兩株長白山地區(qū)低溫纖維素降解真菌的篩選鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化*

勾長龍，王雨瓊，2，王 巍，趙晗旭，婁玉杰，2，高云航

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林長春130118)

纖維素類物質(zhì)是自然界中最豐富的一類可再生資源［1］，由于其特殊的晶體結(jié)構(gòu)，使其不能被充分利用，大部分被棄置［2］。纖維素酶是一種能夠?qū)⒗w維素分子降解為纖維二糖和葡萄糖等小分子物質(zhì)的一組復(fù)合酶，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織、能源轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域［3］。但大部分酶的最適作用溫度范圍為45～65℃，需要長時間的加熱和冷卻的處理過程，而低溫纖維素酶的最適作用溫度范圍為15～25℃［4］，較低的最適溫度以及低溫下的高效反應(yīng)，不僅可以縮短處理時間、節(jié)省費用，同時只需溫和的熱處理即可使其喪失活力，降低了對酶理化性質(zhì)的影響。因此低溫纖維素酶已成為了酶學(xué)研究的熱點之一，而產(chǎn)纖維素酶微生物的獲得則是研究酶的首要前提［5］。目前研究者已從不同環(huán)境中分離獲得多株低溫產(chǎn)纖維素酶的菌株，曾胤新等［6］從北極楚科齊海分離到一株產(chǎn)低溫纖維素酶的交替假單胞菌Pseudoalteromonas sp.BSW20308，5℃時仍可保持50%的纖維素酶活力;Fu xiaoyu等［7］從海洋中分離獲得一株芽孢桿菌Bacillus.sp BME－14，在5℃時纖維素酶活為最大酶活的65%。本研究從長白山土壤和牛糞中篩選出兩株低溫下具有較高纖維素酶活的真菌菌株，對兩株菌的形態(tài)特征、生長性質(zhì)、及產(chǎn)酶性質(zhì)進行了研究，以期為低溫纖維素酶規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 ①牛糞，采樣時間:2012年1月，采樣地點:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)牛場，用鐵鍬除去糞堆表層凍結(jié)的糞便和雜物，取糞堆中層處于結(jié)凍臨界點的糞樣置于自封袋中 (無菌操作)，帶回實驗室后置于4℃冰箱保存;②長白山土壤，采樣時間:2012年2月采樣地點:長白山南坡山麓下(E127°23＇，N41°32＇)，采樣深度 5 ～ 20 cm，無菌采集后置于裝有冰袋的保溫箱中帶回實驗室置于4℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 ① 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH自然，高壓滅菌30 min。② 羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基［8］:羧甲基纖維素鈉20 g，酵母膏0.5 g，Na2HPO42.5 g，KH2PO41.5 g，蛋白胨2.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH:7.0～7.2，高壓滅菌30 min。③ 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1000 mL，調(diào)pH7.0，高壓滅菌30 min。

1.2 耐低溫纖維素酶高產(chǎn)真菌菌株的初篩

稱取10 g樣品轉(zhuǎn)移至盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，搖床振蕩2 h后靜置1 h。取上清液稀釋為10－1～10－7七個稀釋度，分別涂布于PDA培養(yǎng)基上，15℃培養(yǎng)3～7 d。根據(jù)菌落形態(tài)特征挑取單個菌落點種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，加入剛果紅染色15 min，然后用1 mol/L NaCl浸洗15 min［9］，挑選出水解圈直徑 (D)與菌落直徑(d)比值較大的菌株進行保存。

1.3 耐低溫纖維素酶高產(chǎn)真菌菌株的復(fù)篩

將初篩菌株接種到裝有50 mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，15℃、160 r/min條件下培養(yǎng)3 d，4000 r/min離心10 min得到粗酶液。

用3，5－二硝基水楊酸法 (DNS)測定菌株的纖維素酶活力即濾紙酶活力 (Filter paper enzyme activity簡稱為 FPA)。酶活單位 (U/mL)定義:每mL粗酶液每min水解濾紙產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位［10］。

