DNA雙鏈斷裂損傷修復的隨機模型研究*

孫廷哲，崔 雋

(1.安慶師范學院生命科學學院，安徽安慶246011;2.基因工程教育部重點實驗室//中山大學生命科學學院，廣東廣州510275)

電離輻射以及某些化學誘變劑所誘導的DNA雙鏈斷裂損傷 (DNA double strand break，DSB)是一種非常嚴重的 DNA損傷［1］。如果細胞不能對DNA雙鏈斷裂進行恰當?shù)男迯?，通常會導致基因組突變或者細胞死亡。細胞中持續(xù)的DNA雙鏈斷裂損傷也會大大增加癌變的風險。所以，DNA雙鏈斷裂修復對維持基因組的穩(wěn)定性起到了至關重要的作用［2］。

除了外源性因素所誘導的DNA雙鏈斷裂之外，內源性的因素也會導致DNA雙鏈斷裂損傷。約1%的單鏈DNA斷裂損傷 (single-strand DNA lesion，SSL)會轉變?yōu)殡p鏈DNA損傷。同時，在同源染色體的重組過程中，DNA雙鏈斷裂損傷也有一定的幾率生成。有報道稱，在具有Bloom綜合征遺傳背景細胞中，一個細胞周期約有50個內源性DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生，而正常細胞中內源性DSB水平相應降低［3］。這相當于1.5 ～2 Gy的電離輻射所誘導的DNA雙鏈斷裂。在腫瘤細胞中，內源性即本底水平的DNA雙鏈斷裂則更為顯著［4］。

在真核細胞中，DNA雙鏈斷裂的修復主要通過兩種方式:一種是同源重組 (homologous recombination，HR)，另一種是非同源末端連接 (nonhomologous end joining，NHEJ)［3］。譬如 MRN 復合物(由 Mre11，Rad50和 NBS1組成)、ATM(Ataxia Telangiectasia Mutated)MDC1和BRCA1等相關蛋白都參與到雙鏈斷裂的修復過程中。對DSB損傷修復的動力學研究一直是重要的課題。同時，通過系統(tǒng)生物學方法對DSB修復進行的模型研究也不斷涌現(xiàn)。早期的LPL(lethal and potentially lethal)模型以及RMR(repair-misrepair)模型是具有代表性的兩類模型［5－6］。這些模型通過引入可能的一級和二級動力學修復過程，較好的解釋了輻射誘導的細胞死亡現(xiàn)象。但是，對于雙鏈斷裂損傷所引發(fā)的細胞死亡動力學，這兩類模型不能很好的進行擬合。基于進一步的實驗研究，Stewart提出了TLK模型 (Two-Lesion Kinetic Model)［7］。在 TLK 模型中，根據(jù)DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生的復雜程度，修復經(jīng)歷了快修復和慢修復兩種過程?；赥LK模型的基本假設，Ma等［8］利用Monte Carlo方法構建了一個抽象的數(shù)學模型，很好的模擬了DNA雙鏈斷裂損傷的動力學行為并因此成功的解釋了p53的數(shù)字脈沖現(xiàn)象。Ma等提出的模型被很多后續(xù)的研究者所借鑒，為進一步的解釋細胞命運決定機制起到了極大的推動作用。另外，其他的一些模型則通過引入具體的分子機制對DNA雙鏈斷裂損傷的修復進行了動態(tài)的研究［9－12］。

但是，以上的這些模型并沒有充分考慮到細胞周期和DNA雙鏈斷裂損傷產(chǎn)生及修復的聯(lián)系:即只考慮了電離輻射誘導產(chǎn)生的外源性DNA雙鏈斷裂的動態(tài)修復，而并沒有考慮內源性DNA雙鏈斷裂的動態(tài)變化。在輻射刺激下，細胞會發(fā)生細胞周期阻滯現(xiàn)象，并修復輻射誘導的DNA損傷。當DNA損傷降低到特定閾值以下，細胞周期將被重啟。細胞周期重啟后，細胞周期伴隨的內源性DNA雙鏈斷裂將不斷產(chǎn)生，并得到動態(tài)修復。所以，我們提出了一個改良的Monte Carlo模型，并綜合考慮了外源性和內源性DNA雙鏈斷裂損傷的動態(tài)修復過程，從而更真實的模擬了細胞在應激狀態(tài)下的DNA雙鏈斷裂損傷修復的動力學行為。

