不同劑量嗅鞘細(xì)胞靜脈移植修復(fù)脊髓損傷的實驗研究

王 強 于 霞 魏開斌 李 軍 劉雨亮 張文正

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院，1.脊柱關(guān)節(jié)外科;2.核醫(yī)學(xué)科，山東泰安271000)

不同劑量嗅鞘細(xì)胞靜脈移植修復(fù)脊髓損傷的實驗研究

王 強1于 霞2魏開斌1李 軍1劉雨亮1張文正1

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院，1.脊柱關(guān)節(jié)外科;2.核醫(yī)學(xué)科，山東泰安271000)

目的研究和探討嗅鞘細(xì)胞靜脈移植修復(fù)脊髓損傷的療效與移植劑量的關(guān)系，探求較佳的靜脈移植劑量。方法制備Wistar大鼠T10脊髓左側(cè)半切模型，隨機分成五組:嗅鞘細(xì)胞大劑量移植組(A組)、嗅鞘細(xì)胞中劑量移植組(B組)、嗅鞘細(xì)胞小劑量移植組(C組)、培養(yǎng)液D/F12移植組(D組)、空白對照組(E組)。定期行大鼠神經(jīng)功能評價及組織形態(tài)學(xué)觀察，評價脊髓恢復(fù)情況。結(jié)果A、B組神經(jīng)功能恢復(fù)和組織學(xué)改變與C、D、E組有顯著差別(P＜0.05);C組與D、E組間雖有差別(P＜0.05)，但是其差別較小;A、B組之間無顯著差別(P＞0.05);D、E兩組無顯著差別(P＞0.05)。結(jié)論嗅鞘細(xì)胞靜脈移植對修復(fù)脊髓損傷有一定的療效，其療效與移植劑量在一定范圍內(nèi)存在正向關(guān)系。細(xì)胞移植的較佳劑量為2×106，低于此劑量則不能達(dá)到良好的療效，多于此劑量，療效無明顯提高。此種移植方式既使操作簡單容易，又具有較好的療效，并且可以重復(fù)多次進(jìn)行，具有良好的臨床推廣和應(yīng)用價值。

嗅鞘細(xì)胞;脊髓損傷;靜脈移植;不同劑量;療效

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種臨床上常見的高致殘性疾病，同時也是臨床疑難病之一，其治療困難，方法不一，研究［1－6］發(fā)現(xiàn)，嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells，OECs)移植能夠促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)和軸突再生，被認(rèn)為是治療脊髓損傷最有前景的細(xì)胞之一。研究證實嗅鞘細(xì)胞靜脈移植對治療急性脊髓損傷有一定的療效，本實驗通過不同劑量嗅鞘細(xì)胞靜脈移植，研究大鼠急性脊髓損傷修復(fù)療效與嗅鞘細(xì)胞靜脈移植劑量的關(guān)系，探求最佳靜脈移植劑量。

1 材料與方法

1.1 實驗動物3月齡健康成年Wistar大鼠，雌雄不限，清潔級，體重200～250 g。

1.2 嗅鞘細(xì)胞的培養(yǎng)、純化以及鑒定應(yīng)用改良Nash差速貼壁法和Ara-c抑制法相結(jié)合的方法進(jìn)行OECs的培養(yǎng)、純化及鑒定。用終濃度為10 μg/ml的雙苯亞甲胺進(jìn)行OECs細(xì)胞核染色標(biāo)記，收集細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml、1×107/ml、1× 108/ml備移植用。

1.3 動物模型的制備以及分組制備T10脊髓左側(cè)半切模型。隨機分成5組:嗅鞘細(xì)胞大劑量靜脈移植組(A組)、嗅鞘細(xì)胞中劑量靜脈移植組(B組)、嗅鞘細(xì)胞小劑量靜脈移植組(C組)、培養(yǎng)液D/F12靜脈移植組(D組)、空白對照組(E組)，每組各10只。A組:微量注射器經(jīng)尾靜脈緩慢推入200 μl嗅鞘細(xì)胞懸液(細(xì)胞量約為2×107)，立即沖管注入生理鹽水0.1 ml，壓迫止血1分鐘;B組:同A組方法推入200 μl嗅鞘細(xì)胞懸液(細(xì)胞量約2× 106);C組:同A組方法推入200 μl嗅鞘細(xì)胞懸液(細(xì)胞量約2×105);D組:同A組方法推入200 μl細(xì)胞培養(yǎng)液D/F12;E組:不做任何移植，只做模型處理。

