• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    腎移植術(shù)后血和尿中BKV、JCV的檢測及意義

    2015-06-05 08:40:00尚麗紅游瑞君武小桐王振興張文艷
    關(guān)鍵詞:離心管尿液定量

    尚麗紅,游瑞君,武小桐,王振興,張文艷

    (山西省第二人民醫(yī)院腎移植中心,山西 太原030012)

    多瘤病毒屬于乳多空病毒屬,其中BK病毒(BKV)和JC病毒(JCV)可以使人類致病。在腎移植病人,免疫功能低下[1-3],多瘤病毒的潛伏感染率較高。約有10%~60%的腎移植患者可再次激活多瘤病毒,但不影響腎功能;1%~10%的腎移植患者可發(fā)生多瘤病毒相關(guān)性腎病(Polyomavirus-associated nephropathy,PVAN)[4]。

    BKV是導(dǎo)致PVAN的主要原因[5],與JCV具有75%的序列同源性[6]。據(jù)報(bào)道[6],大約3%的JCV感染患者可導(dǎo)致PVAN的發(fā)生;但如果JCV與BKV同時(shí)發(fā)生感染的患者,PVAN發(fā)生的機(jī)率將上升到15%[7]。目前,尚無有效的抗病毒藥物。普遍的處理方法是恰當(dāng)?shù)卣{(diào)整免疫抑制劑的類型和用量以減少病毒的復(fù)制,但又增加引發(fā)排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,建立快速、有效的檢測方法,對PVAN的早期預(yù)測和診斷對腎移植患者預(yù)后有著重要的臨床意義。

    目前,常用的檢測方法[8,9]有:(1)尿液誘耳細(xì)胞(decoy細(xì)胞)細(xì)胞學(xué)檢測;(2)尿液、血液中PCR檢測DNA;(3)免疫組化檢查。近年來,人們推崇無創(chuàng)性檢測方法,即采用PCR檢測體液病毒DNA作為篩選。利用PCR方法檢測這兩種病毒具有更高的靈敏度和特異性,對監(jiān)測腎移植術(shù)后患者多瘤病毒的感染、及早發(fā)現(xiàn)和治療都具有指導(dǎo)作用。

    因此,本文利用熒光定量PCR(探針法)方法,檢測腎移植術(shù)后患者體內(nèi)的BKV和JCV含量,為患者的臨床診斷和治療方案提供重要依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象 分別收集山西省第二人民醫(yī)院腎移植中心2013年6月至2014年5月期間腎移植術(shù)后患者尿液標(biāo)本153例、血液標(biāo)本155例,其中男性92例,女性61例。所有患者自愿接受BKV、JCV病毒的檢測。

    1.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本和試劑 在患者行腎移植術(shù)后,收集尿液和血液。具體收集方法如下:(1)血漿樣本采集:用無菌注射器在受檢者手臂彎曲處或手背處抽取靜脈血3~5ml,注入含有EDTA的無菌收集管,立即輕輕顛倒混勻,室溫放置不超過4h,待樣本自行析出血漿或直接室溫1600rpm離心5min分離出血漿,轉(zhuǎn)移到1.5ml滅菌離心管中備用。(2)尿液樣本采集:留取中段晨尿10~20ml(不超過容器體積的2/3)密封送檢。(3)樣本保存:樣本應(yīng)盡快檢測,4℃保存不超過24h,-20℃條件下可以保存數(shù)月,-70℃條件下可以長期保存,但不可反復(fù)凍融。BK/JC病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購自于北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 DNA模板提取 (1)血漿或血清①在1.5ml離心管中加入100μl待測樣本,然后加入50μl濃縮液,振蕩15s混勻;②將上述離心管放入臺式離心機(jī),13000r/min離心10min后取出;③小心吸出150μl上清液(盡量吸干上清液,但不要觸及沉淀)并棄去,保留沉淀;④向離心管中分別加入25μl裂解液,然后用吸頭對準(zhǔn)沉淀所在位置,將其挑離管底,并吹洗5次(關(guān)鍵步驟);⑤振蕩15s將沉淀充分打散;⑥100℃條件下溫育10min;⑦13000r/min離心10min后將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管,該上清液即純化的DNA溶液。(2)尿液將尿液送檢管振蕩15s,徹底混勻(關(guān)鍵步驟);取其中 1ml至 1.5ml離心管中,13000r/min離心10min后棄去上清;加入50μl裂解液,然后用吸頭對準(zhǔn)沉淀所在位置,將其挑離管底,并吹洗5次(關(guān)鍵步驟);之后參照上述血漿或血清樣本操作5~7步驟。