1 材料與方法

1.1 DNA雙鏈斷裂損傷概述

DNA雙鏈損傷修復模型分為兩個模塊:分別為輻射誘導 (外源性)DNA損傷修復和內源性DNA損傷修復模塊。兩個模塊都基于Stewart模型的基本假設，即根據(jù)損傷的復雜程度，DSB修復分為快修復和慢修復兩種動力學形態(tài)［7］。DNA修復過程通過Monte Carlo過程來模擬。在修復過程中，DSB可能處于3種不同的狀態(tài):①完整的DSB;②DSB和修復蛋白的復合物;③已修復DSB。根據(jù)Ma等的假設，本模型暫不考慮錯誤修復情形［8］。在時間步為k時，處于狀態(tài)①、②和③的DSB分別用D(k)，C(k)和F(k)來表示。我們用下標‘1’和‘2’來區(qū)分DSB的快速修復和慢速修復過程 (圖1A)。易得如下關系:D(k)=D1(k)+D2(k)，C(k)=C1(k)+C2(k)和 F(k)=F1(k)+F2(k).總的修復蛋白(Repair protein，RP)被設定為20。隨機模擬的時間步長Δt設定為0.2 min。

圖1 DSB修復模型Fig.1 DSB repair modelA:快修復和慢修復動力學圖示;B:內源性DSB生成和時間步長關系

1.2 外源性和內源性DSB數(shù)目初始化

1.2.1 輻射誘導的DNA雙鏈斷裂修復 根據(jù)文獻報道，1 Gy的輻射劑量約產(chǎn)生30個DSB［3］。為了充分考慮DSB生成的隨機化，根據(jù)Ma等的假設，我們設定DSB的生成服從Poisson分布，其參數(shù)λ=30·IR，這里IR為輻射劑量［8］。根據(jù)Ma等的假設，70%的總DSB被快修復，而剩余的30%的DSB經(jīng)歷慢修復過程。

1.2.2 內源性DNA雙鏈斷裂修復 假設內源性的DSB主要在細胞周期過程中產(chǎn)生。進一步限定，所有的DSB均在細胞周期中的S期和G2/M期產(chǎn)生，并服從均勻分布。為了簡化模型，對細胞周期的時長進行了限定，即長度為20 h，其中G1，S和G2/M期的比例設為3∶4∶3。如文獻報道，乳腺癌腫瘤細胞MCF7的細胞周期約為20 h，其中G1，S和G2/M期時長分別為6、8和6 h，且周期不受外源輻射刺激影響［13］。本模型關于細胞周期的時長以及內源性DSB發(fā)生時間的設定亦可設為它值 (包括設置為隨機變量)，且不會對模型動力學產(chǎn)生定性的影響。在一個細胞周期中，我們設定將有50個DSB發(fā)生［3］。由于同源染色體重組等事件可誘發(fā)DSB，所以 DSB產(chǎn)生主要處于 S期［3］。因此，假設其中40個產(chǎn)生于S期，剩余10個產(chǎn)生于G2/M期。在內源性DNA損傷修復模塊中，我們設定每一個生成的內源性DSB將有70%的概率被快修復，有30%的概率被慢修復。

1.3 DSB修復的一般過程

為了偶聯(lián)外源性和內源性DSB修復的過程，我們設定發(fā)生細胞周期阻滯 (cell cycle arrest)的閾值為50個DSB。有文獻報道，正常細胞中當DSB水平小于20時，細胞周期阻滯將停止［14］。但腫瘤細胞可以耐受更高水平的DNA損傷［4］，所以我們將腫瘤細胞的閾值相應提高。當總DSB數(shù)目≤50時，細胞周期將被重啟。DSB的修復遵循如下過程:

1)設置初始值。D1(0)=floor(0.7·DSBT)，D2(0)=DSBT－D1(0)，這里DSBT為服從參數(shù)為λ的Poission分布隨機數(shù)，floor為向下取整。新生的外源性和內源性DSB都處于狀態(tài)1。設k=0。

