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    腎移植術(shù)后血和尿中BKV、JCV的檢測及意義

    2015-06-05 08:40:00尚麗紅游瑞君武小桐王振興張文艷
    關(guān)鍵詞:離心管尿液定量

    尚麗紅,游瑞君,武小桐,王振興,張文艷

    (山西省第二人民醫(yī)院腎移植中心,山西 太原030012)

    多瘤病毒屬于乳多空病毒屬,其中BK病毒(BKV)和JC病毒(JCV)可以使人類致病。在腎移植病人,免疫功能低下[1-3],多瘤病毒的潛伏感染率較高。約有10%~60%的腎移植患者可再次激活多瘤病毒,但不影響腎功能;1%~10%的腎移植患者可發(fā)生多瘤病毒相關(guān)性腎病(Polyomavirus-associated nephropathy,PVAN)[4]。

    BKV是導(dǎo)致PVAN的主要原因[5],與JCV具有75%的序列同源性[6]。據(jù)報(bào)道[6],大約3%的JCV感染患者可導(dǎo)致PVAN的發(fā)生;但如果JCV與BKV同時(shí)發(fā)生感染的患者,PVAN發(fā)生的機(jī)率將上升到15%[7]。目前,尚無有效的抗病毒藥物。普遍的處理方法是恰當(dāng)?shù)卣{(diào)整免疫抑制劑的類型和用量以減少病毒的復(fù)制,但又增加引發(fā)排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,建立快速、有效的檢測方法,對PVAN的早期預(yù)測和診斷對腎移植患者預(yù)后有著重要的臨床意義。

    目前,常用的檢測方法[8,9]有:(1)尿液誘耳細(xì)胞(decoy細(xì)胞)細(xì)胞學(xué)檢測;(2)尿液、血液中PCR檢測DNA;(3)免疫組化檢查。近年來,人們推崇無創(chuàng)性檢測方法,即采用PCR檢測體液病毒DNA作為篩選。利用PCR方法檢測這兩種病毒具有更高的靈敏度和特異性,對監(jiān)測腎移植術(shù)后患者多瘤病毒的感染、及早發(fā)現(xiàn)和治療都具有指導(dǎo)作用。

    因此,本文利用熒光定量PCR(探針法)方法,檢測腎移植術(shù)后患者體內(nèi)的BKV和JCV含量,為患者的臨床診斷和治療方案提供重要依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象 分別收集山西省第二人民醫(yī)院腎移植中心2013年6月至2014年5月期間腎移植術(shù)后患者尿液標(biāo)本153例、血液標(biāo)本155例,其中男性92例,女性61例。所有患者自愿接受BKV、JCV病毒的檢測。

    1.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本和試劑 在患者行腎移植術(shù)后,收集尿液和血液。具體收集方法如下:(1)血漿樣本采集:用無菌注射器在受檢者手臂彎曲處或手背處抽取靜脈血3~5ml,注入含有EDTA的無菌收集管,立即輕輕顛倒混勻,室溫放置不超過4h,待樣本自行析出血漿或直接室溫1600rpm離心5min分離出血漿,轉(zhuǎn)移到1.5ml滅菌離心管中備用。(2)尿液樣本采集:留取中段晨尿10~20ml(不超過容器體積的2/3)密封送檢。(3)樣本保存:樣本應(yīng)盡快檢測,4℃保存不超過24h,-20℃條件下可以保存數(shù)月,-70℃條件下可以長期保存,但不可反復(fù)凍融。BK/JC病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購自于北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 DNA模板提取 (1)血漿或血清①在1.5ml離心管中加入100μl待測樣本,然后加入50μl濃縮液,振蕩15s混勻;②將上述離心管放入臺式離心機(jī),13000r/min離心10min后取出;③小心吸出150μl上清液(盡量吸干上清液,但不要觸及沉淀)并棄去,保留沉淀;④向離心管中分別加入25μl裂解液,然后用吸頭對準(zhǔn)沉淀所在位置,將其挑離管底,并吹洗5次(關(guān)鍵步驟);⑤振蕩15s將沉淀充分打散;⑥100℃條件下溫育10min;⑦13000r/min離心10min后將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管,該上清液即純化的DNA溶液。(2)尿液將尿液送檢管振蕩15s,徹底混勻(關(guān)鍵步驟);取其中 1ml至 1.5ml離心管中,13000r/min離心10min后棄去上清;加入50μl裂解液,然后用吸頭對準(zhǔn)沉淀所在位置,將其挑離管底,并吹洗5次(關(guān)鍵步驟);之后參照上述血漿或血清樣本操作5~7步驟。

