4-aminoantipyrine 14.4 mmol/L,hydrogen peroxide 1.2 mmol/L,pH=7.0,25 ℃,ρ(immobilized HRP)=0.60 μg/mL.

    3 結(jié)論

    1)利用自制層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅進(jìn)行了HRP固定化實(shí)驗(yàn)。紫外分析證明,層狀氫氧化氨基苯甲酸鋅能固定化HRP,在pH=8.0、HRP質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的條件下,飽和固載量、最大比活力分別為100 mg/g和60.27 U/mg。

    2)利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)做圖法測(cè)定了固定化HRP的動(dòng)力學(xué)參數(shù),Km,Kcat,X分別為3.23 mmol/L,42.5 s-1,57.5 U/mg。與游離HRP相比,固定化HRP的Km提高了44.2%,Kcat下降了74.0%,X值下降了74.4%。

    3)制備的固定化HRP具有較好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和重復(fù)利用性。在-10 ℃下儲(chǔ)存40 d 后,固定化HRP的活性為游離HRP的5.35倍。循環(huán)利用8次后,固定化HRP的活性保留率仍為79.6%。

    [1] Nalwa H S. Handbook of Nanostructured Materials and Nanotechnology[M]. New York: Academic Press,2000:259 - 276.

    [2] Geetanjali M,Barsha D,Sony P,et al. Antibacterial Actions of Silver Nanoparticles Incorporated Zn-Al Layered Double Hydroxide and Its Spinel[J]. J Environ Chem Eng,2013,1 (4):1124 - 1130.

    [3] Jun Zhu,Qiaoyun Huang,Massimo P,et al. Layered Double Hydroxides as Drug Carriers and for Controlled Release of Non-Steroidal Antiinflammatory Drugs(NSAIDs):A Review [J]. J Controlled Release,2013,169(1/2):28 - 39.

    [4] Ahmet N,Birgul Z K,Abidin T,et al. Layered Double Hydroxides with Interlayer Borate Anions:Acritical Evaluation of Synthesis Methodology and pH-Independent Orientations in Nano-Galleries[J] . Appl Clay Sci,2011,51(3):308 - 316.

    [5] Sandip M,Swagatika T,Tapswani P,et al. Removal Effici-Ency of Fluoride by Novel Mg-Cr-Cl Layered Double Hydroxide by Batch Process from Water[J]. J Environ Sci,2013,25(5):993 - 1000.

    [6] Wang Lingyun,Tong Dongshen,Zhao Lizhi,et al. Utilization of Alum Sludge for Producing Aluminum Hydroxide and Layered Double Hydroxide[J]. Ceram Int,2014,40(10):15503 - 15515.

    [7] Dunford H B. Horseradish Petoxidase:Structure and Kinetic Properties,Peroxidase in Chemistry and Biology[M]. Boca Raton:The Chemical Rubber Company Press,1991:1 - 24.

    [8] Uyama H,Takeya K,Hoshi N. Lipase-Catalyed Ringopening Polymerization of 12-Dodecanolide[J]. Macromolocules,1995,28(4):7046 - 7050.

    [9] Klibanov A M,Alberti B N. Morris E D,et al. Enzymatic Removal of Toxic Phenols and Anilines from Waste Waters[J]. J Appl Biochem,1980,2(5):414 - 421.

    [10] 牛顯春,周建敏,伍尚晃. 納米Fe3+/TiO2光催化降解含酚煉油廢水[J]. 石油化工,2009,38(11):1239 - 1244.

    [11] 王貴珍,陳玉紅,李永真,等. 介孔SBA-15分子篩對(duì)苯酚的吸附性能[J]. 石油化工,2012,41(6):704 - 708.

    [12] 張鋒,趙立芳. 微波-超聲波聯(lián)合再生活性炭及其用于處理含酚廢水[J]. 石油化工,2012,41(11):1312 - 1316.

    [13] 李文錦,席宏波,周岳溪,等. 苯酚生產(chǎn)廢水中苯系物及其衍生物的測(cè)定[J]. 石油化工,2013,42(6):557 - 562.