術(shù)后護(hù)理:保持室溫在20～25℃，并保持通風(fēng)，保持籠具衛(wèi)生清潔干燥，每只大鼠單籠喂養(yǎng);術(shù)后肌注青霉素5天，手術(shù)刀口每天換藥2次，預(yù)防感染;每天擠壓膀胱排尿2次，直到膀胱功能恢復(fù);每天定時翻身2～3次，預(yù)防褥瘡發(fā)生。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 分別于術(shù)后第1d、1w、2w、3w、4w、6w、8w、10w，根據(jù)改良CBS評分法對每組大鼠進(jìn)行后肢運動、感覺功能評分，評估脊髓功能恢復(fù)情況。運動、感覺功能從完全喪失到正常用0～100分表示:100分－完全喪失，0分－正常。

1.4.2 組織形態(tài)學(xué)觀察移植術(shù)后4、10周，分別于各組隨機抽取大鼠進(jìn)行脊髓組織的取材、切片。以T10為中心，完整取出長約2 cm的脊髓組織，觀察其大體特征(連續(xù)性、瘢痕增生、與周圍組織的粘連程度等)。立即行冰凍縱軸切片，片厚5 μm，在熒光顯微鏡下觀察OECs存活情況。石蠟切片進(jìn)行HE染色、嗜銀染色，觀察脊髓損傷區(qū)域瘢痕增生以及神經(jīng)纖維再生情況，神經(jīng)生長因子受體(NGFR p75)免疫組化染色檢測OECs在SCI區(qū)域的存活、分布等。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間比較采用方差分析，不同周次間數(shù)據(jù)的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，相對數(shù)的比較采用χ2檢驗。P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植術(shù)后不同時段CBS評分結(jié)果移植術(shù)后1d、1w各組評分結(jié)果沒有明顯差異(P＞0.05);從第2周開始到第8周，A組、B組和D組、E組、C組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。C組與D、E組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);A、B兩組之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);D、E兩組之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 術(shù)后各組大鼠CBS評分分析結(jié)果(n=10)

2.2 大體標(biāo)本觀察第4周時，脊髓組織損傷處硬脊膜完整，由不透明的白色組織覆蓋，脊髓組織水腫，但不很嚴(yán)重，有瘢痕形成，無明顯炎性反應(yīng)，與椎管內(nèi)周圍組織粘連較重，需銳性剝離，損傷處較脊髓正常部位稍粗;第10周時，損傷處硬脊膜完整，仍然可以看到損傷處由不透明的白色組織覆蓋，脊髓組織無明顯水腫及明顯炎性反應(yīng)，有瘢痕形成，但瘢痕攣縮軟化，與椎管內(nèi)周圍組織粘連較輕，相對容易剝離，脊髓組織損傷部位較脊髓正常組織部位變細(xì)。

2.3 組織學(xué)觀察

2.3.1 HE染色第4周時，損傷部位有多量膠質(zhì)細(xì)胞增生，形成瘢痕組織，局部有囊腔形成，可以見到少量軸突再生，再生的軸突纖維方向不一致，結(jié)構(gòu)相對雜亂。A、B組較D、E組可見較多量的再生軸突，組織修復(fù)較好，D、E組僅見到少量零亂的軸突; C組修復(fù)優(yōu)于D、E兩組，但較A、B兩組差;10周時，各組都有組織修復(fù)，A、B組可見到軸突再生數(shù)量增多，明顯多于D組、E組，且軸突明顯較4周時增粗，脊髓斷端以遠(yuǎn)軸突逐漸變細(xì)，相對變直，沿脊髓縱軸向遠(yuǎn)端生長，排列相對較一致，有新生軸突能夠跨過損傷區(qū)域與遠(yuǎn)端橋接，并且瘢痕組織少于E組、D組;D、E組僅見到少量零亂的軸突，C組修復(fù)較D、E兩組好，但是較A、B兩組差;而D、E組修復(fù)較A、B組差，仍有大量瘢痕組織，極少量軸突再生，但排列較紊亂，方向性差，尚未跨越過損傷區(qū)。

2.3.2 嗜銀染色第4周時，A、B組可見少量再生的神經(jīng)纖維軸突，并且新生軸突迂曲，較雜亂，沒有一致的方向性，再生的纖維數(shù)量較D、E、C組多，D、E、C組中可以看到更少量零亂的神經(jīng)纖維軸突，方向更加雜亂無章;10周時，A、B組可以看到較多量的神經(jīng)纖維軸突再生，并且迂曲減輕，方向性相對較一致，大體均向損傷部位沿著脊髓縱軸方向生長，有部分軸突能夠通過脊髓損傷部位與遠(yuǎn)端形成橋接(圖1，2)，而E、D組明顯差于A組和B組，僅有極少量纖維增生，并且軸突不能夠通過脊髓損傷部位。