    1.3.2 定量PCR檢測腎移植患者術(shù)后BKV和JCV感染 (1)試劑配制:確定反應(yīng)數(shù)N,N=待檢樣本數(shù)(n)+定量標(biāo)準(zhǔn)品(4)+陰性質(zhì)控品(1)+1。計(jì)算加到反應(yīng)混合物中的各個(gè)試劑的量,分別添加BKVPCR反 應(yīng) 液 8.5μl×N、BKV 酶 混 合 物 0.5μl×N、BKV PCR 增強(qiáng)劑 10μl×N、BKV 內(nèi)標(biāo)模板 1μl×N。 取無菌離心管配制反應(yīng)體系,試劑全部加入后振蕩15秒,2000r/min離心15s。然后將上述混合液 20μl/管分裝至PCR反應(yīng)管中。(2)PCR反應(yīng):分別取BKV/JCV陰性質(zhì)控品、已處理樣本和BKV定量標(biāo)準(zhǔn)品I~I(xiàn)V 5μl加入 PCR 反應(yīng)管中,蓋緊管蓋,2000r/min離心15s將管壁上的液體全部甩至管底,如有氣泡輕彈管壁將氣泡彈出,再次離心去除氣泡,然后立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。具體設(shè)置程序見表1。

    表1 PCR反應(yīng)條件和程序

    1.3.3 PCR數(shù)據(jù)分析 擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測目的片段,并分析熒光擴(kuò)增檢測結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 尿液和血液中BKV-DNA和JCV-DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測,結(jié)果見圖1。

    A BKV-DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

    圖1 尿液和血液中BKV、JCV的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

    2.2 尿液、血液中BKV-DNA和JCV-DNA定量檢測結(jié)果 BKV和JCV定量PCR檢測,用4個(gè)體外純化質(zhì)粒作為定量標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行PCR擴(kuò)增并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,且標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)|R|(|r|)均大于0.99。腎移植術(shù)后患者BKV和JCV檢測的最低檢測限為 2×103copies/ml, 線性檢測范圍為 5×103~5×108copies/ml。

    BKV-DNA在尿中的檢出率為33.3%(51/153),載量在 1.15×103~6.00×1011copies/ml之間, 血液中檢出率 為 34.8%(54/155), 載 量 在 1.3×103~6.06×105copies/ml之間。JCV-DNA在尿中的檢出率為31.3%(47/150),載量在 1.15×103~6.00×1011copies/ml之間,血液中檢出率為34.6%(54/156),載量在1.3×103~6.06×105copies/ml之間。發(fā)生病毒尿癥的中位時(shí)間為6.1月,發(fā)生病毒血癥的中位時(shí)間為4.9月。定量PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線,見圖2。

    圖2 尿液和血液中BKV-DNA、JCV-DNA的PCR擴(kuò)增曲線

    2.3 PCR方法的靈敏度和特異性 BKV尿液和血液樣本靈敏度分別為98.31%和99.22%,特異性分別為100%和99.79%;JCV尿液和血液樣本靈敏度分別為97.90%和98.60%,特異性均為100%。本檢測方法對BKV和JCV檢測具有較高的特異性和靈敏度。見表2。

    表2 BK病毒和JC病毒檢測試劑的靈敏度和特異性

    3 討論

    多瘤病毒屬乳多空病毒屬,目前已發(fā)現(xiàn)的多瘤病毒成員有13個(gè),其中BKV、JCV和SV40與人類有關(guān)。BKV可引起移植腎功能異常或喪失;JCV可引起進(jìn)行性多灶白質(zhì)腦病(PML);SV40則為猿類動物病毒。

    在腎移植患者,由多瘤病毒感染的臨床表現(xiàn)既可以是病毒尿癥,也可以是明顯的腎臟、泌尿系異常。如輸尿管狹窄、一過性移植腎功能異常、間質(zhì)性腎炎、出血性膀胱炎等,統(tǒng)稱為多瘤病毒相關(guān)性腎病 (Polyomavirus-associatednephropathy,PVAN)。10%~60%的腎移植患者在接受抗排斥治療程中有BKV感染 ,多見于術(shù)后3個(gè)月內(nèi)。國外資料顯示,腎移植術(shù)后44周可有約5%的病例發(fā)生PVAN。如無恰當(dāng)?shù)奶幚?,高達(dá)45%的病例在組織學(xué)確診后平均6個(gè)月轉(zhuǎn)變?yōu)橐浦材I失功。PVAN的發(fā)生可能與免疫抑制維持治療 (FK506,MMF及雷帕霉素)、腎小管上皮細(xì)胞損傷及再生、抗排斥治療等多因素密切相關(guān)。

