哺乳仔豬PEDV與PCV2混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷和分析

胡玉立，彭 旺，李潤(rùn)成

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起豬的一種以腹瀉、嘔吐和脫水為特征的豬腸道傳染病。近幾年P(guān)ED在中國(guó)各大小規(guī)模豬場(chǎng)流行相當(dāng)嚴(yán)重[1-6]，誘發(fā)了大量仔豬腹瀉，并導(dǎo)致其大量死亡。本文對(duì)2013年8月～12月期間發(fā)生腹瀉的3個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)哺乳仔豬進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷，發(fā)現(xiàn)送檢的哺乳仔豬在感染流行性腹瀉病毒的同時(shí)，腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)也能檢測(cè)到2型圓環(huán)病毒，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 發(fā)病情況

1.1 豬場(chǎng)1

約500頭母豬的規(guī)模豬場(chǎng)，母豬未接種PEDV疫苗和PCV2疫苗。2013年8月哺乳仔豬出現(xiàn)水樣腹瀉，出生后2天即開(kāi)始發(fā)病，發(fā)病早期表現(xiàn)嘔吐，先嘔吐后腹瀉。7日齡以內(nèi)小豬死亡率達(dá)100%，7日齡以上哺乳仔豬死亡率相對(duì)較低，約20%左右。

1.2 豬場(chǎng)2

約300頭母豬的規(guī)模豬場(chǎng)，母豬于8、9月分別接種過(guò)1次PEDV滅活疫苗，沒(méi)有接種過(guò)PCV2疫苗。于2013年10月，出生后1～2天的小豬即開(kāi)始出現(xiàn)拉稀，先嘔吐后腹瀉。7日齡以內(nèi)小豬死亡率達(dá)100%，7日齡以上哺乳仔豬死亡率相對(duì)較低，約30%左右。

1.3 豬場(chǎng)3

約1 000頭母豬的新建規(guī)模豬場(chǎng)，場(chǎng)內(nèi)全部為初產(chǎn)母豬。母豬未接種過(guò)PEDV疫苗和PCV2疫苗。12月4號(hào)起全場(chǎng)哺乳仔豬及斷奶仔豬出現(xiàn)水樣腹瀉，有嘔吐現(xiàn)象，7日齡內(nèi)哺乳仔豬死亡率幾乎100%。場(chǎng)內(nèi)保育期也出現(xiàn)了腹瀉情況，但死亡率較低，幾天后即康復(fù)。

2 臨床癥狀及剖檢變化

3個(gè)豬場(chǎng)送檢的哺乳仔豬均表現(xiàn)出水樣腹瀉，有脫水跡象，且剖檢可見(jiàn)小豬胃內(nèi)充滿凝乳塊，腸道無(wú)內(nèi)容物，腸壁變薄，充滿氣體或液體。心、肺、肝、脾無(wú)明顯病變（見(jiàn)圖1～圖3）。

圖1 豬場(chǎng)1發(fā)病小豬臨床與解剖圖片

圖2 豬場(chǎng)2發(fā)病小豬臨床與解剖圖片

圖3 豬場(chǎng)3發(fā)病小豬臨床與解剖圖片

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 PEDV的RT-PCR檢測(cè)

3.1.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank登錄的PEDV基因序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增PEDV基因的引物。引物序列為PEDVFp，GGWGGKTTTTATTTKAARCCWGGTGG；PEDV-Rp，AAGGTAATAAGTACCCTCCTTATCG。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為477bp，退火溫度為65℃。引物由上海生物工程股份有限公司合成。

圖4 1號(hào)豬場(chǎng)PEDV RT-PCR結(jié)果（1、2、3、4：樣品，5：陰性對(duì)照 M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)）

圖5 2號(hào)豬場(chǎng)PEDV RT-PCR結(jié)果（1、2、3、4：樣品，5：陰性對(duì)照 M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)

圖6 3號(hào)豬場(chǎng)PEDV RT-PCR結(jié)果（1：陰性對(duì)照，2、3、4、5：樣品 M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)）

