甲維鹽脅迫對(duì)西花薊馬能源物質(zhì)的影響*

曹 宇，劉 燕 ，楊文佳，孟永祿 ，王麗娟，曾 力，李 燦

(貴陽學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院//有害生物控制與資源利用貴州省高校特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550005)

西花薊馬Frankliniella occidentalis Pergande是一種世界范圍內(nèi)的檢疫性害蟲，受到各國學(xué)者的廣泛關(guān)注［1－3］。該蟲世代短、繁殖快，在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)上往往呈暴發(fā)性危害，因此，長期以來其防治主要依賴化學(xué)藥劑［4］。隨著殺蟲劑的廣泛應(yīng)用，西花薊馬的抗藥性問題逐漸成為研究熱點(diǎn)［5－7］。許多研究從谷胱甘肽 S－轉(zhuǎn)移酶 (glutathione S－transferase，GST)、羧酸酯酶 (carboxylesterase，CarE)、乙酰膽堿酯酶 (acetylcholineesterase，AChE)等不同的靶標(biāo)酶，探討了西花薊馬的抗藥性的形成機(jī)制［4，8－10］，但目前鮮有關(guān)于西花薊馬能源物質(zhì)變化應(yīng)對(duì)化學(xué)藥劑脅迫的研究。

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽 (以下簡(jiǎn)稱甲維鹽)屬于阿維菌素類化合物，在西花薊馬防治上有較多應(yīng)用，已有研究表明西花薊馬甲維鹽抗性種群體內(nèi)的多功能氧化酶細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶和羧酸酯酶的活性均顯著高于敏感種群［11］，但尚無甲維鹽作用下，西花薊馬體內(nèi)能源物質(zhì)變化的研究。糖類、脂肪與蛋白質(zhì)等能源物質(zhì)之間可發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響昆蟲對(duì)周圍不良因子的忍耐能力［12］。相 關(guān) 研 究 表 明， 嗜 卷 書 虱 Liposcelis bostrychophilus和嗜蟲書虱Liposcelis entomophila體內(nèi)多糖、可溶性蛋白質(zhì)及甘油三酯的不同代謝，可應(yīng)對(duì)不同的化學(xué)藥劑脅迫［13］，在大豆蚜Aphis glycines上也有類似報(bào)道［14］;嗜卷書虱對(duì)CO2的抗性水平與其對(duì)甘油三酯的利用率呈正相關(guān)［15］;而高低溫逆境脅迫下，昆蟲體內(nèi)的能源物質(zhì)也具有不同程度的變化，以適應(yīng)逆境［16］。

因此，為在一定程度上探討甲維鹽對(duì)西花薊馬的毒力機(jī)制及害蟲的抗性機(jī)制，為甲維鹽西花薊馬防治的抗性風(fēng)險(xiǎn)及可持續(xù)控制探討提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本文測(cè)定了甲維鹽對(duì)西花薊馬的室內(nèi)毒力作用，其LC50短時(shí)脅迫下西花薊馬能源物質(zhì) (可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脂肪含量)的變化，及LC50致死作用下各能源物質(zhì)的利用率。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

生物源藥劑:w=2.5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽WG(有效成分甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽)，上海禾本藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 供試?yán)ハx

西花薊馬采自貴州省貴陽市白云區(qū)玫瑰園，室內(nèi) (25±1)℃、相對(duì)濕度 (70±5)%條件下，在養(yǎng)蟲盒中用切花月季飼養(yǎng)建立種群，以二齡若蟲和成蟲為供試蟲態(tài)。