1.4 耐低溫纖維素酶高產(chǎn)真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

參照《微生物分類學(xué)》［11］和《真菌鑒定手冊》進行菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察［12］，利用插片法培養(yǎng)真菌，15℃培養(yǎng)3 d，取出已經(jīng)被菌絲體覆蓋的蓋玻片，置于載玻片上，通過光學(xué)顯微鏡觀察孢子和菌絲的形態(tài)。

1.5 耐低溫纖維素酶高產(chǎn)真菌的分子生物學(xué)鑒定

真菌DNA提取按參考文獻［13］進行。以提取兩菌株的基因組為模板，利用真菌核糖體rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS通用引物 (ITS1:5’－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3’;ITS4:5’－TCCTCCGCT-TATTGATATGC－3’)進行 PCR擴增，PCR回收產(chǎn)物與載體pMD－18T連接后轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH5a感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，經(jīng)菌落PCR鑒定后送生工基因公司進行測序。所得序列與Gene-Bank數(shù)據(jù)庫中序列進行 Blast分析比對，利用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系確定菌株的種屬。

1.6 耐低溫纖維素酶高產(chǎn)真菌菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.6.1 孢子懸浮液的制備 刮取F－3I和FF2－2的斜面菌種接種到馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，置于振蕩培養(yǎng)箱中15℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，制成孢子懸浮液備用。

1.6.2 碳源對酶活的影響 改變產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，備選碳源分別為羧甲基纖維素鈉、葡萄糖、蔗糖、淀粉、秸稈、麩皮。將孢子懸浮液以2%的接種量接入培養(yǎng)基中，15℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，測定濾紙酶活力 (FPA)，試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6.3 氮源對酶活的影響 確定最佳碳源后，采用不同的氮源取代發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，備選氮源分別為:牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、牛肉膏和蛋白胨混合物、硫酸銨和酵母粉混合物。研究不同氮源對菌株酶活力的影響。以2%的接種量將孢子懸浮液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，15℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，測定濾紙酶活力 (FPA)，試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6.4 pH值對酶活的影響 確定最佳碳源、氮源后，將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始 pH值分別調(diào)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以2%的接種量將孢子懸浮液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，15℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，測定濾紙酶活力 (FPA)，試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6.5 發(fā)酵溫度對酶活的影響 確定了最佳碳氮源和pH后，設(shè)置菌株發(fā)酵溫度分別為4、10、15、23、30和37℃，按2%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，160 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，測定濾紙酶活力(FPA)，試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6.6 發(fā)酵時間對酶活的影響 在確定上述條件的基礎(chǔ)上，將孢子懸浮液以2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，23℃、160 r/min振蕩培養(yǎng) (分別培養(yǎng)1～6 d)，測定濾紙酶活力 (FPA)，試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel和SPSS軟件進行整理和統(tǒng)計，用SPSS統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，用鄧肯氏新復(fù)極差測驗法DMRT(Duncan's Multiple Range Test，DMRT法)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐低溫纖維素酶高產(chǎn)真菌菌株的篩選

利用剛果紅染色法重復(fù)篩選后，從牛糞中分離出10株，從長白山土壤中分離出12株能夠產(chǎn)生清晰水解圈的真菌菌株，挑出其中6株水解圈較大的菌株 (見圖1)進行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，復(fù)篩結(jié)果如表1所示。