2)增加時間步。設t=t+Δt，k=k+1。如果在 ［t，t+Δt］之間有1個內源性DSB生成 (圖1B，注:細胞周期重啟后)，則令D1(k)=D1(k)+1(概率為0.7，快速修復)或D2(k)=D2(k)+1(概率為0.3，慢速修復)。

3)對每一個進行快速修復的各狀態(tài)DSB進行更新。計算狀態(tài)轉變的概率:

從狀態(tài)①－＞狀態(tài)②，

PD1－＞C1=RP ［kfb1+kcross(D1(k－1)+D2(k－1))］Δt

從狀態(tài)②－＞狀態(tài)①，

PC1－＞D1= krb1Δt。

從狀態(tài)②－＞狀態(tài)③，

PC1－＞F1= kfix1Δt。

對于每一個DSB，首先生成一個 ［0，1］均勻分布的隨機數(shù)x。如果0≤ x＜ PD1－＞C1，處于狀態(tài)①的DSB將轉變?yōu)闋顟B(tài)②;如果PD1－＞C1≤ x≤1，那么DSB將維持在狀態(tài)①。若DSB處于狀態(tài)②，那么如果0≤ x＜PC1－＞D1，狀態(tài)②將轉變?yōu)闋顟B(tài)①。如果 PC1－＞D1≤ x ＜ PC1－＞D1+ PC1－＞F1，那么狀態(tài)②將轉變?yōu)闋顟B(tài)③。若PC1－＞D1+PC1－＞F1≤x≤1，那么狀態(tài)②將維持不變。如果損傷處于狀態(tài)③，那么它將維持不變 (即狀態(tài)③是吸收態(tài))。修復蛋白RP遵循如下規(guī)律:如果發(fā)生狀態(tài)①到狀態(tài)②轉變，設RP=RP－1;反之則設RP=RP+1。其它情況下，RP維持不變。對處于狀態(tài)①、②和③的DSB進行計數(shù)，并分別賦予D1(k)，C1(k)和 F1(k)。

4)類似于快修復過程，對慢修復DSB進行更新。算法如下:

從狀態(tài)①－＞狀態(tài)②，PD2－＞C2=RP ［kfb2+kcross(D1(k－1)+D2(k－1))］Δt。

從狀態(tài)②－＞狀態(tài)①，

PC2－＞D2= krb2Δt。

從狀態(tài)②－＞狀態(tài)③，

PC2－＞F2= kfix2Δt。

對于每一個慢修復DSB，首先生成一個 ［0，1］均勻分布的隨機數(shù)x。如果0≤ x ＜ PD2－＞C2，狀態(tài)1的DSB將轉變?yōu)闋顟B(tài)2;如若PD2－＞C2≤ x≤1，那么將維持在狀態(tài)①。若DSB處于狀態(tài)②，如果0≤ x＜PC2－＞D2，狀態(tài)②將轉變?yōu)闋顟B(tài)①。如果 PC2－＞D2≤ x ＜ PC2－＞D2+ PC2－＞F2，那么狀態(tài)②將轉變?yōu)闋顟B(tài)③。若 PC2－＞D2+ PC2－＞F2≤ x≤1，那么狀態(tài)②將維持不變。如果損傷處于狀態(tài)③，那么它將維持不變 (即狀態(tài)③是吸收態(tài))。修復蛋白RP遵循如下規(guī)律:如果發(fā)生狀態(tài)①到狀態(tài)②轉變，設RP=RP－1;反之則設RP=RP+1。其它情況下，RP維持不變。對處于狀態(tài)①、②和③的DSB進行計數(shù)，并分別賦予D2(k)，C2(k)和F2(k)。