圖1 B組4周軸突再生銀染×200

圖2 A組10周軸突再生銀染×200

2.3.3 雙苯亞甲胺Hoechst熒光檢測分別于4w、10w取脊髓組織做快速冰凍切片，觀察發(fā)現(xiàn):4周時在細(xì)胞移植組可見到標(biāo)記的嗅鞘細(xì)胞，發(fā)出淡藍(lán)色熒光，聚集在脊髓損傷部位，遠(yuǎn)離損傷部位的正常脊髓組織沒有藍(lán)色熒光出現(xiàn)。A、B兩組藍(lán)色熒光數(shù)量較C組多，說明移植后的嗅鞘細(xì)胞向脊髓損傷部位聚集，4周后仍能夠存活。第10周時冰凍切片熒光顯微鏡下未檢測到熒光，說明嗅鞘細(xì)胞可能已經(jīng)死亡。D、E組未檢測到藍(lán)色熒光。

2.3.4 NGFR p75免疫組化染色觀察A、B、C組在細(xì)胞移植后4周可見到多量的陽性染色(棕黃色)區(qū)域(圖3)，距離損傷部位越近的區(qū)域較明顯，并且隨著距離的增大陽性染色逐漸減弱，而損傷區(qū)域以遠(yuǎn)的正常脊髓組織未見陽性染色，說明嗅鞘細(xì)胞能夠遷移到脊髓損傷部位，并且4周后能夠在脊髓損傷部位存活，分布于脊髓損傷部位。移植術(shù)后10周時候未看到陽性染色;而D、E組在4周和10周時均未觀察到有陽性染色。

圖3 B組4周p75陽性染色(棕黃色)×100

3 討論

脊髓損傷多是由于脊柱的穩(wěn)定性遭到破壞引起，受到損傷的脊髓組織會出現(xiàn)水腫，循環(huán)障礙，血液供應(yīng)減少，引起一系列的級聯(lián)反應(yīng)，形成惡性循環(huán)［7－8］。神經(jīng)損傷后難以再生，從而導(dǎo)致神經(jīng)功能的完全或者部分喪失，往往會造成癱瘓等嚴(yán)重的后果，其修復(fù)在以往被認(rèn)為是難以攻破的。

本實驗發(fā)現(xiàn):嗅鞘細(xì)胞靜脈移植能夠促進(jìn)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)。從CBS評分可以看出，移植術(shù)后2周A、B組CBS評分明顯低于C、D、E組，有顯著性差異(P＜0.05)，C組評分稍低于D、E組，雖有差異(P＜0.05)，但是其均數(shù)差異較小，這說明A、B組對大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)有較好的療效，C組雖有療效，但是療效較A、B差。本實驗證實了OECs靜脈移植治療SCI的療效，并對其修復(fù)機制進(jìn)行了一定的探討，其可能是通過以下機制發(fā)揮作用:①脊髓損傷后，損傷部位的血-脊髓屏障遭到破壞，局部毛細(xì)血管的通透性增加，靜脈移植的嗅鞘細(xì)胞進(jìn)入損傷部位并生長繁殖發(fā)揮作用;②脊髓損傷后局部各種細(xì)胞因子以及趨化因子增多，血液中的嗅鞘細(xì)胞受到趨化作用向脊髓損傷部位遷移;③脊髓損傷后引起一系列炎癥反應(yīng)，多種炎癥因子以及免疫分子增多，如TNF-α、IL-1β等，嗅鞘細(xì)胞有一定的免疫原性同時表達(dá)粘附分子，有利于嗅鞘細(xì)胞向損傷部位遷移聚集;④脊髓損傷后，局部微循環(huán)遭到破壞，血流速度減慢，為嗅鞘細(xì)胞進(jìn)入脊髓損傷部位提供了條件;⑤到達(dá)損傷部位的嗅鞘細(xì)胞能夠抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及活化，并能夠誘導(dǎo)其分泌腦源性以及膠質(zhì)源性神經(jīng)生長因子，改善局部微循環(huán)，減輕局部炎性反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)纖維軸突再生;⑥嗅鞘細(xì)胞獨特的成鞘作用能夠促進(jìn)軸突生長、延伸并且包裹軸突，使新生軸突重新髓鞘化，保護(hù)新生軸突與外界膠質(zhì)環(huán)境相隔絕，為其生長提供良好的微環(huán)境，同時幫助神經(jīng)纖維軸突穿過膠質(zhì)瘢痕形成神經(jīng)膠質(zhì)橋［9］，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù);⑦刺激其它保護(hù)和修復(fù)機制。