    1.3.2 定量PCR檢測腎移植患者術(shù)后BKV和JCV感染 (1)試劑配制:確定反應(yīng)數(shù)N,N=待檢樣本數(shù)(n)+定量標(biāo)準(zhǔn)品(4)+陰性質(zhì)控品(1)+1。計(jì)算加到反應(yīng)混合物中的各個(gè)試劑的量,分別添加BKVPCR反 應(yīng) 液 8.5μl×N、BKV 酶 混 合 物 0.5μl×N、BKV PCR 增強(qiáng)劑 10μl×N、BKV 內(nèi)標(biāo)模板 1μl×N。 取無菌離心管配制反應(yīng)體系,試劑全部加入后振蕩15秒,2000r/min離心15s。然后將上述混合液 20μl/管分裝至PCR反應(yīng)管中。(2)PCR反應(yīng):分別取BKV/JCV陰性質(zhì)控品、已處理樣本和BKV定量標(biāo)準(zhǔn)品I~I(xiàn)V 5μl加入 PCR 反應(yīng)管中,蓋緊管蓋,2000r/min離心15s將管壁上的液體全部甩至管底,如有氣泡輕彈管壁將氣泡彈出,再次離心去除氣泡,然后立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。具體設(shè)置程序見表1。

    表1 PCR反應(yīng)條件和程序

    1.3.3 PCR數(shù)據(jù)分析 擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測目的片段,并分析熒光擴(kuò)增檢測結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 尿液和血液中BKV-DNA和JCV-DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測,結(jié)果見圖1。

    A BKV-DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

    圖1 尿液和血液中BKV、JCV的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

    2.2 尿液、血液中BKV-DNA和JCV-DNA定量檢測結(jié)果 BKV和JCV定量PCR檢測,用4個(gè)體外純化質(zhì)粒作為定量標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行PCR擴(kuò)增并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,且標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)|R|(|r|)均大于0.99。腎移植術(shù)后患者BKV和JCV檢測的最低檢測限為 2×103copies/ml, 線性檢測范圍為 5×103~5×108copies/ml。

    BKV-DNA在尿中的檢出率為33.3%(51/153),載量在 1.15×103~6.00×1011copies/ml之間, 血液中檢出率 為 34.8%(54/155), 載 量 在 1.3×103~6.06×105copies/ml之間。JCV-DNA在尿中的檢出率為31.3%(47/150),載量在 1.15×103~6.00×1011copies/ml之間,血液中檢出率為34.6%(54/156),載量在1.3×103~6.06×105copies/ml之間。發(fā)生病毒尿癥的中位時(shí)間為6.1月,發(fā)生病毒血癥的中位時(shí)間為4.9月。定量PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線,見圖2。

    圖2 尿液和血液中BKV-DNA、JCV-DNA的PCR擴(kuò)增曲線

    2.3 PCR方法的靈敏度和特異性 BKV尿液和血液樣本靈敏度分別為98.31%和99.22%,特異性分別為100%和99.79%;JCV尿液和血液樣本靈敏度分別為97.90%和98.60%,特異性均為100%。本檢測方法對BKV和JCV檢測具有較高的特異性和靈敏度。見表2。

    表2 BK病毒和JC病毒檢測試劑的靈敏度和特異性

    3 討論

    多瘤病毒屬乳多空病毒屬,目前已發(fā)現(xiàn)的多瘤病毒成員有13個(gè),其中BKV、JCV和SV40與人類有關(guān)。BKV可引起移植腎功能異常或喪失;JCV可引起進(jìn)行性多灶白質(zhì)腦病(PML);SV40則為猿類動物病毒。