    [14] Le Thai-Hoang,Kim So Jeong,Bang Seung Hyuck,et al. Phenol Degradation Activity and Reusability of Corynebacterium Glutamicum Coated with NH2-Functionalized Silica-Encapsulated Fe3O4Nanoparticles[J]. Bioresour Technol,2012,104: 795 - 798.

    [15] Nicel J A,Wright H. A Model of Peroxidase Activity with Inhibition by Hydrogen Peroxide[J]. Enzyme Microb Technol,1997,2(4): 302 - 310.

    [16] Gomez J L,Bodalo A,Gomez E,et al. Immobilization of Peroxidases on Glass Beads:An Improved Alternative for Phenol Removal[J]. Enzyme Microb Technol,2006,39 (5): 1016 - 1022.

    [17] Azevedo A M,Vojinovic V,Cabral J M S,et al. Operational Stability of Immobilised Horseradish Peroxidase in Mini-Packed Bed Bioreactors[J]. J Mol Catal B:Enzym,2004,28(2):121 - 128.

    [18] Zhai Rui,Zhang Bing,Wan Yazhen,et al. Chitosan-Halloysite Hybrid-Nanotubes: Horseradish Peroxidase Immobilization and Applications in Phenol Removal[J]. Chem Eng J,2013,214(1):304 - 309.

    [19] Lai Yi-Chen,Lin Sung-Chyr. Application of Immobilize Horseradish Peroxidase for the Removal of p-Chlorophenol from Aqueous Solution[J]. Process Biochem,2005,40 (3/4):1167 - 1174.

    [20] Sepa N,Zhao Zhengyang,Antonio F P,et al. Immobilized Horseradish Peroxidase(I-HRP) as Biocatalyst for Oxidative Polymerization of 2,6-Dimethylphenol[J]. ACS Sustainable Chem Eng,2014,2(8):1947 - 1950.

    [21] Teng Zhanga,Xu Xiaoling,Jin Yining,et al. Immobilization of Horseradish Peroxidase(HRP) on Polyimidenanofibers Blending with Carbon Nanotubes[J]. J Mol Catal B:Enzym,2014,106:56 - 62.

    [22] Seyed F T,Khosro K,Salehe G,et al. Covalent Attachment of Cholesterol Oxidase and Horseradish Peroxidase on Perlite Through Silanization:Activity,Stability and co-Immobilization[J]. J Biotechnol,2007,131(2):111 - 120.

    [23] Gulay B,Senem K,Meltem Y,et al. Covalent Immobilization of Chloroperoxidase onto Magnetic Beads:Catalytic Properties and Stability[J]. Biochem Eng J,2008,38(2):180 - 188.

    [24] Topcular C,Ayhan H. Immobilisation of Horseradish Peroxidase onto Monodisperse Poly(Glycidyl Methacrylate) Microspheres[J]. J Biomater Sci Polym Ed,2007,18(5):595 - 607.

    [25] Bora U,Sharma P,Kumar S,et al. Photochemical Activation of a Polycarbonate Surface for Covalent Immobilization of a Protein Ligand[J]. Talanta,2006,70(3): 624 - 629.

    [26] Hou Xiaohui,Liu Bailing,Deng Xiaobo,et al. Covalent Immobilization of Glucose Oxidase onto Poly(Styrene-co-Glycidyl Methacrylate) Monodisperse Fluorescent Microspheres Synthesized by Dispersion Polymerization[J]. Anal Biochem,2007,368(1):100 - 110.

    [27] 張鋒. 納米ZnO固載辣根過(guò)氧化物酶及其降解酚類化合物研究[J]. 寶雞文理學(xué)院學(xué)報(bào),2010,30(2):28 - 32.

    [28] Zhang Feng,Zheng Bin,Zhang Jiali,et al. Horseradish Peroxidase Immobilized on Graphene Oxide: Physical Properties and Applications in Phenolic Compound Removal[J]. J Phys Chem C,2010,114(18): 8469 - 8473.