表1 菌株濾紙酶活測定結(jié)果1)Table 1 FPA activity results of strains

從表1可見，菌株FF2－2(分離自牛糞)和F－3I(分離自長白山土壤)具有較高的產(chǎn)纖維素酶活性。

圖1 剛果紅染色后的水解圈Fig.1 The hydrolytic zone on the screening plateA:FF2－2;B:F－3

2.2 耐低溫纖維素酶高產(chǎn)真菌菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株FF2－2菌落絲絨狀 (圖2A)，前期白色，后期為黃綠色。顯微鏡下觀察分支稀少，分生孢子串生，基內(nèi)菌絲發(fā)達，氣生菌絲不發(fā)達，分生孢子梗無橫隔，菌絲末端膨脹成半圓形頂囊，頂囊上覆蓋著輻射狀小梗，小梗上產(chǎn)生分子孢子鏈，分生孢子橢圓形或者球形直徑為3.75～5.15 μm(圖2 C)，初步鑒定菌株為短梗霉屬 Aureobasidiu.sp［10－11］。

菌株F－3I的菌落初期圓形致密生長 (圖2 B)，菌絲絨狀，后期產(chǎn)生白色分生孢子。顯微鏡下觀察氣生菌絲頂端不膨大，菌絲和分生孢子梗都有橫隔，菌絲膨大的頂端形同掃帚狀，分生孢子呈圓形或者橢圓形，直徑為2.5～3 μm(圖2 D)，菌株 F－3I初步鑒定為曲霉屬 Aspergillus sp［10－11］。

圖2 二株真菌的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)特征Fig.2 The micromorphology and Colony morphology of strainsA:FF2－2的菌落形態(tài);B:F－3I的菌落形態(tài);C:FF2－2的顯微形態(tài)特征;D:F－3I的顯微形態(tài)特征

2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 菌株的ITS rRNA序列鑒定 采用CTAB法提取兩菌株的總DNA，獲得核苷酸片段大小約為22000 bp(圖3左)，以兩菌株基因組DNA為模板，利用一對真菌 ITS通用引物進行PCR，取3 μLPCR產(chǎn)物進行w=1%瓊脂糖凝膠電泳，分別得到了542、528 bp的核苷酸片段，其大小與預(yù)期結(jié)果相符 (圖3右)。

圖3 兩株真菌總基因組提取結(jié)果 (A)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 (B)Fig.3 The electrophoresis analysis of two fungi total DNA(A)and PCR product(B)A:M1為DNA相對分子質(zhì)量標準 (λHindIII);L1、L2分別為FF2－2、F－3I基因組DNA;B:M2為DNA相對分子質(zhì)量標準 (DL2000 Marker);L1、L2分別為FF2－2、F－3I ITSPCR產(chǎn)物

2.3.2 序列比對及基因系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 兩株真菌ITS rRNA序列擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與克隆入pMD18－T載體連接轉(zhuǎn)化后，送至上海生工生物公司測序，菌株FF2－2、F－3I的核苷酸片段大小分別是542、528 bp。根據(jù)BLAST和DNAMAN軟件對測得的核苷酸序列進行比較分析，并利用MegAlign軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)進化樹，如圖4A和圖4B所示。

圖4 基于ITS rRNA序列同源性菌株FF2－2(A)和F－3I(B)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic trees of stain FF2－2(A)and F－3I(B)based on ITS rRNA sequence

由圖4可知，菌株 FF2－2與Aureobasidium pullulans strain CID 114的親緣關(guān)系最近，同源性為100%;菌株 F－3I與 Aspergillus versicolor strain NHRC－EC043的親緣關(guān)系最近，同源性為100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，最終確定菌株FF2－2為短梗霉屬的出芽短梗霉Aureobasidium pullulans，菌株F－3I為曲霉屬的花斑曲霉Aspergillus versicolor。

2.4 菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.4.1 碳源對酶活力的影響 由圖5可知，在不同碳源下，菌株F－3I的酶活力差異顯著，以淀粉為唯一碳源時，酶活力最高 (11.42±0.66)U/mL，麩皮次之 (8.32±0.20)U/mL;菌株FF2－2在以葡萄糖、淀粉、秸稈為碳源時，酶活力差異不顯著，而以麩皮為碳源時，酶活力與以其它碳源時的酶活力差異極顯著，最高酶活力達到 (15.32±1.09)U/mL，由于麩皮屬于天然可再生資源，價格較為廉價，且在實際應(yīng)用中可行性更高，因此兩株菌均采用麩皮為最佳碳源進行深入性研究。