1.3 主要試劑及儀器設(shè)備

蒽酮 (Anthrone)為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;考馬斯亮藍(lán)G－250(Coomassie brilliantblue G－250)為Sigma公司產(chǎn)品;牛血清白蛋白 (ABS，Albumin bovine serum)為Sigma公司產(chǎn)品;高速冷凍離心機(jī) (Allegra X－30 Series Centrifuges)，Beckman Coulter公司生產(chǎn);754PC紫外－可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司生產(chǎn);自動(dòng)雙純水系統(tǒng) (KL－RO－20)，唐氏康寧科技發(fā)展有限公司生產(chǎn);ME36S微量天平 (0.001 mg)，賽多利斯科學(xué)儀器 (北京)有限公司生產(chǎn)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 昆蟲毒力測(cè)定 試驗(yàn)采用浸葉法，參照王健立和鄭長英的方法［17］。將供試藥劑在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上用清水按比例稀釋成5個(gè)梯度質(zhì)量濃度。取生長良好、形態(tài)大小一致的切花月季花瓣，將花瓣放進(jìn)盛有藥液、容積為500 mL的浸葉盒中，以藥液浸葉10 s，取出風(fēng)干。將10片花瓣放入150 mL的塑料杯中，用吸蟲器移入60頭西花薊馬，用保鮮膜將塑料杯封口，扎眼通風(fēng)置于溫度為 (25±1)℃、相對(duì)濕度 (70±5)%的氣候箱中 (RXZ系列多段可編程智能人工氣候箱，寧波江南儀器廠生產(chǎn))，48 h后觀察西花薊馬的死亡情況，以用毛筆輕觸后西花薊馬不能爬行為標(biāo)準(zhǔn)判定是否死亡。重復(fù)3次，以清水處理作為空白對(duì)照，以Abbott公式求得校正死亡率［18］。

1.4.2 LC50藥劑脅迫處理

1)短時(shí)脅迫 根據(jù)毒力曲線分別求得成蟲、二齡若蟲的LC50值，采用浸葉法，分別以各自甲維鹽LC50對(duì)西花薊馬兩種蟲態(tài)脅迫2，4，6和8 h，每處理供試?yán)ハx為100頭，脅迫后選取活蟲50頭，測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖的含量;脂肪含量測(cè)定時(shí)，每脅迫處理供試?yán)ハx150頭，脅迫后選取120頭活蟲測(cè)定其含量。試驗(yàn)以清水處理作為空白對(duì)照。重復(fù)3次。

2)致死脅迫 供試?yán)ハx各為60頭，甲維鹽LC50脅迫至所有西花薊馬死亡，收集死亡昆蟲50頭，測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖的含量;供試?yán)ハx150頭脅迫至全部死亡，收集死亡昆蟲120頭測(cè)定脂肪含量。試驗(yàn)以清水處理作為空白對(duì)照。重復(fù)3次。

以室內(nèi)切花月季上自然生長的西花薊馬能源物質(zhì)作為參照，能源物質(zhì)利用率計(jì)算公式為［15］:

1.4.3 能源物質(zhì)含量測(cè)定

1)可溶性蛋白質(zhì) 參考Bradford［19］、程偉霞等［13］的考馬斯亮藍(lán)G－250法。挑取藥劑作用后的西花薊馬50頭，加入pH 7.0、0.04 mol/L的磷酸緩沖液2 mL于冰水浴中勻漿，勻漿液于10000 r/min、4℃離心15 min，取其上清液加入w=1%考馬斯亮藍(lán)G－250反應(yīng)，在595 nm處測(cè)定其A值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)換成μg/頭。標(biāo)準(zhǔn)曲線利用牛血清白蛋白制作。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2)可溶性糖 采用王紅等［14］的方法，取甲維鹽處理后的50頭，加w=30%KOH溶液1 mL研磨，沸水浴30 min，加入3 mL無水乙醇，混勻，4500 r/min離心 5 min，取上清液，加 3 mL 0.6 mol/L鹽酸溶液，沸水浴2 h，過濾，加入5 mL蒽酮試劑，混勻。沸水浴加熱10 min，取出后在自來水中冷卻20 min，于620 nm處測(cè)定A值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)換成μg/頭。標(biāo)準(zhǔn)曲線利用葡萄糖制作。試驗(yàn)重復(fù)3次。