    (編輯 安 靜)

    Immobilization of Horseradish Peroxidase on Layered Zinc Aminobenzoate Hydroxide and Its Catalysis

    Zhang Feng,Wang Hui,Zhao Lifang
    (Shaanxi Key Laboratory of Phytochemistry,Department of Chemistry and Chemical Engineering,Baoji University of Arts and Sciences,Baoji Shaanxi 721013,China)

    The immobilization of horseradish peroxidase(HRP) on layered zinc aminobenzoate hydroxide support was conducted. The effects of the HRP mass concentration and pH on the immobilization were investigated by means of UV analysis. The kinetics constants of the HRP immobilization were determined by Lineweaver-Burk double-reciprocal plot method. The storage stability and reusability of the immobilized HRP were studied. The experiment results showed that the immobilized HRP on layered zinc aminobenzoate hydroxide with a maximum immobilization capacity of 100 mg/g and specific activity of 60.27 U/mg could be prepared under the optimal conditions of pH 8.0 and HRP mass concentration 1.0 mg/mL. The michaelis constant(Km),catalytic constant(Kcat) and enzyme activity (X ) of the immobilized HRP were 3.23 mmol/L,42.5 s-1and 57.5 U/mg,respectively. Compared with free enzyme,Kmof the immobilized enzyme increased by 44.2%,while its Kcatand X decreased by 74.0% and 74.4%,respectively. The activity of the immobilized enzyme was 5.35 times that of free enzyme after they were stored 40 d,and still reached 79.6% of its original activity after being reused eight times.

    layered zinc aminobenzoate hydroxide;enzyme catalysis;horseradish peroxidase;kinetics constant

    1000-8144(2015)03-0332-07

    TQ 033

    A

    2014-09-15;[修改稿日期] 2014-11-21。

    張鋒(1982—),男,陜西省寶雞市人,碩士,講師,電話 18791704159,電郵 jimmy0217@126.com。

    陜西省科技廳工業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2014K08-36); 寶雞市科技局項(xiàng)目(2013R7-4); 陜西省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(12JK0843);陜西省植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(14JS005, 12JS008); 寶雞文理學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目(ZK12033,ZK12032)。