圖5 不同碳源對菌株FF2－2和F－3I酶活力的影響Fig.5 Effects of different carbon sources on the enzyme activity of strain FF2－2 and strain F－3I

2.4.2 氮源對酶活力的影響 由圖6可知，在不同氮源下菌株F－3I的各酶活力差異顯著，以牛肉膏為氮源時，酶活力最高;菌株FF2－2在以牛肉膏和蛋白胨為氮源時酶活力無顯著差異，酶活力顯著高于其它氮源時的酶活力，兩菌株在以硫酸銨為氮源時酶活力均為最低。

圖6 不同氮源對菌株FF2－2和F－3I酶活力的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on the enzyme activity of strain FF2－2 and strain F－3I

2.4.3 初始pH對酶活力的影響 在pH為6和7時，菌株F－3I的產(chǎn)酶活力無顯著差異，與其它pH條件下的酶活力差異顯著;菌株FF2－2在PH為7時產(chǎn)酶活力與其它PH時酶活力差異極顯著，酶活力高達 (25.77±0.79)U/mL，說明2株菌在中性環(huán)境下均能較好的生長和產(chǎn)酶。如圖7所示。

圖7 不同初始pH對菌株FF2－2和F－3I酶活力的影響Fig.7 Effects of different initial pH on the enzyme activity of strain FF2－2 and strain F－3Ion enzyme activity

2.4.4 溫度對酶活力的影響 由圖8可知，溫度在4～23℃之間時，兩株菌的酶活隨溫度的升高逐漸升高，4個溫度下兩株菌的酶活力均差異顯著;當(dāng)溫度為23℃時，菌株F－3I的酶活達到最高，為 (22.33±1.26)U/mL，而菌株FF2－2在23℃和30℃時的酶活力差異不顯著，此時酶活力最高。當(dāng)培養(yǎng)溫度高于23℃時，隨著溫度的升高，酶活力呈下降趨勢。

2.4.5 時間對酶活力的影響 由圖9可知，菌株F－3I在發(fā)酵前2 d酶活力差異不顯著，隨著時間的增長，在第5天時酶活力達到最高值;而菌株FF2－2在培養(yǎng)第3天時，產(chǎn)酶活力最高。

圖8 不同溫度對菌株FF2－2和F－3I酶活力的影響Fig.8 Effects of different temperature on the enzyme activity of strain FF2－2 and strain F－3IF－3I的顯著性用大寫字母表示，F(xiàn)F－2的顯著性用小寫字母表示，不同字母表示差異性顯著 (P＜0.05)

圖9 不同時間對菌株FF2－2和F－3I酶活力的影響Fig.9 Effects of different time on the enzyme activity of strain FF2－2 and strain F－3IF－3I的顯著性用大寫字母表示，F(xiàn)F－2的顯著性用小寫字母表示，不同字母表示差異性顯著 (P＜0.05)

3 討論與結(jié)論

目前低溫微生物的獲得主要來源于極端環(huán)境，張淑紅等［14］從青藏高原冰山雪樣中分離出假單胞菌屬的低溫纖維素降解菌LHG－C－9，其生長范圍在－5～30℃，最適產(chǎn)酶溫度為30℃;呂明生等［15］從連云港海域的海水和海泥中分離得到低溫產(chǎn)纖維素酶菌株Z6，其生長溫度范圍在4～35℃，最適產(chǎn)酶溫度為25℃。極端環(huán)境中微生物的數(shù)量和種類固然繁多，但這些環(huán)境超低溫、強輻射、凍融的寡營養(yǎng)狀態(tài)增加了微生物培養(yǎng)的難度［16］，同時樣品的獲得也十分艱難，因此不能被廣泛的深入研究。本試驗從長白山地區(qū)的土壤和牛糞中通過溫度誘導(dǎo)分離出兩株高效的纖維素降解菌，生長溫度和產(chǎn)酶溫度與張淑紅、呂明生的研究結(jié)果相符合。這充分說明普通環(huán)境中同樣能夠獲得具有高催化特性的低溫微生物，同時樣品采集便利，節(jié)省資金，而且實際應(yīng)用中適應(yīng)性更強。

