232例終末期腎功能衰竭患者HLA基因多態(tài)性分析

熊莉，孫瑜，肖莉，吳紅，李國良

(江西省血液中心，江西 南昌330052)

終末期腎功能衰竭(ESRD)是各類原發(fā)的或繼發(fā)的腎臟疾病發(fā)展到晚期的共同結(jié)果。有研究報道[1]HLA在ESRD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。國外一些腎移植中心通過對ESRD患者HLA多態(tài)性的分析研究，認(rèn)為HLA的表達及其多態(tài)性對腎臟疾病患者最終并發(fā)ESRD存在免疫遺傳易感性和相對風(fēng)險性。本研究對等待腎移植的232例江西籍漢族ESRD患者及2210例中國造血干細(xì)胞庫江西籍漢族志愿捐獻者的HLA基因分型進行比較，分析探討終末期腎功能衰竭與HLA基因的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 病例組：2012-2013年在我中心做器官配型的江西籍終末期腎功能衰竭患者232例，均為漢族。男118例，女115例，年齡18~62歲，對照組：程良紅等[2]研究的江西籍漢族骨髓供者2210例，性別、年齡與病例組相當(dāng)。

1.2 基因組DNA提取 取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，用Texas基因組DNA抽提試劑盒分離獲得，-20℃保存待用。。

1.3 HLA基因分型 運用序列特異性引物聚合酶鏈法，采用美國Texas Biogene公司試劑盒進行檢測，具體操作按照說明書。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 19.0軟件計算基因頻率及其風(fēng)險關(guān)聯(lián)系數(shù)(RR)、χ2和P值。若RR＞1，則認(rèn)為該位點是疾病發(fā)生的危險因素；若RR＜1，則認(rèn)為該位點在疾病發(fā)生過程中起保護作用。若RR=1，則表示該位點與疾病發(fā)生無相關(guān)性。HLA基因頻率(GF)采用直接計數(shù)法，選擇HLA抗原特異性作為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 HLA-A位點基因頻率 病例組HLA-A等位基因中，前 3 位依次是 A*11、A*02、A*24，對照組HLA-A等位基因中，前3位依次是A*02、A*11、A*24。HLA-A*11的基因頻率病例組顯著高于對照組(P<0.05)；HLA-A*31、A*33的基因頻率病例組顯著低于對照組(P<0.05)，其他組別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 病例組與對照組HLA-A基因位點分析

2.2 HLA-B位點基因頻率 病例組HLA-B等位基因中，前 3 位依次是 B*40、B*15、B*46，對照組HLA-B等位基因中，前3位依次是B*40、B*46、B*15。HLA-B*53、B*55的基因頻率病例組顯著高于對照組 (P<0.05)；HLA-B*58的基因頻率病例組顯著低于對照組(P<0.05)，其他組別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 病例組與對照組HLA-B基因位點分析

2.3HLA-DRB1位點基因頻率 病例組HLADRB1等位基因中，前 4位依次是DRB1*04、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*15， 對 照 組 HLADRB1等位基因中，前 4位依次是DRB1*09、DRB1*12、DRB1*15、DRB1*04。HLA-DRB1*04 的基因頻率病例組顯著高于對照組(P<0.05)，其他組別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 HLA基因與ESRD的發(fā)生風(fēng)險 病例組較對照組HLA基因頻率顯著升高的有A*11、B*53、B*55、DRB1*04，相對危險率均大于 1(RR>1)；病例組較對照組HLA基因頻率顯著降低的有A*31、A*33、B*58，相對危險率均小于1(RR<1)。根據(jù)MH卡方檢驗，只有HLA-B*53在病例組與對照組中有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示HLA-B*53可能是終末期腎功能衰竭的易感基因。見表4。

表3 病例組與對照組HLA-DRB1基因位點分析

表4 HLA基因與ESRD的發(fā)生風(fēng)險分析

3 討論

HLA是控制機體免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)的重要系統(tǒng)，是人類發(fā)現(xiàn)的第一個與疾病有明確關(guān)聯(lián)的遺傳系統(tǒng)[3]。腎臟疾病患者并發(fā)終末期腎功能衰竭的發(fā)病機制尚未明了，一般認(rèn)為多數(shù)是由免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)所致。據(jù)1998年統(tǒng)計，HLA與腎臟疾病的關(guān)聯(lián)主要涉及7種疾病，相關(guān)聯(lián)的HLA抗原達18種，它們在腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起重要作用[4]。

有關(guān)HLA等位基因與腎臟疾病相關(guān)性的研究國內(nèi)外已有報道，但由于地域、人種、樣本大小及研究方法的不同，各家報道結(jié)果也不同。KARAHAN等[5]報道土耳其587例不同原發(fā)病最終并發(fā)終末期腎功能衰竭患者高表達HLA-B*58和HLA-DRB1*03，并認(rèn)為易感基因的確定可能對延緩腎臟疾病向終末期腎病進展和預(yù)防移植后原發(fā)病再發(fā)的研究有重要意義。CRISPIM等[6]報道105例巴西籍等候腎移植的終末期腎功能衰竭患者HLA-A*78、HLA-DRB1*11抗原頻率顯著增加，HLA-B*14顯著減少，提示HLA-A*78、DRB1*11可能是巴西籍腎臟疾病患者并發(fā)ESRD的易感基因。PEYMAN PD[7]等報道阿塞拜疆尿毒癥患者HLA-A*1l、HLA-A*33和 HLA-B*49抗原頻率與健康對照組相比顯著升高，并指出攜帶易感基因的阿塞拜疆終末期腎病患者預(yù)后較差。劉偉等[8]研究發(fā)現(xiàn) HLA-A*03、A*23、A*26、B*08、B*50、DRB1*04、DRB1*10對終末期腎功能衰竭患者有遺傳易感性，HLA-A*01、A*11、B*13、B*46、DRB1*15、DQB1*09 則是這類患者的保護基因。HLA基因的地域差異性不僅表現(xiàn)在ESRD患者當(dāng)中，其他疾病也有類似報道[9]。