    猜你喜歡
    體系
    TODGA-TBP-OK體系對(duì)Sr、Ba、Eu的萃取/反萃行為研究
    “三個(gè)體系”助力交通安全百日攻堅(jiān)戰(zhàn)
    杭州(2020年23期)2021-01-11 00:54:42
    構(gòu)建體系,舉一反三
    探索自由貿(mào)易賬戶體系創(chuàng)新應(yīng)用
    常熟:構(gòu)建新型分級(jí)診療體系
    如何建立長(zhǎng)期有效的培訓(xùn)體系
    E-MA-GMA改善PC/PBT共混體系相容性的研究
    汽車零部件(2014年5期)2014-11-11 12:24:28
    “曲線運(yùn)動(dòng)”知識(shí)體系和方法指導(dǎo)
    加強(qiáng)立法工作 完善治理體系
    浙江人大(2014年1期)2014-03-20 16:19:53
    日本終身學(xué)習(xí)體系構(gòu)建的保障及其啟示
    国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 水蜜桃什么品种好| 亚洲国产精品一区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 电影成人av| 午夜福利免费观看在线| 欧美变态另类bdsm刘玥| 99久久人妻综合| 又黄又粗又硬又大视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日韩三级视频一区二区三区| 97在线人人人人妻| 国产精品99久久99久久久不卡| 搡老乐熟女国产| 亚洲成国产人片在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产成人系列免费观看| 亚洲熟女毛片儿| 美国免费a级毛片| 国产高清国产精品国产三级| 91麻豆av在线| 99久久国产精品久久久| 丝袜美腿诱惑在线| 99精品欧美一区二区三区四区| 91字幕亚洲| 欧美人与性动交α欧美软件| av在线播放精品| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 美女大奶头黄色视频| videosex国产| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲欧美色中文字幕在线| 999久久久国产精品视频| 9热在线视频观看99| 男男h啪啪无遮挡| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 十分钟在线观看高清视频www| 欧美在线一区亚洲| 久久精品人人爽人人爽视色| 另类亚洲欧美激情| 精品人妻一区二区三区麻豆| 老司机靠b影院| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲色图综合在线观看| 国产高清videossex| 老司机午夜福利在线观看视频 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 欧美黑人精品巨大| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲国产精品999| 美女视频免费永久观看网站| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久久久久久久免费视频了| www.熟女人妻精品国产| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 免费不卡黄色视频| 日韩有码中文字幕| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 啪啪无遮挡十八禁网站| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久亚洲精品不卡| 一区福利在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 成年人黄色毛片网站| 国产成人精品无人区| 精品国产乱码久久久久久男人| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 另类亚洲欧美激情| avwww免费| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲全国av大片| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久国产精品影院| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 不卡一级毛片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 一级a爱视频在线免费观看| 91九色精品人成在线观看| 久久青草综合色| 日日夜夜操网爽| 一级毛片精品| 精品少妇久久久久久888优播| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲avbb在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 精品久久蜜臀av无| 久久久久国产一级毛片高清牌| 一本色道久久久久久精品综合| 中文字幕色久视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 各种免费的搞黄视频| 亚洲伊人久久精品综合| 国产麻豆69| 久久这里只有精品19| 少妇人妻久久综合中文| 最新在线观看一区二区三区| 成人国产av品久久久| 国产伦人伦偷精品视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 午夜福利影视在线免费观看| 超碰成人久久| 99国产精品一区二区三区| www日本在线高清视频| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 男女无遮挡免费网站观看| 国产主播在线观看一区二区| 日韩欧美一区视频在线观看| 久热这里只有精品99| kizo精华| 一二三四社区在线视频社区8| www.av在线官网国产| www.av在线官网国产| 色94色欧美一区二区| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久精品亚洲av国产电影网| 又大又爽又粗| 最新的欧美精品一区二区| 欧美日韩视频精品一区| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产成人av教育| 首页视频小说图片口味搜索| www.精华液| 又黄又粗又硬又大视频| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲av男天堂| 91大片在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产在线观看jvid| 成人免费观看视频高清| 男人添女人高潮全过程视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久久国产一区二区| 国产成人免费观看mmmm| 日本av手机在线免费观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 考比视频在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 久久久国产一区二区| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 动漫黄色视频在线观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 五月开心婷婷网| 亚洲av国产av综合av卡| 国产男人的电影天堂91| 在线观看舔阴道视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美av亚洲av综合av国产av| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 啦啦啦在线免费观看视频4| 午夜激情av网站| 欧美黑人精品巨大| 电影成人av| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲精品国产av成人精品| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲欧美激情在线| 亚洲国产日韩一区二区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 午夜激情久久久久久久| av不卡在线播放| 欧美 日韩 精品 国产| 久久毛片免费看一区二区三区| 