嗅鞘細(xì)胞移植后在脊髓損傷部位存活時間的長短關(guān)系到脊髓損傷后修復(fù)的療效，就是其存活時間的研究到目前為止沒有得出一致的結(jié)論:陳莉發(fā)等［10］研究發(fā)現(xiàn)，將6×105個嗅鞘細(xì)胞移植到脊髓損傷后的T10節(jié)段處，檢測發(fā)現(xiàn)移植的嗅鞘細(xì)胞能夠存活4周以上，但是小于8周;也有研究發(fā)現(xiàn)，移植的嗅鞘細(xì)胞可在宿主體內(nèi)長期存活，最長能夠存活7個月。本實驗將經(jīng)雙苯亞甲胺(Hoechest)標(biāo)記的嗅鞘細(xì)胞通過靜脈移植到脊髓損傷的大鼠體內(nèi)，4周后在熒光顯微鏡下檢測到有淡藍(lán)色的發(fā)光顆粒(雙苯亞甲胺標(biāo)記的嗅鞘細(xì)胞核)，通過NGFR p75 (嗅鞘細(xì)胞的特異性抗體)免疫組織化學(xué)染色檢測發(fā)現(xiàn)陽性黃染區(qū)域，表明有嗅鞘細(xì)胞存活。10周時，鏡下未檢測到藍(lán)色熒光顆粒，NGFR p75免疫組化染色也未發(fā)現(xiàn)陽性染色，說明移植的嗅鞘細(xì)胞可能已經(jīng)死亡。這與陳莉發(fā)的實驗研究結(jié)論相似。嗅鞘細(xì)胞通過不同移植方式治療脊髓損傷均取得了一定的療效。任繼鑫等將2.5×105個嗅鞘細(xì)胞局部移植注射到脊髓挫傷加橫斷的部位，發(fā)現(xiàn)具有明顯的促進(jìn)神經(jīng)纖維再生和功能恢復(fù)的作用;魏開斌等［11］將3.5×105個嗅鞘細(xì)胞懸液以及嗅球組織塊局部移植到大鼠脊髓半切損傷模型脊髓損傷部位，兩周后大鼠后肢功能開始恢復(fù)，10周時組織學(xué)觀察，再生軸突方向基本上與正常神經(jīng)纖維較一致，且有大量的再生軸突跨過損傷區(qū)域，大鼠的神經(jīng)功能均有明顯的恢復(fù)。本實驗通過2×105、2×106、2× 107不同劑量嗅鞘細(xì)胞靜脈移植治療急性脊髓損傷，觀察和分析發(fā)現(xiàn):細(xì)胞移植組對脊髓損傷修復(fù)均有一定的療效，以A、B組明顯，但A、B組之間無差異(P＞0.05)，C組療效較A、B組差，從第2周開始，A、B組CBS評分明顯低于其它組，與C、D、E組存在顯著差異(P＜0.05)。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，A、B組脊髓組損傷部位再生神經(jīng)纖維軸突明顯增多，這與CBS評分結(jié)果相一致。嗅鞘細(xì)胞中劑量與大劑量移植有較明顯的療效，小劑量組療效不是很明顯，說明靜脈移植嗅鞘細(xì)胞只有達(dá)到一定的劑量才能夠獲得較好的療效，嗅鞘細(xì)胞的移植劑量不足則療效不佳，D、E組無顯著差異，說明培養(yǎng)液對脊髓損傷無治療作用，進(jìn)一步證實了OECs的修復(fù)作用。

本實驗可以說明，嗅鞘細(xì)胞靜脈移植治療急性脊髓損傷能夠促進(jìn)受損神經(jīng)軸突再生，促進(jìn)大鼠后肢功能恢復(fù)。嗅鞘細(xì)胞靜脈移植的較佳劑量是2× 106，只有移植細(xì)胞量達(dá)到此數(shù)值，脊髓損傷恢復(fù)才有較好的療效，低于此劑量則不能取得良好的療效，劑量再大未發(fā)現(xiàn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)有大的提高。A組移植劑量是B組的10倍，其療效相似，沒有顯著差異;而C組劑量是B組的1/10，其療效明顯差，與B組差異有統(tǒng)計學(xué)。臨床上OECs來源較少，細(xì)胞珍貴，就移植OECs劑量與獲得良好療效而言，2× 106是較佳的劑量，既能夠達(dá)到較好的療效，又不造成細(xì)胞的浪費。嗅鞘細(xì)胞靜脈移植對急性脊髓損傷雖然有一定的療效，但不能使其完全恢復(fù)，能否多次重復(fù)移植，以及重復(fù)多次移植的療效如何等，這些問題還有待于進(jìn)一步研究證實。

［1］姜復(fù)齡，何佳.純化的大鼠嗅鞘細(xì)胞在大鼠脊髓損傷中的修復(fù)作用［J］.局解手術(shù)學(xué)雜志，2013，22:4，359－361.