本研究對232例江西籍漢族終末期腎功能衰竭患者以及2210例健康無血緣關(guān)系的江西籍漢族造血干細(xì)胞志愿捐獻者進行HLA-A/B/DRBl基因分型，結(jié)果提示：病例組HLA-A*11、B*53、B*55、DRB1*04基因頻率明顯高于對照組，病例組HLA-A*31、A*33、B*58基因頻率明顯低于對照組(P<0.05)。本研究的結(jié)論與以往存在差異，這表明HLA與ESRD的關(guān)聯(lián)性存在人群和地域特異性，因此，對不同地域的人群應(yīng)作具體分析，不能將一個人群的研究結(jié)果直接應(yīng)用于其他人群。

病例組中基因頻率較高的分別為HLAA*11、A*02、A*24； B*40、B*15、B*46；DRB1*04、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*15；其基因頻率均大于10%。與本地區(qū)健康人群基因頻率基本一致，因此，具有此類基因的患者在本地區(qū)找到合適的供體機會較大。

在研究HLA與疾病關(guān)系的文獻中，部分作者僅根據(jù)病例組和對照組的HLA基因頻率分布差異，計算出χ2值有統(tǒng)計學(xué)意義，就得出“易感基因”或“保護基因”的結(jié)論。筆者認(rèn)為這種推斷有失嚴(yán)謹(jǐn)，因為該χ2值的大小取決于HLA基因頻率的大小和樣本數(shù)量，它不能作為關(guān)聯(lián)強度的量度。因此我們還需引進相對危險率 (RR)，即表示攜帶某HLA基因的個體發(fā)生ESRD的危險性是不攜帶該基因個體發(fā)生ESRD危險性的多少倍。只有RR的顯著性檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義，才可能推論該基因位點是否與疾病有關(guān)聯(lián)性。本研究資料中，雖然根據(jù)χ2值 ，HLA-A*11、A*31、A*33、B*53、B*55、B*58和DRB1*04在病例組和對照組中的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，但是根據(jù)MH卡方檢驗，只能提示HLAB*53才可能是ESRD的易感基因。

由于病例組抽樣人數(shù)有限，因此與對照組比較，病例組檢出的等位基因數(shù)量偏少；另外，這種規(guī)模的樣本計算低頻基因往往誤差較大；而且頻率越小，誤差越大，劉楠等[10]發(fā)現(xiàn)頻率小于5%的等位基因，誤差往往會超過頻率的20%。HLA-B*53基因頻率為0.43%，屬于低頻基因。筆者認(rèn)為不可簡單的將其定義為“易感基因”。綜合統(tǒng)計分析的結(jié)果，我們最終認(rèn)為終末期腎功能衰竭與HLA無明顯相關(guān)性。

綜上所述，了解HLA與ESRD的遺傳相關(guān)性，不僅可為慢性腎病患者提供估計預(yù)后的指標(biāo)，而且還能為等待腎移植的ESRD患者的供體選擇提供參數(shù)，降低腎移植的風(fēng)險。并且能對ESRD的輔助診斷、分類及制定防治措施等提供依據(jù)。因此，擴大病例組樣本數(shù)量以及對導(dǎo)致ESRD的病因進行系統(tǒng)分類，是后續(xù)研究中亟需完善的工作。

[1]Franco C,Yoo W,Franco D,et a1.Predictors of end stage renal disease in African Americans with lupus nephritis[J].Bull NYU Hosp Jt Dis,2010，68(4):251-256.

[2]程良紅,吳國光,李興茂等.2210例江西籍漢族骨髓供者的HLAA、B、DRB1等位基因和單倍型頻率[J].臨床輸血與檢驗,2012,8(1):5-11.

[3]Caillat-Zucman S．Molecular mechanisms of HLA association with autoimmune diseases[J].Tissue Antigens,2009,73(1):1-8．

[4]Lehnhardt M,Muchlberger T,Kuhnen C,et al.Feasibility of chemise nsitivity testing in soft tissue sarcomas [J].World J Surg Oncol,2005,3(20):1-12．

[5]Karahan GE,Seyhun Y,Oguz FS,et al.Impact of HLA on the underlying primary diseases in Turkish patients with end-stage renal disease[J].Ren Fail,2009,31(1):44-49．

[6]Crispim JC,Mendes-Junior CT,Wastowski IJ,et al.HLA polymorphisms as incidence factor in the progression to end-stage renal disease in Brazilian patients awaiting kidney transplant[J].Transplant Proc,2008,40(5):1333-1336．

[7]Peyman PD,Naser F,Mohammad N.Protective and susceptible HLA Class I gene in patients with End-stage renal failure[J].Res J Biol Sci.2008,3(11):1344-1346．

[8]劉偉,李代紅.腎移植與HLA基因多態(tài)性的相關(guān)性［J］.廣東醫(yī)學(xué),2013,34(9):1361-1364.

[9]楊寶成,王大明,高素青等.糖尿病視網(wǎng)膜病變與H LA-A、B和DRB1基因相關(guān)性的研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2008,26(3):242-244.

[10]劉楠,袁方,梁飛,等.人類白細(xì)胞抗原多態(tài)性與慢性腎功能衰竭的遺傳易感性研究[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2009,33(1):33-36.