免费观看人在逋| 一个人免费在线观看的高清视频 | 日韩制服骚丝袜av| 亚洲专区字幕在线| 精品亚洲成a人片在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 母亲3免费完整高清在线观看| 成年人黄色毛片网站| 伦理电影免费视频| 亚洲五月色婷婷综合| 久久亚洲精品不卡| 久久免费观看电影| 国产精品 欧美亚洲| 欧美日韩精品网址| 国产又爽黄色视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 国产黄色免费在线视频| 一级片'在线观看视频| 黄色怎么调成土黄色| 性色av一级| 午夜福利,免费看| 成在线人永久免费视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 精品亚洲成国产av| 高清视频免费观看一区二区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 婷婷成人精品国产| 日本91视频免费播放| 美女福利国产在线| 9热在线视频观看99| 国产在线观看jvid| 狠狠狠狠99中文字幕| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲国产精品一区三区| 欧美激情久久久久久爽电影 | 又紧又爽又黄一区二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 好男人电影高清在线观看| 搡老岳熟女国产| 高清视频免费观看一区二区| 国产免费福利视频在线观看| 免费观看a级毛片全部| 精品欧美一区二区三区在线| 淫妇啪啪啪对白视频 | 亚洲伊人色综图| 精品乱码久久久久久99久播| 精品免费久久久久久久清纯 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 在线观看免费视频网站a站| 大香蕉久久网| 丝袜人妻中文字幕| 中文字幕色久视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 水蜜桃什么品种好| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品九九99| 亚洲人成电影观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产精品一区二区免费欧美 | 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 在线观看免费午夜福利视频| 国产高清videossex| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 蜜桃国产av成人99| 国产精品国产av在线观看| av欧美777| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 满18在线观看网站| tocl精华| 黄色毛片三级朝国网站| 精品福利观看| 少妇精品久久久久久久| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲人成电影观看| 精品欧美一区二区三区在线| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲三区欧美一区| 午夜福利乱码中文字幕| 精品国产乱码久久久久久男人| 免费在线观看黄色视频的| 伦理电影免费视频| 色老头精品视频在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产在线视频一区二区| 亚洲精品自拍成人| 黄色片一级片一级黄色片| 青青草视频在线视频观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 男人操女人黄网站| cao死你这个sao货| 丝袜人妻中文字幕| 少妇的丰满在线观看| 亚洲国产欧美网| 老司机靠b影院| 蜜桃在线观看..| 成年美女黄网站色视频大全免费| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产日韩欧美亚洲二区| 日本黄色日本黄色录像| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产97色在线日韩免费| 国产男人的电影天堂91| 99九九在线精品视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美午夜高清在线| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲国产av影院在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 丝袜美足系列| 黄色 视频免费看| 午夜福利乱码中文字幕| 精品免费久久久久久久清纯 | 天天影视国产精品| 免费高清在线观看日韩| 亚洲人成电影免费在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 在线 av 中文字幕| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 黄色视频不卡| 91国产中文字幕| 男女国产视频网站| a级毛片黄视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 午夜福利在线免费观看网站| 久久九九热精品免费| 一级毛片电影观看| 亚洲专区字幕在线| 国产深夜福利视频在线观看| 久久久国产精品麻豆| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 一级毛片女人18水好多| 岛国在线观看网站| 一个人免费看片子| 久久久久精品人妻al黑| 国产一区二区三区av在线| www.熟女人妻精品国产| 老司机影院成人| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲精华国产精华精| 亚洲精品乱久久久久久| 热re99久久国产66热| 999久久久国产精品视频| www.av在线官网国产| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产精品免费大片| 咕卡用的链子| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品九九99| 久久香蕉激情| xxxhd国产人妻xxx| 成人av一区二区三区在线看 | 男女高潮啪啪啪动态图| 超碰成人久久| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 满18在线观看网站| 色综合欧美亚洲国产小说| 老司机影院成人| 国产xxxxx性猛交| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美日韩福利视频一区二区| 色视频在线一区二区三区| 真人做人爱边吃奶动态| 久久人人97超碰香蕉20202| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久精品亚洲av国产电影网| 大码成人一级视频| 美女国产高潮福利片在线看| 国产成人系列免费观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 一本色道久久久久久精品综合| 日韩免费高清中文字幕av| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 亚洲精品中文字幕一二三四区 | av网站在线播放免费| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲精品美女久久av网站| 波多野结衣一区麻豆| 国精品久久久久久国模美| 亚洲全国av大片| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久国产精品影院| 另类亚洲欧美激情| 嫁个100分男人电影在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲国产精品999| 波多野结衣一区麻豆| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲中文av在线| bbb黄色大片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲伊人色综图| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲avbb在线观看| 亚洲精品第二区| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 男男h啪啪无遮挡| 日本91视频免费播放| 欧美xxⅹ黑人| 