缺氧預(yù)處理對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠缺氧誘導(dǎo)因子-1α、葡萄糖轉(zhuǎn)運體3型及神經(jīng)元核蛋白表達的影響

武孝剛 劉家傳 楊艷艷 王金標 張星 王春琳 周治民

缺氧預(yù)處理對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠缺氧誘導(dǎo)因子-1α、葡萄糖轉(zhuǎn)運體3型及神經(jīng)元核蛋白表達的影響

武孝剛 劉家傳 楊艷艷 王金標 張星 王春琳 周治民

目的探討缺氧預(yù)處理(HPC)對創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)大鼠挫傷灶周圍皮層組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、葡萄糖轉(zhuǎn)運體 3 型(GLUT-3)表達及神經(jīng)元存活影響。方法120 只Sprague-Daw ley 大 鼠 按 隨 機 數(shù) 字 法 分 為 對 照 組(12 只)、TBI組(54 只)、HPCT 組(54 只)。TBI組 按Feeney 自 由 落 體 撞 擊 法 建 立 大 鼠 TBI模 型 ，HPCT 組 先 給 予 3 d HPC(50.47 kPa，3 d，3 h/d)，之 后同法 致傷 。 采用 RT-PCR 及 Western blotting 檢 測 傷 后 1、4、8、12 h 及 1、3、7、14 d 挫 傷 灶周 圍 HIF-1α、GLUT-3mRNA 及蛋白的表達，并分析 HIF-1α與 GLUT-3 之間的相關(guān)性，采用免疫組化檢測傷后14 d 挫傷灶周圍神經(jīng)元核蛋白(NeuN)陽性表達率來觀察神經(jīng)元存活情況。多組間比較行單因素方差分析，用 LSD 法行兩兩比較分析 2 組間差異，相關(guān)性分析用 Pearson 相關(guān)分析，以 P＜0.05 為差異 具 有 統(tǒng) 計 學(xué)意 義 。結(jié) 果TBI組傷 后 4 h 至 3 d HIF-1α、GLUT-3 的 表 達 均 明 顯 增 加(P＜0.05)。HPCT組 HIF-1α 及 GLUT-3 的表達 在傷后 1 h 即增強，傷后 4 h 至 7 d HIF-1α、GLUT-3 表達 量和傷后14 d NeuN 陽性 細 胞 數(shù)均明顯高于 TBI組 ，差 異 均 具有統(tǒng)計學(xué)意 義(P＜0.05)。相關(guān)性分 析 表 明 HIF-1α與GLUT-3mRNA 及蛋白的表達均呈正相關(guān)。結(jié)論HPC可通過誘導(dǎo)皮層腦組織HIF-1α的表達，上調(diào)GLUT-3mRNA及蛋白的表達，進而提高TBI后急性期神經(jīng)元的存活率。

腦損傷； 創(chuàng)傷和損傷； 缺氧誘導(dǎo)因子-1，α亞基； 葡萄糖轉(zhuǎn)運體3型

創(chuàng) 傷 性 腦 損 傷(traumatic brain injury，TBI)后 因缺氧引起的腦組織能量代謝異常是引發(fā)神經(jīng)元死亡的重要因素。低氧狀態(tài)下，體內(nèi)能量代謝產(chǎn)生一系列應(yīng)激性變化，葡萄糖作為重要能量代謝底物優(yōu)先被機體利用。而葡萄糖主要由細胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運體蛋白(glucose transporter，GLUT)介導(dǎo)進入細 胞 內(nèi) ，因 此 GLUT-3 作 為 主 要 表 達 于 神 經(jīng) 元 的GLUT亞型，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元葡萄糖代謝中的作用至關(guān) 重 要[1]。 近 年 來 ，缺 氧 預(yù) 處 理 (hypoxic preconditioning，HPC)作為抗缺血缺氧的研究熱點之一，其機制及應(yīng)用備受關(guān)注[2]。但 HPC 調(diào)節(jié)葡萄糖代謝過程中信號分子之間相互作用的機制尚不十分明確。本實驗通過觀察HPC對TBI大鼠缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor，HIF-1α)、和 GLUT-3 mRNA 蛋 白 表 達 以 及 對 神 經(jīng) 元 核 蛋 白(neuron-specific nuclear protein，NeuN)陽 性 細 胞 數(shù)的影響，探究HPC調(diào)節(jié)TBI傷后神經(jīng)元能量代謝的相關(guān)保護機制。

