超臨界CO2萃取杜仲葉總黃酮工藝研究

◎王華芳

（三門峽職業(yè)技術學院食品園林學院，河南三門峽472000）

超臨界CO2萃取杜仲葉總黃酮工藝研究

◎王華芳

（三門峽職業(yè)技術學院食品園林學院，河南三門峽472000）

以杜仲葉為原料，研究了超臨界CO2萃取杜仲葉總黃酮的工藝條件，并以總黃酮提取率為指標，通過設計L9（33）正交試驗研究了萃取溫度、壓強和時間對超臨界CO2萃取杜仲葉總黃酮的影響。結果表明：三因素對提取率的影響順序為壓強＞溫度＞時間，最佳提取工藝條件為溫度50℃，壓強30MPa，時間120min。同時按照最佳工藝參數(shù)進行驗證提取，提取率高達10.55%。

超臨界CO2；萃取；杜仲葉；總黃酮

杜仲是一種名貴的中藥材，蘊含有豐富的天然活性物質，如木脂素類、多糖、有機酸、黃酮類化合物等，具有補肝腎，強筋骨，安胎，降壓等作用[1]。杜仲葉同杜仲皮成分基本一致，含有豐富的黃酮類化合物，該類物質是杜仲藥效的主要活性成分之一，具有擴張冠狀血管、促進血液循環(huán)、抗炎、抗病毒、抗癌、保肝利水、美容美發(fā)及祛斑等功效[2-5]，目前已經應用于功能性保健品的研發(fā)中。

河南省靈寶市是中國現(xiàn)存的杜仲的唯一原產地，杜仲資源相當豐富，占全世界杜仲產量的99.9%以上。目前三門峽市從事關于杜仲深加工開發(fā)利用的企業(yè)頗多，其研制開發(fā)的杜仲系列保健產品具有市場銷路好、經濟效益高等特點。但是，在前期調研中我們發(fā)現(xiàn)，這些企業(yè)科研技術上還存在杜仲資源利用率偏低、后期處理難度大等問題，因此本著服務地方企業(yè)科研需求的理念，我們嘗試尋求一種更高效、環(huán)保的技術來提高杜仲葉總黃酮萃取率。

目前關于杜仲有效物質的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、有機溶劑萃取法、微波提取法和超聲波輔助萃取[6-10]等。超臨界CO2流體萃取技術是近年來發(fā)展起來的一種新型萃取技術，具有提取率高、中藥有效成分不被破壞、操作溫度低，無有機溶劑殘留、工藝簡單等優(yōu)點，目前被廣泛應用在中草藥有機成分萃取研究中，如李作梅[11]等研究了其在竹葉中總黃酮的萃取技術。

筆者利用超臨界CO2萃取技術開展杜仲葉次生代謝物總黃酮提取研究,在實驗中，我們以總黃酮含量為考察指標，通過單因素和正交試驗，優(yōu)化杜仲葉中總黃酮提取工藝，確定了最佳工藝條件，為杜仲藥用資源的開發(fā)和利用提供實際參考價值。

1 實驗部分

1.1 實驗材料和試劑

杜仲葉采于河南省靈寶市，洗凈、烘干、粉碎過40目篩后備用；蘆丁標準品，中國藥品生物制品鑒定所；無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純；

1.2 主要儀器

FA604A電子天平，上海精天電子儀器有限公司；722型紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；超臨界CO2萃取儀HA120-50-01型超臨界萃取裝置；中興高速萬能粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱，上海滬升實驗儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 杜仲葉總黃酮的萃取

準確稱取粉碎后的杜仲葉原料10g放入萃取釜，將20mL無水乙醇夾帶劑泵入萃取釜中，設定溫度、壓力和萃取時間，通入CO2進行萃取，萃取結束后收集提取液，測定其總黃酮濃度。

以總黃酮含量為考察指標，設計單因素實驗，分別考察萃取溫度、萃取壓力和萃取時間對黃酮提取率的影響，同時，在單因素實驗的基礎上設計三因素三水平9次正交實驗，預測并驗證超臨界CO2流體萃取總黃酮的最佳工藝條件。

1.3.2 杜仲葉總黃酮含量的測定

本實驗采用分光光度法[12]測定總黃酮的含量，并計算其含量。

1.3.2.1 蘆丁標準曲線繪制

精密稱取20mg蘆丁標準品，以無水乙醇溶液定容于25mL容量瓶中,作為對照溶液。準確吸取標準品溶液1，2，3,4,5mL置于10mL容量瓶中，分別加入1mL5%的NaNO2溶液，1mL10%硝酸鋁溶液，4mL%NaOH溶液，以上三種溶液每一樣加入之后均搖勻靜置5min，最后用無水乙醇溶液定容至刻度線，混勻放置15min后，備用。對標液進行全波長掃描，找出最大吸收波長。以吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標，建立蘆丁標準曲線。

1.3.2.2 杜仲葉總黃酮含量計算

測量提取液吸光度值A，將其代入線性回歸方程，計算出總黃酮的濃度?？傸S酮物質的含量按下式計算：

其中Y為黃酮提取率，C為提取液中黃酮濃度mg/mL，V為提取液體積mL,W為原料重量mg。

2 結果與討論

2.1 測量波長選擇

以無水乙醇溶液為參比，對提取液進行全波長掃描，如圖1所示，吸光度值在波長505nm處有強烈吸收，且峰形平緩，符合最大吸收波長選擇的條件，因此選擇505nm為測量波長。