5)令 D(k)=D1(k)+D2(k)，C(k)=C1(k)+C2(k)，和F(k)=F1(k)+F2(k)。

6)重復 (2)－ (5)，直到t=tfinal。

DNA修復模塊各參數(shù)詳見表1。

表1 模型參數(shù)和描述1)Table 1 Model parameter and description

1.4 DSB修復模型模擬工具

隨機模擬通過MATLAB(MathWork，版本號7.12.0.635，R2011a)實現(xiàn)。

2 結果

2.1 DSB修復的動態(tài)變化

通過運行MATLAB腳本程序，獲得了200組Monte Carlo模擬結果。圖2中對應的初始外源性輻射刺激為5 Gy。具體為:產(chǎn)生200個隨機數(shù)，這些隨機數(shù)服從λ=150(5×30)的Poisson分布。接著將200個隨機數(shù)作為初始刺激水平。隨機數(shù)的產(chǎn)生運用到了MATLAB的庫函數(shù)poissrnd。產(chǎn)生的200組初始DSB分布可參見圖2A。圖2B示部分隨機DSB修復模型的模擬結果。發(fā)現(xiàn)DSB的修復在時間序列上呈現(xiàn)出很大的變異性，表現(xiàn)在每個細胞初始的DSB水平不同，這種變異是由所產(chǎn)生的200組符合Poisson分布的隨機數(shù)引起的。同時，細胞中DSB的修復速率也存在較大變異。當細胞重新進入細胞周期后，DSB的修復往往呈現(xiàn)一種非單調的動態(tài)變化 (圖2B)。一些自發(fā)產(chǎn)生的內源性DNA損傷使得總體DSB數(shù)目經(jīng)歷不同水平的瞬間上升。當自發(fā)DNA損傷產(chǎn)生較集中而修復能力相對較弱時，總體DSB水平會有更為顯著的升高(圖2B，左圖)。我們也注意到:在外源輻射施加24 h后，細胞中仍然存在較高水平的DNA雙鏈損傷 (圖2B)。即使將模擬時間延長到48 h，這種動態(tài)行為仍然存在 (圖2C)。我們分別統(tǒng)計了200組隨機模擬試驗中最低的DSB水平 (注:時長為48 h)。從柱狀圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，所有的200組模擬結果都表明細胞中存在著未被修復的DNA損傷，同時在某些細胞中，DNA損傷可能一直維持在較高的水平 (圖2C)。這些結果表明，細胞中DSB修復存在著較為顯著的變異，同時細胞也具有較高水平的本底DNA損傷。

圖2 DSB隨機修復動力學行為Fig.2 Dynamics of stochastic repairA:初始DSB分布 (服從參數(shù)為150的Poisson分布);B:DSB隨機修復的動態(tài)變化;C:在48 h內，每次模擬中最小DSB值分布圖 (共200組)

2.2 DSB修復過程中的變異性

從圖2可知DSB修復的動態(tài)過程存在著較大的變異性。為了進一步描述這種變異行為，對200組時間序列進行描述性統(tǒng)計。結果顯示，DSB的修復存在著較為顯著的變異性 (圖3A)。在DSB修復的初期，這種變異性較小，表現(xiàn)為較窄的置信區(qū)間。從平均水平上而言，DSB修復過程的半衰期(即令 DSB水平下降到初值一半的時間)約為3.24 h。而從約2 h到10 h這段時間內，DSB修復的變異相對較大 (圖3A)。這種相對較顯著的變異可能是由早期外源性DNA的隨機修復引起的。與內源性DSB不同的是，外源DSB的發(fā)生服從Poisson分布，從而在隨機修復的基礎上引入了額外的不確定性。隨著時間的推移，隨機修復合并初值隨機分布的變異將愈發(fā)顯著，進而可能導致DSB的修復在半衰期附近存在較大變異。當較多的外源性DSB得到了修復后，總DSB接近于重新觸發(fā)細胞周期的水平。由于未被修復的DSB水平較之初始狀態(tài)顯著降低，所以隨機修復的變異也隨之下降。進一步統(tǒng)計了200組模擬的半衰期。結果顯示，DSB的半衰期亦存在著較為明顯的變異 (圖3B)。同時，半衰期的分布與時間序列中變異較為顯著的區(qū)域也具有一定的吻合。以上結果暗示，DSB的損傷修復具有較為顯著的變異性。

圖3 DSB修復過程中的變異Fig.3 Variations in DSB repairA:200組Monte Carlo模擬的平均值 (紅色曲線)和95%置信區(qū)間 (紅色陰影區(qū));B:DSB修復半衰期分布