    在腎移植患者,由多瘤病毒感染的臨床表現(xiàn)既可以是病毒尿癥,也可以是明顯的腎臟、泌尿系異常。如輸尿管狹窄、一過性移植腎功能異常、間質(zhì)性腎炎、出血性膀胱炎等,統(tǒng)稱為多瘤病毒相關(guān)性腎病 (Polyomavirus-associatednephropathy,PVAN)。10%~60%的腎移植患者在接受抗排斥治療程中有BKV感染 ,多見于術(shù)后3個(gè)月內(nèi)。國外資料顯示,腎移植術(shù)后44周可有約5%的病例發(fā)生PVAN。如無恰當(dāng)?shù)奶幚?,高達(dá)45%的病例在組織學(xué)確診后平均6個(gè)月轉(zhuǎn)變?yōu)橐浦材I失功。PVAN的發(fā)生可能與免疫抑制維持治療 (FK506,MMF及雷帕霉素)、腎小管上皮細(xì)胞損傷及再生、抗排斥治療等多因素密切相關(guān)。

    BK病毒(BKV)屬多瘤病毒家族成員,感染后多以潛伏狀態(tài)存在,當(dāng)宿主免疫功能低下時(shí)可重新激活。BK病毒原發(fā)感染發(fā)生在兒童時(shí)期,一般存在于人體泌尿道及外周血白細(xì)胞中,約0.5%~20%感染者會出現(xiàn)BKV激活,導(dǎo)致病毒復(fù)制,一般不會引起腎功能損害。但在接受免疫抑制治療的人群中,特別是腎移植術(shù)后患者,BKV再激活率會明顯增高,并可能導(dǎo)致BKV相關(guān)性腎病(BKV associated nephropathy,BKVAN)。 腎臟是健康人 BKV潛伏感染的主要部位,腎移植術(shù)后患者可在尿液中檢測到BKV,其中多數(shù)患者表現(xiàn)為無癥狀病毒血癥或暫時(shí)的移植腎功能異常,偶可在切除的移植腎標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)病毒引起的組織損傷。

    近年研究發(fā)現(xiàn),初次感染BKV后,BKV常潛伏于腎小管上皮細(xì)胞及尿路移行上皮細(xì)胞內(nèi),當(dāng)宿主免疫力下降時(shí),BKV可再次激活并開始迅速大量復(fù)制。腎移植術(shù)后患者BKV再次激活的發(fā)生率為10%-68%,約1%-7%的腎移植患者會出現(xiàn)BKVAN,其中50%會導(dǎo)致移植腎失功。

    BKV是導(dǎo)致PVAN的主要原因[5],與JCV具有75%的序列同源性。JCV可引起進(jìn)行性多灶白質(zhì)腦病(PML),還能在腎臟組織中復(fù)制,并通過尿液排出病毒。器官移植后,免疫抑制劑的使用是誘導(dǎo)多瘤病毒激活復(fù)制的重要原因,其中,40%以上的腎移植患者可檢測到JCV的復(fù)制。據(jù)報(bào)道[6],大約3%的JCV感染患者可導(dǎo)致PVAN的發(fā)生;但如果JCV與BKV同時(shí)發(fā)生感染的患者,PVAN發(fā)生的機(jī)率將上升到15%[7]。目前,尚無有效的抗病毒藥物。普遍的處理方法是恰當(dāng)?shù)卣{(diào)整免疫抑制劑的類型和用量以減少病毒的復(fù)制,但又增加引發(fā)排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,建立快速、有效的檢測方法,對PVAN的早期預(yù)測和診斷對腎移植患者預(yù)后有著重要的臨床意義。

    近年來,相對于其他又創(chuàng)性的檢測,人們更推崇無創(chuàng)性檢測方法,如采用PCR檢測血中病毒DNA。 Toyoda[10]和 Leung[11]等研究證明,BKV 定量PCR測定對于檢測BKV感染的發(fā)病過程非常有效,并建議聯(lián)系臨床現(xiàn)象和活檢所見判斷結(jié)果。PCR法檢測多瘤病毒的敏感性為100%,特異性為88%~95%[12,13],在組織學(xué)檢查的陰性而PCR陽性的病人最終約有半數(shù)以上病人發(fā)展為PVAN,在這期間具有數(shù)周到數(shù)月的窗口期[14]。尿PCR檢測的靈敏度和特異性更高,但由于誘耳細(xì)胞內(nèi)病毒包涵體可以是BKV或JCV[15],因此尿脫落細(xì)胞檢測不能作BKV或JCV的特異性分型。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法被認(rèn)為是一種檢測病毒載量敏感性較高的非侵入性檢查。在臨床上,對腎移植術(shù)后患者血液和尿液中多瘤病毒進(jìn)行定性、定量實(shí)時(shí)監(jiān)測,可作為腎移植術(shù)后BKV相關(guān)性腎病(BKVAN)和多瘤病毒相關(guān)性腎病(PVAN)的早期診斷和篩選的方法。