材料與方法

一、實驗動物及分組

120 只 健 康 成 年 雄 性 Sprague-Daw ley 大 鼠 ，體重250～300 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，按隨機數(shù)字表法分為對照組(12 只)、TBI組(54只)和HPC 組(54 只)。按處死時間不同又隨機分為傷后1、4、8及12 h和1、3、7及14 d亞 組 。 傷 后14 d亞 組12只，其余亞組每組6只。所涉大鼠飼養(yǎng)及訓(xùn)練方案均由安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準。

二、主要試劑和儀器

低壓氧艙(上海減壓器廠)，ZH-ZYQ 型自由落體腦損傷模型打擊器(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公 司)，Trizol試劑( 美國 invitrogen 公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國 Fermentas公司)，HIF-1α、GLUT-3 及甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH)引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司)，熒光定量 PCR 儀(美國 ABI公司)，兔抗 HIF-1α單克隆抗體、兔抗 GLUT-3 多克隆抗體及兔抗 NeuN 單克隆抗體(美國 Abcam 公司)，DYY-11型電泳儀(北京市六一儀器廠)。

三、動物模型制作及標本制備

HPCT 組 大 鼠置于低壓 氧 艙(壓 力為 50.47 kPa)每天連續(xù)預(yù)處理3 h，其余時間將大鼠置于正常環(huán)境中，共預(yù)處理 3 d。而后用 Feeney 自由落體撞擊法[3]制作TBI模型，醒后自由進食。各組動物模型分別于各亞組時間點處死。在傷后14 d亞組中選取6只行 40 g/L 多聚甲醛心臟灌注后斷頭取腦，再浸泡于40 g/L多聚甲醛固定，常規(guī)脫水及石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm，供免疫組化染色用；余各亞組大鼠處死 后 即 刻 冰 上斷頭取腦，取挫傷灶 周 圍 0.5 cm皮層腦組織，供 RT-PCR 及 Western blotting 檢測用。

四、RT-PCR檢測HIF-1α、GLUT-3mRNA 表達

按 Trizol試劑說明書提取總 RNA 后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書行逆轉(zhuǎn)錄。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μl進行熒光 PCR 反 應(yīng) 。 引 物 序 列 為 ：HIF-1α 上 游 為AGAGTCAAGCCCAGAGTCAC，下游為TGGGACTGTTAGGCTCAGGT，產(chǎn) 物 長 度 116 bp；GLUT-3上 游 為 TGTGGCTCAGGTCTTTGGTT，下 游 為GCGCTCTGTAGGATAGCTGG，產(chǎn)物長度為99 bp；GAPDH 上 游 為 GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT，下游為ACGGCCAAATCCGTTCACACC，產(chǎn)物長度為 107 bp。 反 應(yīng) 條 件 如 下 ：95℃ 10m in，95℃ 15 s，60℃ 1m in，40個循環(huán)；以 GAPDH為內(nèi)參 ，C組為對照，用 2-ΔΔCT公式計算 mRNA 的相對表達量。

五 、Western blotting 檢 測 HIF-1α、GLUT-3 蛋 白的表達

標本裂解離心得到總蛋白，通過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、4℃緩慢搖動封閉過夜后分別滴加一抗(兔抗 HIF-1α抗體、兔抗 GLUT-3 抗體)、4℃緩慢搖動孵育過夜后滴加二抗，室溫避光條件下孵育2 h后顯影 定 量 ，最 后拍 照。 用 Quantity one 灰 度 分 析 軟 件測 定各條帶 灰 度值，分 別 以 HIF-1α、GLUT-3 與βactin 的蛋白產(chǎn)物灰度值之比作為 HIF-1α、GLUT-3蛋白水平的相對表達量。

六、免疫組化染色檢測NeuN蛋白的表達

傷后14 d行病理檢查。切片嚴格按試劑盒說明 書 進 行 操 作 ，二 氨 基 聯(lián) 苯 胺(diam inobenzidine，DAB)顯色后，光鏡下觀察，神經(jīng)元胞體顯棕黃色為陽性。各標本取5張相同部位的切片，在熒光顯微鏡下(×400)相同區(qū)域隨機選取 5 個非重疊的視野，求均值后記錄各視野NeuN的陽性細胞數(shù)。

七、統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以(x±s)表示，多組間 mRNA 表達結(jié)果比較行單因素方差分析，用LSD法行兩兩比較分析2組間差異，相關(guān)性分析用 Pearson 相關(guān)分析，以 P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一 、HIF-1α mRNA 及 GLUT-3mRNA 的 表 達結(jié)果