2.2 標準曲線繪制

以無水乙醇溶液參比，按照1.3.2.1方法配制系列不同濃度的蘆丁溶液，并測量其吸光度值，同時以吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標，建立蘆丁標準曲線，見下圖2，擬合線性回歸方程為：A= 0.6841?C+0.1881，R2=0.9939，線性關系良好。

2.3 單因素實驗

2.3.1 萃取溫度對提取率的影響

準確稱取10g杜仲葉粉末5份，分別加入20mL無水乙醇夾帶劑，設定壓力30MPa,萃取時間90min，分別考察溫度在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的萃取率。

由圖3可知，當壓強和萃取時間固定后，隨著溫度的升高，提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且在55℃下達到最高值，這可能是隨著溫度的升高，黃酮溶解度增加，之后由于溫度過高，導致CO2流體密度降低所致，因此選擇55℃下萃取是比較合適的。

2.3.2 萃取壓力對提取率的影響

準確稱取10g杜仲葉粉末5份，分別加入20mL無水乙醇夾帶劑，設定溫度55℃,萃取時間90min，分別考察壓力在20MPa、25MPa、30MPa、35MPa、40MPa的萃取率，結果見圖4。

在20MPa～30MPa區(qū)間時，黃酮提取率隨著壓強的增大迅速上升，主要是由于壓力增大，CO2流體與溶質之間的滲透增大，有利于萃取。當壓強過高時，提取率增幅平緩，基本保持不變，這可能是由于高壓下CO2的可壓縮性小，進而無法增大其溶解力所致。另外，從設備安全性角度考慮，壓強也不能太高。因此，壓強取30MPa比較合適。

2.3.3 萃取時間對提取率的影響

準確稱取10g杜仲葉粉末5份，分別加入20mL無水乙醇夾帶劑，設定溫度55℃,壓力MPa，分別考察萃取時間在30min、60min、90min、120min、150min下的萃取率，結果見圖5。

由圖五可知，萃取時間對提取率影響顯著，隨著萃取時間的延長提取率顯著上升，這主要是增加了溶劑溶質接觸的時間，有利于萃取完全。但是當萃取時間超過一個小時后增幅減緩，可能是由于剩余杜仲葉中總黃酮較少，雜質較多，導致提取率減少，因此，從提高效率和節(jié)約資源的角度，選擇90min比較合適。

圖1 蘆丁全波長掃描曲線

圖2 標準曲線八繪制

圖3 溫度對總黃酮提取率的影響

圖4 萃取壓力對黃酮提取率的影響

圖5 萃取壓力對黃酮提取率的影響

2.4 正交及驗證實驗

在單因素實驗的基礎上，以總黃酮提取率為指標，選擇萃取溫度、壓強和時間三因素進行三水平9次試驗，找到最佳提取工藝條件,正交試驗因素水平表見表1，直觀分析表見表2。

由直觀分析表可知，三因素對提取率的影響順序為B＞A＞C，即壓強對提取率影響最大，其次是溫度，最后是時間，最佳提取工藝條件為A1B2C3，即萃取溫度50℃，萃取壓強30MPa,萃取時間120min。與單因素實驗相比較，壓強取值同單因素實驗一致，溫度由單因素實驗中的55℃降低到了50℃，而萃取時間則有90min延長到了120min,也就是說通過延長時間來彌補溫度降低所造成的提取率下降，這樣在保證提取率的前提下，不僅可以降低溫度過高對設備的損耗，還可以降低成本，完全有利于工業(yè)化生產。

按照正交優(yōu)化最佳實驗體系進行驗證試驗，測得總黃酮提取率為10.55%，是所有試驗中提取率最高的，進一步驗證了正交優(yōu)化實驗條件的可靠性。

表1 L9（33）正交試驗因素水平表

表2 L9（33）正交試驗直觀分析表

3 結論

通過單因素實驗和正交試驗可知，超臨界CO2萃取技術能夠很好地完成杜仲葉中總黃酮的提取，在萃取溫度50℃，萃取壓強30MPa,萃取時間120min的條件下，萃取效率最高。另外，由于超臨界CO2萃取過程主要靠流體與原料的充分接觸完成萃取，因此具有雜質少，無污染，后期處理方便等優(yōu)點，同時，通過簡單比較可知，其操作過程較傳統(tǒng)有機提取方法簡單的多，因此，超臨界CO2萃取技術可以作為替代傳統(tǒng)有機萃取方法應用于杜仲葉總黃酮的工藝提取中。

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（責任編輯 卞建寧）

Extraction of total Flavonoids from Eucommia Ulmoid leaves by Supercritical Fluids CO2

WANG Hua-fang
(College of Food Garden,Sanmenxia Polytechnic，Sanmenxia 472000,China)

Studied the extraction technological conditions of the supercritical fluids CO2in Eucommia ulmoide leaves.Then with the the extraction rate of total flavonoids as the index,through the design of L9(33)orthogonal test to research the effects of three factors for the extraction rate.The result showed that the effect order is the press highest,then is temperature,and the time is lowest.And the optimum extraction conditions as follows the press 30MPa,the temperature 50℃and the time 120min.In the optimum extraction conditions,the extraction rate is 10.55%.

Supercritical CO2;Extraction;Leaves of eucommia ulmoides;Total flavonoids

TS201.1

A

1671-9123（2015）02-0132-05

2015-01-29

王華芳（1982-），女，河北邯鄲人，三門峽職業(yè)技術學院食品園林學院講師。