    據(jù)報(bào)道,腎移植受者Decoy細(xì)胞陽性率為29.4%~40.0%,病毒尿癥發(fā)生率為13.0%~34.7%,病毒血癥為5.0%~21.0%。其中病毒尿癥的發(fā)生率與本文檢測結(jié)果基因一致,而病毒血癥的發(fā)生率略高。BKV病毒血癥出現(xiàn)的原因可能有以下幾種:(1)腎小管上皮細(xì)胞的BKV激活后通過小管周的毛細(xì)管進(jìn)入血循環(huán)中;(2)血癥和尿癥是BKV在尿上皮細(xì)胞和外周單核細(xì)胞各自激活的結(jié)果,兩者相互伴隨發(fā)生;(3)BKV病毒尿癥至少在一定程度上是血癥的一個(gè)反映,血癥中的病毒經(jīng)過腎代謝進(jìn)入尿中BKVAN。血液中BKV的出現(xiàn)反映了BKVAN的發(fā)展過程。

    目前,關(guān)于多瘤病毒的研究報(bào)道很多[16],但對腎移植患者的BKV和JCV相關(guān)的PVAN、以及移植腎的免疫排斥之間相互作用的研究尚不清楚,相信在不久將來,這方面的研究會成為焦點(diǎn),為臨床治療不斷提供新的理論依據(jù)。

    [1]Crew RJ,Markowitz G,Radhakrishnan J.Therapeutic options in K virus-associated interstitial nephritis[J].Kidney Int,2006,70(2):399-402.

    [2]Randhawa P,Vats A,Shapiro R.Monitoring for polyomavirus BKand JC in urine:comparison of quantitative polymerase chain reaction with urine cytology[J].Transplantation,2005,79(8):984-986.

    [3]Kazory A,Ducloux D,Chalopin JM,et al.The first case of JC virus allograft nephropathy[J].Transplantation,2003,76(11):1653-1655.

    [4]Randhawa P,Brennan DC.BK virus infection in transplant recipients:an overview and update[J].Am J Transplant,2006,6(9):2000-2005.

    [5]Nickeleit V,Klimkait T,Binet IF,et al.Testing for polyomavirus type BK DNA in plasma to identify renal-allograft recipients with viral nephropathy[J].N Engl J Med,2000,342(18):1309-1315.

    [6]Singh D,Kiberd B,Alkhudair W,et al.Polyomavirus-induced hemorrhagic cystitis in renal transplantation patient with polyomavirus nephropathy[J].Urology,2006,67(2):423.e11-423.e12.

    [7]Nickeleit V,Hirsch HH,Binet IF,et al.Polyomavirus infection of renal allograft recipients:from latent infection to manifest disease[J].J Am Soc Nephrol,1999,10(5):1080-1089.

    [8]Bohl DL,Brennan DC,Ryschkewitsch C,et al.BK virus antibody titers and intensity of infections after renal transplantation[J].J Clin Virol,2008,43(2):184-189.

    [9]Nickeleit V,Klimkait T,Binet IF,et al.Testing for polyomavirus type BK DNA in plasma to identify renal-allograft recipients with viral nephropathy[J].N Engl J Med,2000,342(18):1309-1315.

    [10]Toyoda M,Puliyanda DP,Amet N,et al.Co-infection of polyomavirus BK and cytomegalovirus in renal transplant recipients[J].Transplantation,2005,80(2):198-205.

    [11]Leung AY,Chan M,Tang SC,et al.Real-time quantitative analysis of polyoma BK viremia and viruria in renal allograft recipients[J].J Virol Methods,2002,3(1):51-56.