    BK病毒(BKV)屬多瘤病毒家族成員,感染后多以潛伏狀態(tài)存在,當(dāng)宿主免疫功能低下時(shí)可重新激活。BK病毒原發(fā)感染發(fā)生在兒童時(shí)期,一般存在于人體泌尿道及外周血白細(xì)胞中,約0.5%~20%感染者會出現(xiàn)BKV激活,導(dǎo)致病毒復(fù)制,一般不會引起腎功能損害。但在接受免疫抑制治療的人群中,特別是腎移植術(shù)后患者,BKV再激活率會明顯增高,并可能導(dǎo)致BKV相關(guān)性腎病(BKV associated nephropathy,BKVAN)。 腎臟是健康人 BKV潛伏感染的主要部位,腎移植術(shù)后患者可在尿液中檢測到BKV,其中多數(shù)患者表現(xiàn)為無癥狀病毒血癥或暫時(shí)的移植腎功能異常,偶可在切除的移植腎標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)病毒引起的組織損傷。

    近年研究發(fā)現(xiàn),初次感染BKV后,BKV常潛伏于腎小管上皮細(xì)胞及尿路移行上皮細(xì)胞內(nèi),當(dāng)宿主免疫力下降時(shí),BKV可再次激活并開始迅速大量復(fù)制。腎移植術(shù)后患者BKV再次激活的發(fā)生率為10%-68%,約1%-7%的腎移植患者會出現(xiàn)BKVAN,其中50%會導(dǎo)致移植腎失功。

    BKV是導(dǎo)致PVAN的主要原因[5],與JCV具有75%的序列同源性。JCV可引起進(jìn)行性多灶白質(zhì)腦病(PML),還能在腎臟組織中復(fù)制,并通過尿液排出病毒。器官移植后,免疫抑制劑的使用是誘導(dǎo)多瘤病毒激活復(fù)制的重要原因,其中,40%以上的腎移植患者可檢測到JCV的復(fù)制。據(jù)報(bào)道[6],大約3%的JCV感染患者可導(dǎo)致PVAN的發(fā)生;但如果JCV與BKV同時(shí)發(fā)生感染的患者,PVAN發(fā)生的機(jī)率將上升到15%[7]。目前,尚無有效的抗病毒藥物。普遍的處理方法是恰當(dāng)?shù)卣{(diào)整免疫抑制劑的類型和用量以減少病毒的復(fù)制,但又增加引發(fā)排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,建立快速、有效的檢測方法,對PVAN的早期預(yù)測和診斷對腎移植患者預(yù)后有著重要的臨床意義。

    近年來,相對于其他又創(chuàng)性的檢測,人們更推崇無創(chuàng)性檢測方法,如采用PCR檢測血中病毒DNA。 Toyoda[10]和 Leung[11]等研究證明,BKV 定量PCR測定對于檢測BKV感染的發(fā)病過程非常有效,并建議聯(lián)系臨床現(xiàn)象和活檢所見判斷結(jié)果。PCR法檢測多瘤病毒的敏感性為100%,特異性為88%~95%[12,13],在組織學(xué)檢查的陰性而PCR陽性的病人最終約有半數(shù)以上病人發(fā)展為PVAN,在這期間具有數(shù)周到數(shù)月的窗口期[14]。尿PCR檢測的靈敏度和特異性更高,但由于誘耳細(xì)胞內(nèi)病毒包涵體可以是BKV或JCV[15],因此尿脫落細(xì)胞檢測不能作BKV或JCV的特異性分型。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法被認(rèn)為是一種檢測病毒載量敏感性較高的非侵入性檢查。在臨床上,對腎移植術(shù)后患者血液和尿液中多瘤病毒進(jìn)行定性、定量實(shí)時(shí)監(jiān)測,可作為腎移植術(shù)后BKV相關(guān)性腎病(BKVAN)和多瘤病毒相關(guān)性腎病(PVAN)的早期診斷和篩選的方法。