3)脂肪 參照Colinet等［20］的方法，將藥劑處理后的西花薊馬120頭置于60℃恒溫培養(yǎng)箱中干燥48 h后稱量蟲體干質(zhì)量(dry mass，DM)。取干燥后的昆蟲于玻璃勻漿器中加入6 mL氯仿和甲醇提取液 (V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1)研磨勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管中以4500 r/min離心。轉(zhuǎn)移上清，沉淀中再加入氯仿和甲醇提取液，再次離心。轉(zhuǎn)移上清后剩余沉淀在60℃恒溫培養(yǎng)箱中干燥24 h至恒質(zhì)量 (lean dry mass，LDM)。則脂肪含量(lipid content，LC)=DM－LDM。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 18.0軟件處理西花薊馬的死亡率、存活率，擬合甲維鹽作用下西花薊馬成蟲、二齡若蟲的毒力回歸方程，采用Duncan氏新復(fù)極差檢測(cè)法比較不同處理下，西花薊馬可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脂肪含量的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲維鹽對(duì)西花薊馬的毒力作用

甲維鹽對(duì)西花薊馬成蟲和二齡若蟲具有不同的毒力作用，毒力回歸方程如表所示 (表1)。成蟲和二齡若蟲的LC50分別為1.11和0.62 mg/L，說明甲維鹽對(duì)西花薊馬二齡若蟲的控制效果較好。

2.2 LC50 質(zhì)量濃度脅迫對(duì)西花薊馬能源物質(zhì)的影響

2.2.1 LC50脅迫對(duì)西花薊馬成蟲能源物質(zhì)的影響西花薊馬成蟲在其LC50(1.11 mg/L)脅迫不同時(shí)間后，其能源物質(zhì)含量有不同的變化 (表2)。對(duì)照組，西花薊馬成蟲自然種群的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脂肪的含量分別為 18.44，7.67和12.44 μg/頭。相對(duì)于對(duì)照，脅迫2和6 h后，可溶性蛋白質(zhì)含量顯著升高，分別為20.85和18.89 μg/頭;脅迫4和8 h后，其含量則顯著降低，分別為17.23 和 14.44 μg/頭?？扇苄蕴窃诿{迫 2 h后，含量顯著降低為6.04 μg/頭，脅迫4和6 h時(shí)后的含量無顯著差異，但兩者的含量顯著高于對(duì)照，分別為8.84和8.93 μg/頭;脅迫8 h后，可溶性糖的含量降到最低，為5.12 μg/頭。脅迫2 h后，脂肪含量有顯著上升到12.66 μg/頭，4 h后則進(jìn)一步上升為13.75 μg/頭，脅迫6和8 h后，其含量顯著下降，分別為11.89和11.36 μg/頭。

表1 甲維鹽對(duì)西花薊馬的室內(nèi)毒力Table 1 The toxicity of Emamectin benzoate to F.occidentalis

表2 西花薊馬成蟲能源物質(zhì)含量測(cè)定1)Table 2 The content of energy source in F.occidentalis adult

2.2.2 LC50脅迫對(duì)西花薊馬若蟲能源物質(zhì)的影響西花薊馬二齡若蟲在其LC50(0.62 mg/L)脅迫不同時(shí)間后，其能源物質(zhì)含量也有不同的變化(表3)。對(duì)照組，西花薊馬二齡若蟲可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脂肪的含量分別為14.58，5.26和8.27 μg/頭。在脅迫2，4和 6 h后，可溶性蛋白質(zhì)的含量都表現(xiàn)為升高，但與對(duì)照無顯著差異，脅迫8 h后，顯著降低為12.07 μg/頭。相對(duì)于對(duì)照，可溶性糖的含量脅迫不同時(shí)間后都降低，其中2 h(4.86 μg/頭)和 4 h(4.83 μg/頭)之間無顯著差異，但顯著低于對(duì)照，6 h(5.23 μg/頭)和8 h(5.19 μg/頭)的含量與對(duì)照均無顯著差異。脅迫2 h下，脂肪含量降低為8.23 μg/頭，4 h后則升高到8.29 μg/頭，但兩者與對(duì)照均無顯著差異;6 h下，脂肪含量降到最低，為8.06 μg/頭，顯著低于對(duì)照;8 h后略有上升，為8.20 μg/頭，但與對(duì)照無顯著差異。