    [12]Absan N,Sbab KV,Polyomaviruses:An overview[J].Graft,2002,5(s):9-17.

    [13]Isabelle B,Volker N,Hans HH,Polyomavirus infections in transplant recipients[J].Crrent Opinion in organ transplantation,2000,5(3):210-216.

    [14]Nickeleit V,Steiger J,Micheal J,BK virus infection after kidney transplantation[J].Graft,2002,5(s):46-57.

    [15]Thomas FH,Emest CB,Mcbain BS,et al.Polyoma virus infection after renal transplantation[J].Transplantation,2001,71(7):896-899.

    [16]Hirsch HH,Brennan DC,Drachenberg CB,et al.Polyomavirusassociated nephropathy in renal transplantation:interdisci-plinary analyses and recommendations[J].Transplantation,2005,79(10):1277-1286.

    猜你喜歡
    離心管尿液定量
    沒聽錯(cuò)吧?用污泥和尿液制水泥
    軍事文摘(2022年16期)2022-08-24 01:50:52
    尿液檢測可能會發(fā)現(xiàn)侵襲性前列腺癌
    魔方型離心管架的設(shè)計(jì)及研發(fā)
    科技視界(2020年26期)2020-09-24 03:25:06
    離心管架研究現(xiàn)狀及魔尺型離心管架的設(shè)計(jì)
    科技視界(2020年17期)2020-07-30 14:03:27
    顯微定量法鑒別林下山參和園參
    當(dāng)歸和歐當(dāng)歸的定性與定量鑒別
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:44
    跟蹤導(dǎo)練(三)
    燃燒條件演示實(shí)驗(yàn)的新設(shè)計(jì)
    10 種中藥制劑中柴胡的定量測定
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    慢性HBV感染不同狀態(tài)下HBsAg定量的臨床意義
    √禁漫天堂资源中文www| 国产伦人伦偷精品视频| 99在线人妻在线中文字幕| 午夜免费观看网址| 国产私拍福利视频在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲,欧美精品.| 亚洲久久久国产精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 女性生殖器流出的白浆| 淫秽高清视频在线观看| 久久中文字幕一级| 男女视频在线观看网站免费 | 十八禁人妻一区二区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 一区二区三区精品91| av福利片在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 99热6这里只有精品| 成熟少妇高潮喷水视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 婷婷丁香在线五月| 精品午夜福利视频在线观看一区| 色尼玛亚洲综合影院| 怎么达到女性高潮| 精品国内亚洲2022精品成人| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 九色国产91popny在线| 欧美中文综合在线视频| www.熟女人妻精品国产| 国产成人啪精品午夜网站| 国产久久久一区二区三区| 在线播放国产精品三级| 很黄的视频免费| 欧美色欧美亚洲另类二区| 99久久国产精品久久久| 真人一进一出gif抽搐免费| 男人操女人黄网站| 久久中文字幕一级| 极品教师在线免费播放| 国产一卡二卡三卡精品| 国产又色又爽无遮挡免费看| 午夜福利高清视频| 午夜两性在线视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 美国免费a级毛片| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日本在线视频免费播放| 国产成人av教育| 两性夫妻黄色片| 麻豆av在线久日| 最近最新中文字幕大全免费视频| av视频在线观看入口| av有码第一页| 88av欧美| 国产私拍福利视频在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲专区国产一区二区| 一级毛片高清免费大全| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久久国产成人精品二区| 色播亚洲综合网| 91av网站免费观看| av有码第一页| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲全国av大片| 丝袜在线中文字幕| 国产乱人伦免费视频| 亚洲第一电影网av| 国产激情久久老熟女| 精品一区二区三区四区五区乱码| 夜夜爽天天搞| 午夜福利免费观看在线| 亚洲片人在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精品国产一区二区三区四区第35| 日韩欧美三级三区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 自线自在国产av| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 中出人妻视频一区二区| 免费高清在线观看日韩| 日本 av在线| 久久狼人影院| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 一级黄色大片毛片| 久久精品国产综合久久久| 香蕉久久夜色| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美亚洲日本最大视频资源| 老司机深夜福利视频在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 在线av久久热| 免费在线观看成人毛片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 午夜福利在线观看吧| 免费搜索国产男女视频| 69av精品久久久久久| 免费观看人在逋| 国产午夜精品久久久久久| 久久中文看片网| 18禁国产床啪视频网站| 国产一卡二卡三卡精品| 日韩欧美一区视频在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 