午夜久久久在线观看| 日韩一区二区三区影片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产成人av教育| 国产成+人综合+亚洲专区| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美精品av麻豆av| 成人av一区二区三区在线看 | 男男h啪啪无遮挡| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲情色 制服丝袜| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久精品94久久精品| 欧美日韩黄片免| 久久女婷五月综合色啪小说| 少妇的丰满在线观看| 国产精品免费视频内射| 十八禁网站网址无遮挡| 老司机午夜十八禁免费视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 热99久久久久精品小说推荐| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 午夜影院在线不卡| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品国内亚洲2022精品成人 | 欧美xxⅹ黑人| 国产精品一区二区在线不卡| 中文字幕制服av| 黄频高清免费视频| 青春草亚洲视频在线观看| 老司机靠b影院| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲av电影在线进入| 亚洲国产中文字幕在线视频| 韩国高清视频一区二区三区| 午夜福利在线免费观看网站| 国产亚洲欧美精品永久| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产欧美亚洲国产| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 在线 av 中文字幕| 免费高清视频大片| 少妇的丰满在线观看| 欧美成人午夜精品| a级毛片a级免费在线| 午夜免费成人在线视频| 88av欧美| 99久久精品国产亚洲精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 熟女电影av网| 久久久久久大精品| 国产精品久久电影中文字幕| 一二三四在线观看免费中文在| 天堂√8在线中文| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 熟女电影av网| 亚洲性夜色夜夜综合| 正在播放国产对白刺激| 男人舔奶头视频| 老鸭窝网址在线观看| 免费观看精品视频网站| 国产三级在线视频| 一本久久中文字幕| 日日夜夜操网爽| 美女午夜性视频免费| 十八禁人妻一区二区| 色综合婷婷激情| 久久这里只有精品中国| 制服诱惑二区| 不卡av一区二区三区| 亚洲精品色激情综合| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产一区二区激情短视频| 在线看三级毛片| 午夜激情av网站| 国产精品av久久久久免费| 伦理电影免费视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 69av精品久久久久久| 成人一区二区视频在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 男插女下体视频免费在线播放| 韩国av一区二区三区四区| 一进一出好大好爽视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 麻豆成人av在线观看| av在线天堂中文字幕| 天堂影院成人在线观看| 国产三级在线视频| 欧美乱妇无乱码| 日韩精品中文字幕看吧| 国产黄a三级三级三级人| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国模一区二区三区四区视频 | 亚洲午夜理论影院| 1024香蕉在线观看| 精品久久蜜臀av无| 国产av在哪里看| 欧美成狂野欧美在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲黑人精品在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产午夜精品久久久久久| 观看免费一级毛片| 国产高清激情床上av| 国产97色在线日韩免费| 成人av一区二区三区在线看| 又大又爽又粗| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久中文字幕人妻熟女| 日日夜夜操网爽| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲 国产 在线| 两性夫妻黄色片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 中文字幕熟女人妻在线| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲精品一区av在线观看| 一级作爱视频免费观看| 熟女电影av网| 亚洲七黄色美女视频| 在线观看舔阴道视频| 十八禁网站免费在线| svipshipincom国产片| 此物有八面人人有两片| 国产成人影院久久av| 欧美激情久久久久久爽电影| av在线天堂中文字幕| 窝窝影院91人妻| 欧美色视频一区免费| 在线观看免费视频日本深夜| 久久久久久久精品吃奶| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 高清在线国产一区| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美3d第一页| 久久欧美精品欧美久久欧美| tocl精华| 亚洲中文字幕日韩| 中国美女看黄片| www日本在线高清视频| 听说在线观看完整版免费高清| 看免费av毛片| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久久国产一级毛片高清牌| av天堂在线播放| 久久九九热精品免费| 国内精品一区二区在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产av麻豆久久久久久久| 久久久久久久久久黄片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产真人三级小视频在线观看| 99热6这里只有精品| 一进一出抽搐gif免费好疼| 一本一本综合久久| 日本成人三级电影网站| 啪啪无遮挡十八禁网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产精品九九99| 国内精品久久久久精免费| 天堂动漫精品| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 1024香蕉在线观看| 久久伊人香网站| av中文乱码字幕在线| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 日韩欧美 国产精品| tocl精华| 国产一级毛片七仙女欲春2| 黄片大片在线免费观看| 女同久久另类99精品国产91| 国产精品久久视频播放| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲一码二码三码区别大吗| 不卡av一区二区三区| 午夜亚洲福利在线播放| 成人永久免费在线观看视频| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲av成人一区二区三| videosex国产| 一区二区三区国产精品乱码| 久久久久久国产a免费观看| 可以在线观看毛片的网站| 99在线人妻在线中文字幕| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 在线免费观看的www视频| 91大片在线观看| 久久中文看片网| 久久国产精品人妻蜜桃| 美女黄网站色视频| 国产精品一区二区免费欧美| 久久中文看片网| 日本一本二区三区精品| 国产精品一及| 久久国产精品人妻蜜桃| 在线免费观看的www视频| 亚洲人成网站高清观看| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国内精品久久久久精免费| 国产av不卡久久| 黄色毛片三级朝国网站| 露出奶头的视频| 无限看片的www在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久精品成人免费网站| 国产视频一区二区在线看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久精品综合一区二区三区| 波多野结衣高清作品|