    據(jù)報(bào)道,腎移植受者Decoy細(xì)胞陽性率為29.4%~40.0%,病毒尿癥發(fā)生率為13.0%~34.7%,病毒血癥為5.0%~21.0%。其中病毒尿癥的發(fā)生率與本文檢測結(jié)果基因一致,而病毒血癥的發(fā)生率略高。BKV病毒血癥出現(xiàn)的原因可能有以下幾種:(1)腎小管上皮細(xì)胞的BKV激活后通過小管周的毛細(xì)管進(jìn)入血循環(huán)中;(2)血癥和尿癥是BKV在尿上皮細(xì)胞和外周單核細(xì)胞各自激活的結(jié)果,兩者相互伴隨發(fā)生;(3)BKV病毒尿癥至少在一定程度上是血癥的一個(gè)反映,血癥中的病毒經(jīng)過腎代謝進(jìn)入尿中BKVAN。血液中BKV的出現(xiàn)反映了BKVAN的發(fā)展過程。

    目前,關(guān)于多瘤病毒的研究報(bào)道很多[16],但對腎移植患者的BKV和JCV相關(guān)的PVAN、以及移植腎的免疫排斥之間相互作用的研究尚不清楚,相信在不久將來,這方面的研究會成為焦點(diǎn),為臨床治療不斷提供新的理論依據(jù)。

    [1]Crew RJ,Markowitz G,Radhakrishnan J.Therapeutic options in K virus-associated interstitial nephritis[J].Kidney Int,2006,70(2):399-402.

    [2]Randhawa P,Vats A,Shapiro R.Monitoring for polyomavirus BKand JC in urine:comparison of quantitative polymerase chain reaction with urine cytology[J].Transplantation,2005,79(8):984-986.

    [3]Kazory A,Ducloux D,Chalopin JM,et al.The first case of JC virus allograft nephropathy[J].Transplantation,2003,76(11):1653-1655.

    [4]Randhawa P,Brennan DC.BK virus infection in transplant recipients:an overview and update[J].Am J Transplant,2006,6(9):2000-2005.

    [5]Nickeleit V,Klimkait T,Binet IF,et al.Testing for polyomavirus type BK DNA in plasma to identify renal-allograft recipients with viral nephropathy[J].N Engl J Med,2000,342(18):1309-1315.

    [6]Singh D,Kiberd B,Alkhudair W,et al.Polyomavirus-induced hemorrhagic cystitis in renal transplantation patient with polyomavirus nephropathy[J].Urology,2006,67(2):423.e11-423.e12.

    [7]Nickeleit V,Hirsch HH,Binet IF,et al.Polyomavirus infection of renal allograft recipients:from latent infection to manifest disease[J].J Am Soc Nephrol,1999,10(5):1080-1089.

    [8]Bohl DL,Brennan DC,Ryschkewitsch C,et al.BK virus antibody titers and intensity of infections after renal transplantation[J].J Clin Virol,2008,43(2):184-189.

    [9]Nickeleit V,Klimkait T,Binet IF,et al.Testing for polyomavirus type BK DNA in plasma to identify renal-allograft recipients with viral nephropathy[J].N Engl J Med,2000,342(18):1309-1315.

    [10]Toyoda M,Puliyanda DP,Amet N,et al.Co-infection of polyomavirus BK and cytomegalovirus in renal transplant recipients[J].Transplantation,2005,80(2):198-205.

    [11]Leung AY,Chan M,Tang SC,et al.Real-time quantitative analysis of polyoma BK viremia and viruria in renal allograft recipients[J].J Virol Methods,2002,3(1):51-56.

    [12]Absan N,Sbab KV,Polyomaviruses:An overview[J].Graft,2002,5(s):9-17.

    [13]Isabelle B,Volker N,Hans HH,Polyomavirus infections in transplant recipients[J].Crrent Opinion in organ transplantation,2000,5(3):210-216.

    [14]Nickeleit V,Steiger J,Micheal J,BK virus infection after kidney transplantation[J].Graft,2002,5(s):46-57.

    [15]Thomas FH,Emest CB,Mcbain BS,et al.Polyoma virus infection after renal transplantation[J].Transplantation,2001,71(7):896-899.

    [16]Hirsch HH,Brennan DC,Drachenberg CB,et al.Polyomavirusassociated nephropathy in renal transplantation:interdisci-plinary analyses and recommendations[J].Transplantation,2005,79(10):1277-1286.

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