午夜激情av网站| 欧美日韩精品网址| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲三区欧美一区| 午夜两性在线视频| 亚洲中文字幕日韩| 日韩中文字幕欧美一区二区| 一二三四在线观看免费中文在| 久久精品91蜜桃| 精品久久久久久,| 岛国视频午夜一区免费看| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久久久久国产a免费观看| 欧美日韩一级在线毛片| 国产精品一区二区免费欧美| 一二三四在线观看免费中文在| 美女午夜性视频免费| 18禁美女被吸乳视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 国语自产精品视频在线第100页| 在线视频色国产色| 一夜夜www| 午夜久久久在线观看| 国产精品免费视频内射| 午夜福利一区二区在线看| 午夜亚洲福利在线播放| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日日夜夜操网爽| 亚洲精品国产区一区二| 国产欧美日韩一区二区三| 午夜福利在线观看吧| 性欧美人与动物交配| 中文字幕人妻熟女乱码| 黄色成人免费大全| 国产视频一区二区在线看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久99热这里只有精品18| av在线天堂中文字幕| 欧美成狂野欧美在线观看| 性欧美人与动物交配| 一级毛片高清免费大全| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| av中文乱码字幕在线| 国产成人系列免费观看| 免费高清视频大片| 狠狠狠狠99中文字幕| 女警被强在线播放| 国产v大片淫在线免费观看| 男男h啪啪无遮挡| 精品不卡国产一区二区三区| 国产av在哪里看| av有码第一页| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 色在线成人网| 中文字幕最新亚洲高清| 真人做人爱边吃奶动态| 午夜激情av网站| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲无线在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 久久午夜亚洲精品久久| 国产亚洲欧美精品永久| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| www.自偷自拍.com| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 夜夜爽天天搞| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 99国产精品99久久久久| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久香蕉国产精品| 久久精品成人免费网站| 亚洲男人的天堂狠狠| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久精品影院6| 黄片大片在线免费观看| 校园春色视频在线观看| 无限看片的www在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 男女床上黄色一级片免费看| 午夜福利在线观看吧| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲午夜理论影院| 999久久久国产精品视频| 亚洲,欧美精品.| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产v大片淫在线免费观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 悠悠久久av| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产精品二区激情视频| 90打野战视频偷拍视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 人人澡人人妻人| 日韩中文字幕欧美一区二区| 草草在线视频免费看| 亚洲av熟女| 国产97色在线日韩免费| 成人欧美大片| 亚洲三区欧美一区| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 精品日产1卡2卡| 超碰成人久久| 亚洲美女黄片视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲国产中文字幕在线视频| 看片在线看免费视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲,欧美精品.| 夜夜爽天天搞| 婷婷丁香在线五月| 久久久久久久久中文| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 在线天堂中文资源库| 俺也久久电影网| 美女扒开内裤让男人捅视频| 又黄又粗又硬又大视频| 日韩免费av在线播放| 久久久久久国产a免费观看| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲免费av在线视频| 中文资源天堂在线| 精品人妻1区二区| 久久中文字幕一级| 国产97色在线日韩免费| 一级毛片精品| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久久久久久久久黄片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 女人被狂操c到高潮| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 手机成人av网站| 亚洲第一av免费看| 99国产综合亚洲精品| 国产麻豆成人av免费视频| 精品高清国产在线一区| 在线观看www视频免费| 国产欧美日韩一区二区三| 99riav亚洲国产免费| 国产精品永久免费网站| 亚洲最大成人中文| avwww免费| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 成年女人毛片免费观看观看9| av电影中文网址| 国产成人欧美| 亚洲熟妇熟女久久| av福利片在线| 欧美最黄视频在线播放免费| 妹子高潮喷水视频| 成人三级黄色视频| а√天堂www在线а√下载| 91麻豆av在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 日本五十路高清| 成在线人永久免费视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久 成人 亚洲| 欧美一区二区精品小视频在线| 天堂√8在线中文| 欧美日韩一级在线毛片| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 99在线人妻在线中文字幕| 