3.1.2 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

取發(fā)病小豬的空腸、回腸段粘膜和內(nèi)容物，采用常規(guī)方法提取基因組RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

3.1.3 PEDV基因的PCR擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模版，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增按常規(guī)方法進(jìn)行。結(jié)果見(jiàn)圖4-圖6。由圖可見(jiàn)在1號(hào)豬場(chǎng)4個(gè)樣品均擴(kuò)增出了約477bp大小的條帶，2號(hào)4個(gè)樣品中有2個(gè)樣品擴(kuò)增出了約477bp大小的條帶，3號(hào)豬場(chǎng)4個(gè)樣品均擴(kuò)增出了特異性的條帶。

圖7 1號(hào)豬場(chǎng)PCV2 PCR結(jié)果（1、2、3、4：樣品，5：陰性對(duì)照M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)）

圖8 2號(hào)豬場(chǎng)PCV2 PCR結(jié)果（1：陰性對(duì)照，2、3、4、5：樣品 M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)）

圖9 3號(hào)豬場(chǎng)PCV2 PCR結(jié)果（1、2、3、4：樣品，5：陰性對(duì)照 M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)）

3.2 豬圓環(huán)病毒的PCR檢測(cè)

采取發(fā)病小豬的腸系膜淋巴結(jié)，用常規(guī)方法提取基因組DNA。并以提取的基因組作為模版按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物資料見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]。PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖7-圖9。由圖可見(jiàn)在1號(hào)豬場(chǎng)4個(gè)樣品中有3個(gè)樣品擴(kuò)增出了明顯的約500bp左右預(yù)期大小的條帶，2號(hào)豬場(chǎng)4個(gè)樣品均擴(kuò)增出了約500bp左右預(yù)期大小的條帶，3號(hào)豬場(chǎng)4個(gè)樣品也均擴(kuò)增出了特異性的條帶。

4 小結(jié)與討論

近年來(lái)，PEDV已成為豬場(chǎng)小豬腹瀉的主要病原[1-6]。本文對(duì)2013年8～12月3個(gè)發(fā)生腹瀉豬場(chǎng)的哺乳仔豬進(jìn)行了PEDV檢測(cè)，結(jié)果1號(hào)豬場(chǎng)，3號(hào)豬場(chǎng)PEDV陽(yáng)性率為100%，2號(hào)豬場(chǎng)4份樣本有兩份樣本為PEDV陽(yáng)性。此外，本文還對(duì)3個(gè)豬場(chǎng)的小豬進(jìn)行了PCV2的PCR檢測(cè)，結(jié)果除1號(hào)豬場(chǎng)有1頭豬為PCV2陰性外，其他均為PCV2陽(yáng)性。其中3號(hào)豬場(chǎng)送檢小豬還進(jìn)行了豬瘟病毒、藍(lán)耳病毒、輪狀病毒、傳染性胃腸炎病毒以及偽狂犬病毒的檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。因此，檢測(cè)結(jié)果表明該3個(gè)豬場(chǎng)哺乳仔豬存在PEDV和PCV2共同感染。

