高效液相色譜法測(cè)定通塞益腦口服液中α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚的含量

喬立業(yè) 巖林蘋 汪 玥 賈 佳 蘇 華 任海祥

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，南京 210002

通塞益腦口服液是南京軍區(qū)南京總醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）的院內(nèi)制劑，能夠活血通絡(luò)，豁痰開竅，是由石菖蒲、地龍、川芎、延胡索、澤瀉和雞血藤共6味藥材組成的復(fù)方制劑，用于治療腦梗死所致的偏癱無力、口眼歪斜、記憶力減退等[1]，經(jīng)我院多年臨床研究，顯示其療效突出。該方中川芎為君藥，行氣活血；臣藥石菖蒲能夠化濕和胃、開竅豁痰、醒神益智[2]，與川芎配伍，增強(qiáng)了其行氣開郁的作用。石菖蒲中有效成分揮發(fā)油的地位頗為重要，通過對(duì)該藥的揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析，鑒定出其中39個(gè)成分，約占揮發(fā)油總量的90%以上，主要包括α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚、甲基異丁香酚等[3-5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，α-細(xì)辛醚能顯著改善模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，亦能改善大鼠缺血再灌注所致的腦水腫，提高小鼠血腦通透性和耐缺氧能力；α-細(xì)辛醚能抑制乙酰膽堿酯酶，提高乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)的水平，提示其可能具有治療老年癡呆和益智作用的機(jī)制[6-9]。本研究重點(diǎn)對(duì)α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚進(jìn)行質(zhì)量控制，以期達(dá)到良好的結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），AE240電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），F(xiàn)A1604S分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

α-細(xì)辛醚對(duì)照品（100298-201203），β-細(xì)辛醚對(duì)照品（Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度 70.9%，C10301000），通塞益腦口服液[規(guī)格：10 mL/瓶，醫(yī)院制劑文號(hào)：南制字（2011）F01015]，石菖蒲（1 g/瓶，中國(guó)食品藥品檢定研究院，121098-201105），磷酸（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司），甲醇（色譜純，美國(guó)TIEDA），水為自制純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Lichrospher-C18（4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05%磷酸溶液（54∶46）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：257 nm；柱溫：30℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

2.2.1.1 α-細(xì)辛醚對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 稱取α-細(xì)辛醚對(duì)照品12.48 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成124.8μg/mL的α-細(xì)辛醚對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.1.2 β-細(xì)辛醚對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 稱取β-細(xì)辛醚對(duì)照品4.64 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成65.795μg/mL的β-細(xì)辛醚對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取通塞益腦口服液5支，置于燒杯中，混勻，精密吸取5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液

按處方量稱取不含石菖蒲的其他藥味，按生產(chǎn)工藝制備，得陰性樣品，并依“2.2.2”項(xiàng)中供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20μL注入色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚的保留時(shí)間分別約為30、39 min，陰性樣品對(duì)測(cè)定無干擾。見圖1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.3.1 α-細(xì)辛醚線標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 高效液相色譜圖

分別精密吸取α-細(xì)辛醚對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于 100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得濃度分別為 1.248、2.496、3.744、4.992、6.240μg/mL的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定其峰面積。以各對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=85 526X-1.0581，r=0.9999（n=5）。 表明 α-細(xì)辛醚在 1.248～6.240 μg/mL內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 β-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密吸取 β-細(xì)辛醚儲(chǔ)備液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度 ， 得 濃 度 分 別 為 2.632、5.264、7.896、10.528、13.159μg/mL的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定其峰面積。以各對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=41 727X-0.0433，r=0.9999（n=5）。 表明 β-細(xì)辛醚的濃度在 2.632～13.159μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)中的 α-細(xì)辛醚和 β-細(xì)辛醚對(duì)照品溶液各 1 份（3.744、7.896 μg/mL），重復(fù)進(jìn)樣 5 次，記錄色譜峰面積，測(cè)得α-細(xì)辛醚RSD為0.26%，β-細(xì)辛醚峰面積的RSD為0.26%。結(jié)果表明該方法的精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批（批號(hào)：130726）樣品 5 份，按“2.2.2”項(xiàng)中方法制備供試液，依法測(cè)定，結(jié)果α-細(xì)辛醚平均含量為3.28μg/mL，β-細(xì)辛醚平均含量為15.82μg/mL，α-細(xì)辛醚RSD為0.67%，β-細(xì)辛醚RSD為2.37%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批（批號(hào)：130726）供試品溶液，分別于0、1、2、4、8 h 時(shí)進(jìn)樣 20 μL， 測(cè)得 α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚峰面積的 RSD 分別為 0.32%（n=5）、0.31%（n=5）。表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