對 照 組 HIF-1α mRNA 的 相 對 表 達 量 為1.004 ± 0.097，GLUT-3 mRNA 的 相 對 表 達 量 為0.993±0.087(圖 1、圖 2)。TBI組 HIF-1α 及 GLUT-3 mRNA水 平 在 傷 后4 h開 始 升 高 ，12 h達 高 峰 ，1 d開 始 下 降 ，7 d 逐 漸 降 至 接 近 對 照 組 水 平 (F= 13.287，P=0.000)，相 關(guān) 性 分 析 提 示 HIF-1α 與GLUT-3 mRNA 的 表 達 呈 正 相 關(guān) (r=0.908，P= 0.000)；而與 TBI組相比，HPCT 組 HIF-1α及 GLUT-3mRNA在 傷 后 的12 h達 到 峰 值 ，1 d開 始 下 降 ，14 d 降至接近對照組水平(F=12.456，P=0.001)，相關(guān)性分析提示，HIF-1α與 GLUT-3mRNA 的表達呈正相關(guān)(r=0.882，P=0.003)。

二、HIF-1α及 GLUT-3蛋白表達的結(jié)果

對 照 組 HIF-1α 蛋 白 的 相 對 表 達 量 為 0.256 ± 0.021，GLUT-3 蛋 白 相 對 表 達 量 為 0.232 ± 0.022。TBI組 HIF-1α 及 GLUT-3 蛋白 表達 水 平在 傷后 4 h開 始 升 高 ，1 d達 高 峰 ，3 d開 始 下 降 ，7 d降 至 接 近對照組水平(F=11.138，P=0.005)。相關(guān)性分析提示HIF-1α與 GLUT-3 蛋白的表達呈正相關(guān)(r=0.984，P=0.012)。 與 TBI 組 相 比 ，HPCT 組 HIF-1α 及GLUT-3蛋 白 水 平 在 傷 后1 h開 始 升 高 ，1 d達 到 峰值 ，3 d開 始 下 降 ，14 d逐 漸 降 至 接 近 對 照 組 水 平(F=14.362，P=0.001)。 相 關(guān) 性 分 析 提 示 HIF-1α 與GLUT-3 蛋白的表達呈正相關(guān)(r=0.954，P=0.002；圖3、圖4)。

圖1 大鼠大腦皮層組織傷后不同時間GLUT-3mRNA的表達Fig.1 Expression of GLUT-3mRNA in rats cortical tissue in different timesafter injury

圖2 大鼠大腦皮層組織傷后不同時間HIF-1α mRNA的表達Fig.2 Expression of HIF-1α mRNA in rats cortical tissue in different timesafter injury

三、NeuN陽性細胞數(shù)結(jié)果

傷后14 d行病理檢查提示，對照組NeuN標記神經(jīng)元呈橢圓形或類圓形，分布均勻，形態(tài)規(guī)則；TBI組神經(jīng)元數(shù)量較對照組明顯減少，且胞體萎縮，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.286，P=0.005)；與 TBI組相比，HPCT組皮層神經(jīng)元數(shù)量有明顯恢復(fù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.112，P=0.002，圖 5、表 1)。

圖 3 TBI組 HIF-1α及GLUT-3蛋白的表達Fig.3 Expression ofHIF-1α and GLUT-3 in TBIgroup

圖4 HPCT 組HIF-1α及GLUT-3蛋白的表達Fig.4 Expression of HIF-1α and GLUT-3 in HPCT group

表1 各組大鼠平均每高倍視野NeuN陽性細胞計數(shù)(x±s)Tab.1 NeuN positive cellsof each group of ratsperhigh power field(Mean±SD)

討論

一、腦組織缺氧耐受性

腦組織在常氧狀態(tài)下產(chǎn)生的能量主要用于維持跨膜離子運輸?shù)?Na+-K+-ATP 泵。而缺氧狀態(tài)下腦組織因有氧氧化不足，引起糖酵解增加，但不足以完全代償能量匱乏，數(shù)分鐘后 Na+-K+-ATP 即出現(xiàn)功能障礙，致使跨膜離子濃度梯度下降，胞外 Ca2+內(nèi)流，產(chǎn)生一系列聯(lián)級損傷反應(yīng)[4]。HPC 已在多種屬動物在體及離體實驗中證實是機體抗缺氧性損傷的 重 要 內(nèi) 源 性 保 護[5]。 HPC 可 調(diào) 節(jié) 腦 內(nèi) 葡 萄 糖 代謝，其具體分子機制尚不十分明確，可能通過增強腦組織缺氧耐受性、誘導(dǎo) HIF-1α上調(diào)了糖代謝相關(guān)的低氧基因表達等途徑實現(xiàn)的[6]。GLUT-3 在脊椎動物神經(jīng)元內(nèi)高表達，介導(dǎo)葡萄糖由腦組織間隙轉(zhuǎn)運至神經(jīng)元內(nèi)，在神經(jīng)元成熟及突觸連接中十分重要[7]。Yu 等[8]研究證實 HPC 可增加神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞攝取葡萄糖的能力，HPC可明顯增加神經(jīng)元中 GLUT-3mRNA 的表達。GLUT-3 作為調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞攝取并利用葡萄糖的重要載體物質(zhì)，可能參與了HPC調(diào)節(jié)神經(jīng)元葡萄糖代謝的相關(guān)通路。