近年來研究比較多的低溫菌主要有交替假單胞菌Pseudoalteromonas、芽孢桿菌Paenibacillus、木霉Trichodermal、青霉Penicillium、以及根霉 Rhizopus ehrenberg［5］。本文獲得的兩株低溫纖維素分解菌FF2－2和F－3I，經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS rRNA分子生物學(xué)鑒定FF2－2為短梗霉屬的出芽短梗霉Aureobasidium pullulans，菌株F－3I為曲霉屬的花斑曲霉Aspergillus versicolor;目前A.pullulans的研究主要在生物防治領(lǐng)域以及產(chǎn)普魯蘭多糖方面，Zhang Dianpeng等［17］研究A.pullulans對桃子采后病害的防治效果;高璇璇等［18］通過紫外誘變出芽短梗霉來提高普魯蘭多糖的產(chǎn)量。而對A.versicolor的研究主要集中于菌絲體中化學(xué)成和次級代謝產(chǎn)物方面，Krupiński M 等［19］從 A.versicolor IM 2161 提取化學(xué)成分來消除壬基酚的毒性作用;張連慶等［20］提取A.versicolor ZLQ－43的次級代謝產(chǎn)物抑制腫瘤細胞;目前尚未發(fā)現(xiàn)出芽短梗霉 A.pullulans和花斑曲霉A.versicolor產(chǎn)低溫纖維素酶的報道，因此這兩株菌具有很大的開發(fā)潛力。

本試驗同時測定了5種因素對兩菌株產(chǎn)酶活力的影響。在碳源方面，發(fā)現(xiàn)在以麩皮為唯一碳源時菌株FF2－2的酶活力遠遠高于其它物質(zhì)作為碳源時的酶活力，而菌株F－3I在以麩皮為唯一碳源時，同樣具有較高的酶活力。在實際生產(chǎn)過程中麩皮作為農(nóng)業(yè)廢棄物，不僅較容易獲得，同時價格低廉，具有很強的生產(chǎn)應(yīng)用價值。在溫度方面，目前已報道的中高溫纖維素分解菌，酶活性受溫度影響較大，一般在45～65℃范圍內(nèi)獲得最大酶活力，而低于45℃時，隨著溫度下降酶活性逐漸減弱或者喪失［4］。而本試驗篩選出的兩株纖維素分解菌均能在23℃時獲得最大酶活力，隨著溫度升高，酶活力反而下降，這說明該酶對熱較敏感。同時最適產(chǎn)酶溫度也符合Margensin等［21］提出的最適反應(yīng)溫度在30℃左右的酶屬適冷酶范疇。

本試驗通過反復(fù)篩選分別從牛糞和長白上土壤中成功篩選出菌株FF2－2、F－3I，經(jīng)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定菌株FF2－2為短梗霉屬的出芽短梗霉，F(xiàn)－3I為曲霉屬的花斑曲霉。經(jīng)產(chǎn)酶條件優(yōu)化后菌株FF2－2和F－3I產(chǎn)酶的最適碳源分別是w=0.5%的麩皮、w=0.5%的淀粉;最適氮源分別為w=1%牛肉膏和硫酸銨混合物、w=1%牛肉膏;最適初始pH分別為7.0、6.0;最適發(fā)酵溫度均是23℃;最適發(fā)酵時間分別是3 d和5 d。優(yōu)化后菌株FF2－2的FPA酶活力提高了2.6倍，菌株F－3I FPA酶活力提高了5.5倍。

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