表3 西花薊馬二齡若蟲能源物質(zhì)含量測(cè)定1)Table 3 The content of energy source in F.occidentalis 2nd instar

2.3 LC50 濃度致死下西花薊馬能源物質(zhì)利用率

2.3.1 不同能源物質(zhì)利用率比較 西花薊馬成蟲在其LC50的甲維鹽致死下，對(duì)可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脂肪三種能源物質(zhì)的利用率存在顯著差異(圖 1)。其對(duì)可溶性糖的利用率最高，為74.12%;其次為可溶性蛋白質(zhì)，為58.10%;最低為脂肪，為42.13%。西花薊馬二齡若蟲在其LC50的藥劑致死下，對(duì)三種能源物質(zhì)的利用關(guān)系與成蟲相似 (圖2)，為可溶性糖 (64.01%)＞ 可溶性蛋白質(zhì) (48.12%)＞ 脂肪 (36.48%)，且差異顯著。

不同小寫字母表示可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脂肪的利用率差異顯著 (P＜0.05;Duncan氏新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)法)

2.3.2 不同蟲態(tài)能源物質(zhì)利用率比較 西花薊馬成蟲和二齡若蟲在各自LC50的藥劑致死下，兩者對(duì)于可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脂肪的利用率均差異顯著 (圖3)，但無論何種能源物質(zhì)，其成蟲的利用率均顯著高于二齡若蟲，說明在甲維鹽脅迫致死過程中，成蟲具有更高的耗能量。

圖1 西花薊馬成蟲能源物質(zhì)利用率Fig.1 The utilization rate of energy source in F.occidentalis adult

圖2 西花薊馬二齡若蟲能源物質(zhì)利用率Fig.2 The utilization rate of energy source in F.occidentalis 2nd instar

圖3 西花薊馬成蟲與二齡若蟲能源物質(zhì)利用率比較Fig.3 The difference of energy source utilization between F.occidentalis adult and 2nd instar

不同小寫字母表示可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脂肪的利用率在西花薊馬成蟲和二齡若蟲之間經(jīng)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)差異顯著

3 討論

甲維鹽作用下的西花薊馬成蟲，不同研究有不同的 LC50值，如 0.32 mg/L［21］、7.35 mg/L［11］，與本文研究結(jié)果也存在不同程度的差異，這可能與試驗(yàn)方法、試驗(yàn)條件及甲維鹽的原藥濃度差異相關(guān)。另外，本文發(fā)現(xiàn)甲維鹽對(duì)西花薊馬成蟲的LC50值高于二齡若蟲，與張安盛等［21］的研究結(jié)論一致，說明西花薊馬成蟲和若蟲對(duì)于藥劑的敏感性不同，但其對(duì)藥劑耐受機(jī)制的差異性需進(jìn)一步探討。除此之外，西花薊馬還具有卵、一齡若蟲、預(yù)蛹及蛹期等發(fā)育階段，甲維鹽對(duì)其的毒力作用如何，需進(jìn)一步研究，根據(jù)不同階段施以相應(yīng)的防治濃度，以達(dá)到對(duì)西花薊馬的有效防治。