雖然本文檢測(cè)豬場(chǎng)數(shù)量有限，但可以提示臨床上哺乳仔豬腹瀉病例存在PEDV和PCV2混合感染的情況。PCV2感染的主要特征是外周血和免疫器官淋巴細(xì)胞的大量缺失及單核細(xì)胞的浸潤(rùn),使感染仔豬出現(xiàn)免疫抑制[8]。PCV2對(duì)豬群的感染還可能存在持續(xù)性感染趨勢(shì)，當(dāng)生豬體質(zhì)下降或出現(xiàn)應(yīng)激時(shí)，PCV2在病豬體內(nèi)復(fù)制增加，對(duì)生豬機(jī)體的負(fù)面影響也隨之增強(qiáng)。2009年司興奎等對(duì)豬進(jìn)行人工感染PCV2并檢測(cè)病毒血癥，發(fā)現(xiàn)在感染后的42天仍能在血液中檢測(cè)到PCV2[9]，說(shuō)明圓環(huán)病毒感染仔豬后帶毒時(shí)間較長(zhǎng)，可出現(xiàn)低抗體水平與病毒同時(shí)存在的現(xiàn)象。因此，PCV2的感染完全有可能影響小豬感染PEDV后的結(jié)果。2006年K.Jung等[10]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明PCV2陽(yáng)性母豬所產(chǎn)仔豬感染PEDV后，PEDV陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量顯著高于PCV2陰性母豬所產(chǎn)仔豬，表明PCV2對(duì)PEDV的復(fù)制有直接影響，PCV2和PEDV之間可能發(fā)生協(xié)同作用，經(jīng)胎盤(pán)感染PCV2顯著影響PEDV疾病的臨床進(jìn)程，他們認(rèn)為由于臨床上PCV2共感染的存在，豬場(chǎng)發(fā)生PEDV感染后，采用返飼并不完全科學(xué)。有可能擴(kuò)大圓環(huán)病毒在豬群的傳播，影響疾病控制的效果。

當(dāng)前，關(guān)于哺乳仔豬PEDV感染的防控，筆者認(rèn)為，最主要是做好四點(diǎn)：（1）做好接產(chǎn)工作，讓哺乳仔豬及時(shí)吃上初乳的同時(shí)不受到絲毫寒冷的侵襲；（2）落實(shí)好產(chǎn)房的全進(jìn)全出制度，搞好母豬進(jìn)產(chǎn)房前的消毒以及母豬產(chǎn)前體表、欄舍消毒，產(chǎn)中乳房消毒、產(chǎn)后欄舍消毒，及時(shí)清除或減少可能侵襲哺乳仔豬的病原；（3）搞好綜合管理，整體上提高母豬及哺乳仔豬仔豬的健康水平，增強(qiáng)抗病能力；（4）選擇好的PEDV以及PCV2疫苗給母豬在產(chǎn)前進(jìn)行免疫接種。

[1]陳溥言.當(dāng)前我國(guó)豬場(chǎng)流行疾病的防控策略 [J].北方牧業(yè),2013,(18):15-16.

[2]徐國(guó)棟.仔豬流行性腹瀉流行現(xiàn)狀及免疫探究[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志,2013,(4):51-55.

[3]蔡汝健，張樂(lè)宜，宋長(zhǎng)緒.2010—2013年華南地區(qū)豬流行性腹瀉病流行情況調(diào)查及防控效果[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,(11):104-105.

[4]楊漢春.我國(guó)新發(fā)豬病的流行現(xiàn)狀與防控的科學(xué)問(wèn)題[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊.2012(02):22-27.

[5]韓慶彥，蘭喜，周峰，等.2011～2012年豬腹瀉疫情中6種病毒在乳豬腸道的感染檢測(cè)[J].國(guó)外畜牧學(xué)(豬與禽),2012(09):62-63.

[6]黃毓茂.當(dāng)前豬病毒性腹瀉流行特點(diǎn)與防控建議[J].中國(guó)豬業(yè),2012(11):21-22.

[7]侯強(qiáng)紅，余興龍，李微，等.豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白部分基因序列與大腸桿菌LTB成熟肽基因的融合表達(dá)及免疫原性研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào).2007,(11):847-851.

[8]華利忠.豬圓環(huán)病毒2型誘導(dǎo)仔豬淋巴細(xì)胞凋亡途徑的研究[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[9]司興奎，郭鑫，楊漢春.豬圓環(huán)病毒2型感染后血清抗體及組織中病毒含量的動(dòng)態(tài)變化 [J].中國(guó)獸醫(yī)雜志.2009,(7):24-26.

[10]Jung K,Kim J,Ha Y,et al.The effects of transplacental porcine circovirus type 2 infection on porcine epidemic diarrhoea virus-induced enteritis in preweaning piglets[J].The Veterinary Journal.2006,171(3):445-450.