3 討論

本文提出了一個更為精細化的DNA雙鏈斷裂損傷修復模型。在這個模型中，考慮了外源性和內源性DSB在修復過程中的偶聯(lián)，并對此模型進行了Monte Carlo模擬。模擬結果顯示，DSB的修復具有顯著的變異性 (圖2、圖3)。同時，由于本底水平即內源性DNA損傷的隨機發(fā)生，DSB的動態(tài)變化并非呈現(xiàn)一種單調降低的行為 (圖2B)。這種非單調的行為是以往的模型所忽視的。最近Loewer等［15］的實驗顯示腫瘤細胞中的DNA雙鏈損傷可能呈現(xiàn)非單調的動態(tài)行為，從而為本文模擬結果提供了依據(jù)。所以，本文模型可以較好的模擬細胞完整生命周期中的DSB損傷修復行為。

值得注意的是Ma等之前的模型并沒有考慮具體的DSB修復信號轉導網(wǎng)絡，轉而根據(jù)TLK的基本假設提出了一個較為抽象的模型。其優(yōu)勢在于DSB修復的信號轉導網(wǎng)絡仍存在較大的未知，且已知參與修復的蛋白復合物相互作用較為復雜［16－17］。若采用常規(guī)的常微分方程建模方法，將極大的增加模型的復雜程度。運用抽象的Monte Carlo模擬方法既能較好的模擬DSB修復的隨機動力學行為，同時又能巧妙的回避具體信號轉導網(wǎng)絡的未知因素。所以，本文基于Ma等的模型，提出了DSB修復的更為完整的模型，即同時考慮內源性和外源性DSB損傷的修復過程及其偶聯(lián)效應，更好的描述了細胞在應激狀態(tài)下的DSB修復過程。需要注意的是，本模型參數(shù)主要基于腫瘤細胞相關研究進行的估計，所以此模型旨在描述非正常細胞的DSB修復行為［18］。對于正常的細胞而言，本底水平的DSB數(shù)量較之腫瘤細胞顯著的降低，同時觸發(fā)細胞周期阻滯的DSB閾值也較低。同時，腫瘤細胞中的基因突變很可能導致正確修復速率的顯著降低［19－20］。綜合以上的因素，正常細胞中的DSB修復可能具有更高的效率，從而使得正常細胞中的DSB修復動力學性質可能會與腫瘤細胞中的相關性質具有一定的差異。通過改變模型參數(shù) (如增大kfix1或減少內源性DSB總量)，即可對正常細胞的DSB修復進行定性的模擬。所以，本模型具有一定的普適性。

提出較為完整的DSB修復模型對于其它信號轉導網(wǎng)絡的相關動力學行為研究也具有很大的必要性。譬如ATM可以作為感受器感知DSB的變化，并得到活化?；罨腁TM可以作為激酶磷酸化p53蛋白并借此與復雜的p53信號轉導網(wǎng)絡建立直接的聯(lián)系。P53在未受刺激和應激狀態(tài)下 (如電離輻射和紫外線)都表現(xiàn)出復雜的動力學行為［13，15，21－23］。以往描述 p53 動力學模型中的 DNA損傷修復模塊都沒有很好的考慮外源性和內源性DNA損傷的協(xié)同作用，所以不能很好的同時解釋p53 在受迫和未受迫狀態(tài)下的動力學行為［22，24－25］。所以，本模型可能有助于其它信號轉導網(wǎng)絡的動力學行為研究。譬如內源性的DNA損傷會在非受迫狀態(tài)下觸發(fā)p53的自發(fā)脈沖，那么就為研究p53的本底動力學和p53單細胞動力學中存在的線性現(xiàn)象提供了可能［13，15］。此外，DSB 修復模型與細胞周期信號轉導網(wǎng)絡的偶聯(lián)也可能有助于模擬更為真實的細胞周期中的動力學現(xiàn)象［26］。DNA損傷修復與特定信號轉導網(wǎng)絡的相互作用也可能產(chǎn)生反饋或前饋作用，從而產(chǎn)生更為復雜的動力學行為。

隨著對DNA雙鏈斷裂損傷修復過程認識的不斷深入，建立更為精細化的基于具體分子機制的DNA損傷修復模型并結合恰當?shù)碾S機模擬方法將有助于實現(xiàn)對損傷修復過程更為精確的定量研究。

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