［2］Weikaibin，Liuyuliang.Vein transplantion of olfactory ensheathing cells for spinal cord injury［J］.Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2011，15(27):5021－5025.

［3］李軍.不同劑量嗅鞘細(xì)胞蛛網(wǎng)膜下腔移植修復(fù)脊髓損傷的實驗研究［J］.中國脊柱脊髓損傷雜志，2011，11(21):929－933.

［4］葉超群，孫天勝，高爾鏡，等.不同方法共移植的嗅鞘細(xì)胞和雪旺氏細(xì)胞在損傷脊髓內(nèi)的遷移和對軸突再生的影響［J］.中國脊柱脊髓雜志，2010，20(2):138－145.

［5］袁夢郎，咼金海，楊拯，等.基因修飾嗅鞘細(xì)胞治療脊髓損傷研究:可能成為首要的選擇［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(44):8308－8309.

［6］Puwei Yuan，Xijing He，Guoyu Wang，et al.Olfactory ensheathing cell transplantation and inhibition of NogoA，NgR and RhoA expression in the damaged zone to ameliorate spinal cord injury［J］.N Regeneration Research，2010，5(13):999－1003.

［7］鞠躬.神經(jīng)生物學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009.

［8］Beattie MS，Hermann GE，Rogers RC，et al.Cell death in models of S-pinal cord injury［J］.Prog Brain Res，2009，137:37－47.

［9］袁普衛(wèi)，賀西京，王國毓，等.嗅鞘細(xì)胞移植對脊髓損傷區(qū)勿動蛋白表達(dá)的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，12 (38):7522－7524.

［10］陳莉發(fā)，段朝霞.嗅鞘細(xì)胞移植到損傷脊髓存活時間的研究［J］.成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，5(3):190－193

［11］魏開斌.嗅球組織塊和細(xì)胞懸液移植對脊髓損傷的修復(fù)［J］.中華實驗外科雜志，2008，3(22):359－360.

Repair of rat spinal cord injury by vein transplantation of different doses of Olfactory Ensheathing cells

WANG Qiang1YU Xia2WEI Kai-bin1LI Jun1LIU Yu-liang1ZHANG Wen-zheng1
(1.Dept.of Orthopaedics，Central Hospital of Taian;2.Dept.of Nuclear Medicine，Central Hospital of Taian，Taian 271000，China)

Objective:To compare the efficacy of different doses of olfactory ensheathing cells vein transplantation for treatment of acute spinal cord injury，and the correlation between dose and efficacy.Methods:The Wistar rat model was prepared by the left T10 spinal cord hemisection.The rats were randomly divided into five groups:high-dose of olfactory ensheathing cells vein transplantation group(group A)，intermediate-dose of olfactory ensheathing cells vein transplantation group(group B)，low-dose of olfactory ensheathing cells vein transplantation group(group C)，the culture medium D/F12 vein transplantation group(group D)，the blank control group(group E).The spinal cord restoration was evaluated by the neurological function with a modified CBS score system and histological examination.Results:There was significant difference between group A/B and group C/D/E for the neurological recovery and histological changes(P＜0.05);There was difference between C and D/E，but it was little.There was no significant difference between group D and group E(P＞0.05);with no difference between group A and group B(P＞0.05).Conclusion:The transplantation of olfactory ensheathing cells by vein has a certain effect on treating SCI，and there is a certain positive relationship between the efficacy and transplant dose.The appropriate dose is 2×106，a less dose can not achieve a good effect，and there is no significant improvement with higher dose.This method is simply and easily-operated and it has a good perspective for clinical practice and application.

olfactory ensheathing cells;spinal cord injury;vein transplantation;different doses;efficacy

R826.64

A

1004-7115(2015)05-0494-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.05.004

2015-01-06)

王強(1981－)，男，山東萊蕪人，主要從事脊柱及脊髓損傷診治工作。

魏開斌，E-mail:wkb1966@163.com。