二、缺氧耐受與葡萄糖代謝

圖5 缺氧預(yù)處理對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠皮層神經(jīng)元影響的病理切片圖(NeuN染色 ×400)Fig.5 Pathologicalslicesdiagram of effectof hypoxic preconditioning on rats cortical neuronsw ith traumatic brain injury(NeuN staining)

與單純TBI相比，HPC可在傷后早期明顯增加腦組織對缺氧的耐受性，增加傷后神經(jīng)細胞內(nèi)GLUT-3的表達，改善神經(jīng)元能量代謝不足，減輕神經(jīng)元的損傷。體現(xiàn)在：(1)與對照組相比，TBI組大鼠傷后4 h GLUT-3mRNA及蛋 白 的 表達開始增高 ，而HPCT組大鼠GLUT-3的表達在傷后1 h較對照組和TBI組即開始增高。推測HPC可通過預(yù)先增加神經(jīng)元對缺氧的適應(yīng)能力，進而在隨后發(fā)生TBI時，促使神經(jīng)元內(nèi) GLUT-3mRNA及蛋白提前表達，使神經(jīng)元轉(zhuǎn)運及攝取葡萄糖的能力在傷后早期明顯增加 。(2)傷 后 4 h 至 傷 后 3 d 各 時 間 點 HPCT 組 大 鼠GLUT-3mRNA及蛋白的表達水平較對照組和TBI組均明顯增加，提示HPC可增加神經(jīng)元的缺氧耐受能力，并通過增加神經(jīng)元內(nèi) GLUT-3 的表達，提高TBI后神經(jīng)元攝取及利用葡萄糖的能力，代償傷后神經(jīng)元因有氧氧化過程不足而產(chǎn)生的能量代謝障礙，減輕因此而導(dǎo)致的各種聯(lián)級反應(yīng)，維持其結(jié)構(gòu)和 功 能 的 相 對 完 整 性 。(3)傷 后 7 d TBI組 GLUT-3 mRNA及蛋白的表達已恢復(fù)至接近正常組水平，但HPCT 組 GLUT-3mRNA 及蛋白的表達仍高于 TBI組和對照組，提示HPC延長了TBI傷后神經(jīng)元缺氧耐受的時限，通過維持神經(jīng)元內(nèi)GLUT-3的延續(xù)性表達，使TBI后神經(jīng)元能夠持續(xù)攝取更多的底物葡萄糖，減少神經(jīng)元壞死及功能異常。

三、缺氧耐受的腦保護作用機制

HIF-1 是一種對氧濃度極其敏感的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子，由α亞基和β亞基 2 個亞基組成，其中 HIF-1α是氧調(diào)節(jié)活性亞基。缺氧狀態(tài)下，HIF-1α表達增加，進 而 調(diào) 節(jié) 其 下 游 靶 基 因 的 表 達[9]。 HIF-1α 可 通 過PI3K/Akt/m TOR 途 徑促進 GLUT-3 的 生 成[10]。 本實驗中 HPC 大鼠 TBI后HIF-1α mRNA 及蛋白表達量在 傷 后1 h即 出 現(xiàn) 增 加 ，且 傷 后4 h至 傷 后7 d各 時間點較對照組和TBI組均明顯增加?？赡芤驗镠PC通 過 增加 TBI傷后早期腦內(nèi) HIF-1α的表達增加腦組 織對 缺氧 的 耐 受 性，并使 HIF-1α在 傷后 7 d 內(nèi) 持續(xù)性高表達，進而調(diào)控其下游各靶基因表達的變化，發(fā)揮腦保護作用。本實驗顯示傷后各組 HIF-1α和GLUT-3mRNA及蛋白表達水平均呈正相關(guān)。推測 HPC 可能通過增加 TBI傷后 HIF-1α的表達，促進GLUT-3 轉(zhuǎn)錄，增加 GLUT-3 的表達量，促進神經(jīng)元攝取及利用葡萄糖。