2.7.1 α-細(xì)辛醚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

精密吸取已知含量（批號(hào)：130726，α-細(xì)辛醚含量為3.28μg/mL）的樣品6份，每份2.5 mL，置于10 mL量瓶中，分別精密加入α-細(xì)辛醚儲(chǔ)備液0.1 mL，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99.07%，RSD為2.15%。見表1。

表1 α-細(xì)辛醚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.7.2 β-細(xì)辛醚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

精密吸取已知含量（批號(hào)：130726，β-細(xì)辛醚含量為15.82μg/mL）的樣品6份，每份2.5 mL，置于10 mL量瓶中，分別精密加入β-細(xì)辛醚儲(chǔ)備液0.5 mL，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為101.94%，RSD為2.83%。見表2。

表2 β-細(xì)辛醚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.8 含量測(cè)定

取通塞益腦口服液3個(gè)批次，按“2.2”項(xiàng)中方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算含量，具體結(jié)果見表3。綜合3批樣品測(cè)定結(jié)果，確定本品每瓶含揮發(fā)油以α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚總量計(jì)不得少于 100 μg（10 mL/瓶）。

表3 樣品中 α-細(xì)辛醚和 β-細(xì)辛醚的含量測(cè)定（n=3）

2.9 薄層色譜鑒別

2.9.1 色譜條件

以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（12∶1）為展開劑；以5%磷鉬酸乙醇溶液為顯色劑；105℃加熱約5 min至斑點(diǎn)顯色清晰。

2.9.2 溶液的制備

取本品50 mL，用石油醚（60~90℃）振搖提取3次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取石菖蒲對(duì)照藥材1 g，研碎， 加石油醚 （60~90℃）50 mL室溫超聲20 min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。按處方及制法，制成缺石菖蒲陰性對(duì)照樣品，取相當(dāng)于供試品的量，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.9.3 陰性干擾試驗(yàn)

3個(gè)批次供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而石菖蒲陰性對(duì)照色譜相應(yīng)位置無此斑點(diǎn)，證明陰性對(duì)照溶液對(duì)鑒別無干擾，結(jié)果見圖2。

圖2 石菖蒲的TLC圖譜

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，嘗試乙腈-0.05%磷酸溶液（40∶60）、乙腈-1%醋酸溶液（50∶50）等流動(dòng)相分離細(xì)辛醚 ，但因?yàn)橹兴帍?fù)方制劑的成分復(fù)雜，個(gè)體差異大，故最終采用甲醇-0.05%磷酸溶液（54∶46），既保證了完好的分離度，又不至于分析時(shí)間太長(zhǎng)。

3.2 指標(biāo)成分的選擇

吳啟端等[13]經(jīng)研究35份石菖蒲揮發(fā)油樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有成分相對(duì)百分含量中β-細(xì)辛醚均值為64.425%，α-細(xì)辛醚均值為11.680%，二者占總量的81.777%，是石菖蒲揮發(fā)油發(fā)揮藥效的重要指標(biāo)成分。目前國(guó)內(nèi)無α-細(xì)辛醚（β-細(xì)辛醚）標(biāo)準(zhǔn)品，為國(guó)外購進(jìn)[14-15]，純度較低，需低溫保存避光，給操作帶來一定難度。β-細(xì)辛醚對(duì)照品色譜圖顯示含β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚兩種成分，因此文中兩個(gè)對(duì)照品需分別進(jìn)樣以免干擾。

3.3 穩(wěn)定性考察

經(jīng)過多批次的考察，本研究發(fā)現(xiàn)通塞益腦口服液中細(xì)辛醚的含量不一，可見石菖蒲藥材質(zhì)量差異較大[15]，故必須建立完整的半成品檢驗(yàn)制度，對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測(cè)，使其保持在一個(gè)良好的水平。而初步的長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，由于揮發(fā)油的特殊性，其在制劑中的含量下降很快，分析可能是其易揮發(fā)或者多種成分互相轉(zhuǎn)化等緣故。我們將進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)，找出具體原因。

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