西花薊馬對(duì)氨基甲酸酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗性時(shí)，通常伴隨有酯酶和谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶活性升高，并且在同類殺蟲劑之間常存在交互抗性［9－10］;王圣印等［11］進(jìn)一步證實(shí)，西花薊馬甲維鹽抗性種群的羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶及O－脫甲基酶的活性均顯著高于敏感種群，因此，西花薊馬對(duì)甲維鹽的抗性與其相關(guān)的解毒酶系統(tǒng)密切相關(guān)，但目前鮮有關(guān)于甲維鹽作用下，西花薊馬能源物質(zhì)變化的報(bào)道。本文研究表明，在甲維鹽LC50脅迫下，西花薊馬成蟲體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脂肪在作用不同時(shí)間后，均伴有顯著的升高及降低;而二齡若蟲則表現(xiàn)較為緩和，多數(shù)情況下并無顯著差異。因此，甲維鹽LC50短時(shí)脅迫下，西花薊馬成蟲與若蟲能源物質(zhì)不同的應(yīng)激反應(yīng)，可能與其不同的耐藥性有關(guān)，導(dǎo)致西花薊馬成蟲的LC50值高于若蟲。同時(shí)在其LC50致死下，西花薊馬對(duì)三種能源物質(zhì)的利用率表現(xiàn)出顯著差異性，其成蟲和二齡若蟲對(duì)三種能源物質(zhì)的利用關(guān)系均為可溶性糖＞可溶性蛋白質(zhì)＞脂肪，因此，西花薊馬對(duì)能源物質(zhì)的此利用關(guān)系，可能利于其應(yīng)對(duì)甲維鹽脅迫及相關(guān)抗藥性的形成。相似的研究表明，嗜卷書虱和嗜蟲書虱在丁硫克百威及毒死蜱脅迫下，多糖和可溶性蛋白質(zhì)是其應(yīng)對(duì)逆境的主要能源物質(zhì)，造成了甘油三酯的積累，利于其抗藥性的形成［13］。但在氣調(diào)脅迫下，甘油三酯則是嗜卷書虱應(yīng)對(duì)高濃度CO2脅迫的主要能源物質(zhì)，對(duì)其較高的利用率是嗜卷書虱對(duì)CO2脅迫形成抗性的重要因素［15］。而在高低溫脅迫下，昆蟲的能源物質(zhì)也有不同的表現(xiàn)［16］，說明昆蟲的能源物質(zhì)具有不同的變化以應(yīng)對(duì)不同的逆境脅迫，但其對(duì)各種能源物質(zhì)的利用機(jī)制需進(jìn)一步研究。另外，本文中無論何種能源物質(zhì)，西花薊馬成蟲的利用率均顯著高于若蟲，這可能也是西花薊馬成蟲對(duì)甲維鹽具有較高較高耐受力的原因。

盡管甲維鹽LC50致死作用下，西花薊馬成蟲和二齡若蟲對(duì)三種能源物質(zhì)具有相似的利用關(guān)系，但其短時(shí)脅迫下，成蟲體內(nèi)能源物質(zhì)均伴有間斷的顯著升高，若蟲并無顯著的波動(dòng)。因此，短時(shí)脅迫下，西花薊馬成蟲相關(guān)能源物質(zhì)的顯著升高，可能對(duì)其生殖力的提高有促進(jìn)作用，這在大豆蚜、褐飛虱 Nilaparvata lugens 等害蟲上有類似報(bào)道［22－23］。作為r類對(duì)策的害蟲—西花薊馬來說［1］，若短時(shí)藥劑脅迫或長時(shí)藥劑防治并未致死的情況下，西花薊馬利用能源物質(zhì)的升高來提高生殖力應(yīng)對(duì)逆境脅迫，理所當(dāng)然，這也可在一定程度上為田間化學(xué)防治西花薊馬引起的再猖獗現(xiàn)象提供一種新的解釋。當(dāng)然，本文僅測(cè)定了西花薊馬部分能源物質(zhì)，其更多的能源物質(zhì)及相關(guān)的生理生化測(cè)定需要進(jìn)行，以闡明甲維鹽的控制機(jī)制及西花薊馬的應(yīng)對(duì)機(jī)制。

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