當(dāng)神經(jīng)元缺血缺氧損傷后，神經(jīng)元內(nèi)特異性表達的NeuN即消失，目前在腦缺血缺氧性損傷研究中，NeuN一直作為檢測神經(jīng)元是否壞死的一個指標[11]。 本 實 驗 提 示 ，HPC 增 加 TBI傷 后 神 經(jīng) 元 內(nèi)GLUT-3 表達量，NeuN 陽性細胞數(shù)亦明顯增加，提示HPC可通過調(diào)節(jié)提高神經(jīng)元內(nèi)GLUT-3的表達，減少局部能量供應(yīng)障礙所致的神經(jīng)元損傷，對減輕TBI傷后腦功能的損害有明顯作用。

綜上所述，HPC可通過增加TBI傷后 HIF-1α的表達來介導(dǎo)神經(jīng)元 GLUT-3mRNA及蛋白的表達，提高TBI后神經(jīng)元轉(zhuǎn)運及利用葡萄糖的能力，提前并延長神經(jīng)元葡萄糖代謝的時限，減輕神經(jīng)元能量代謝不足，增加TBI傷后神經(jīng)元的存活率。啟示HPC未來可成為預(yù)防和治療顱腦損傷后神經(jīng)元能量代謝障礙的一種行之有效的路徑。

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Effect of hypoxic preconditioning on the expression of hypoxia-inducible factor-1α ,glucose transporter-3 and neuron-specific nuclear protein in cerebral cortex in ratsw ith traumatic brain injury

Wu Xiaogang,Liu Jiachuan,Yang Yanyan,Wang Jinbiao,Zhang Xing,Wang Chunlin, Zhou Zhimin.DepartmentofNeurosurgery,the 105Hospital ofPLA,the Chinese People's Liberation Army ClinicalCollege ofAnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230031,China

Liu Jiachuan,Email:ljc571017@sina.com

Objective To investigate the effect of hypoxic preconditioning(HPC)on the expression of hypoxia-inducible factor-1α,glucose transporter-3 and neuronal survival in cerebral cortex in rats w ith traumatic brain injury(TBI). M ethods A total of 120 SD rats were random ly assigned to control group(CON,n=12),traumatic brain injury group(TBI,n=54)and traumatic brain injury after HPC group(HPCT,n=54).The rats of TBI group were established the TBImodel by Feeney free falling dart impactmethod;The rats of HPCT group were treated w ith HPC(50.47 kPa, 3 h/d,3 d)firstly,and then establish the HPCTmodelby Feeney free falling dart impactmethod.Detect the expression of HIF-1α、GLUT-3mRNA and protein around the contusion focus on 1 h,4 h,8 h, 12 h,1 d,3 d,7 d,14 d post-injury by RT-PCR and Western blotting,analysis the relevance between HIF-1α and GLUT-3,observe the neuronal survival situation of NeuN positive expression rate around the contusion focus by immunohistochemistry in 14 d post-injury.Take single factor analysis of variance among groups,analyzed bymultiple comparisonsw ith LSD method,correlation analysisw ithPearson correlation analysismethod,set P＜0.05 as the statistically significant difference.Results TBIgroup,both HIF-1α and GLUT-3 increased expression significantly on 4 h,8 h,12 h,1 d and 3 d post-injury(P＜0.05).HPCT group,both HIF-1α and GLUT-3 increased expression on 1h post-injury, the expression of HIF-1α and GLUT-3 on 4 h to 7 d post-injury and the countof NeuN positive cells 14 d post-injury were both significantly higher than TBIgroup(P＜0.05).Correlation analysis showed that the expression of HIF-1α and GLUT-3mRNA and protein were positive correlated.Conclusion HPC can induce the expression of HIF-1α in the cortical brain tissue,raise the expression of GLUT-3 mRNA and protein,and improve the acute neuronalsurvival rate post-injury of TBI.

Brain injuries; Wounds and injuries; Hypoxia-inducible factor Ⅰ,alpha subunit; Glucose transporter type3

2015-01-02)

(本文編輯：楊藝)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.01.004

全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”科研項目(CWS11J262)；2009年南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新重點課題(09Z009)

230031 合肥，解放軍第一〇五醫(yī)院神經(jīng)外科

劉家傳，Email：ljc571017@sina.com

武孝剛,劉家傳,楊艷艷,等.缺氧預(yù)處理對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠缺氧誘導(dǎo)因子-1α、葡萄糖轉(zhuǎn)運體3型及神經(jīng)元核蛋白表達的影響[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1(1):11-15.