中文字幕人妻熟女乱码| 高潮久久久久久久久久久不卡| 好男人电影高清在线观看| 久久久久久久午夜电影| 大型av网站在线播放| 久久中文字幕一级| 午夜激情福利司机影院| 又黄又粗又硬又大视频| av天堂在线播放| 国产精品日韩av在线免费观看| tocl精华| 高潮久久久久久久久久久不卡| 99久久久亚洲精品蜜臀av| a级毛片a级免费在线| 三级毛片av免费| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 男女午夜视频在线观看| 午夜福利免费观看在线| 操出白浆在线播放| 怎么达到女性高潮| 国产乱人伦免费视频| 午夜免费观看网址| 午夜亚洲福利在线播放| 特大巨黑吊av在线直播 | 露出奶头的视频| 99热6这里只有精品| 我的亚洲天堂| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜a级毛片| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久久久国产一级毛片高清牌| netflix在线观看网站| 男人舔奶头视频| 听说在线观看完整版免费高清| 国产麻豆成人av免费视频| 可以在线观看毛片的网站| 黄色 视频免费看| 亚洲av成人av| 制服诱惑二区| 怎么达到女性高潮| 欧美一区二区精品小视频在线| 99热只有精品国产| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美一级毛片孕妇| 欧美日韩精品网址| 日韩成人在线观看一区二区三区| а√天堂www在线а√下载| 精品久久蜜臀av无| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 国产三级在线视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久久国产成人免费| 窝窝影院91人妻| 亚洲精品在线美女| 国产av一区二区精品久久| 久久精品成人免费网站| 特大巨黑吊av在线直播 | 日韩视频一区二区在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲av成人一区二区三| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲成av人片免费观看| 日本一本二区三区精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲中文日韩欧美视频| 久热爱精品视频在线9| 婷婷六月久久综合丁香| 好男人在线观看高清免费视频 | 亚洲国产精品合色在线| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品久久久av美女十八| 91成人精品电影| 午夜福利18| 日韩精品青青久久久久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 婷婷精品国产亚洲av| 国产精品98久久久久久宅男小说| 女性被躁到高潮视频| 一级a爱片免费观看的视频| 午夜福利视频1000在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲精品在线美女| 深夜精品福利| 亚洲人成电影免费在线| 一区二区三区国产精品乱码| 午夜福利高清视频| 天天添夜夜摸| 国产v大片淫在线免费观看| av免费在线观看网站| 亚洲第一青青草原| 国产av又大| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 精品人妻1区二区| 午夜亚洲福利在线播放| www.精华液| 黄色 视频免费看| 天天添夜夜摸| 成人三级做爰电影| 少妇 在线观看| 日韩欧美三级三区| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产不卡一卡二| 99riav亚洲国产免费| 亚洲精品av麻豆狂野| 美女大奶头视频| 日韩大码丰满熟妇| 成人一区二区视频在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 99久久无色码亚洲精品果冻| 黄色片一级片一级黄色片| 黄色毛片三级朝国网站| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产成+人综合+亚洲专区| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品色激情综合| 午夜老司机福利片| 日本熟妇午夜| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产极品粉嫩免费观看在线| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品一区av在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产私拍福利视频在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 成人精品一区二区免费| 日本 av在线| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 少妇粗大呻吟视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 美女 人体艺术 gogo| 波多野结衣巨乳人妻| 波多野结衣av一区二区av| 国产亚洲精品久久久久5区| 老司机福利观看| 欧美成人午夜精品| 哪里可以看免费的av片| 成人手机av| 精品高清国产在线一区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲国产精品成人综合色| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久这里只有精品19| 欧美精品啪啪一区二区三区| 18禁国产床啪视频网站| 精品无人区乱码1区二区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久亚洲精品不卡| 香蕉国产在线看| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲真实伦在线观看| 69av精品久久久久久| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 一夜夜www| 午夜成年电影在线免费观看| 村上凉子中文字幕在线| 俺也久久电影网| 国产1区2区3区精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 好男人在线观看高清免费视频 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 三级毛片av免费| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 色综合站精品国产| 色av中文字幕| 自线自在国产av| 精品久久久久久久末码| 香蕉久久夜色| 亚洲精品色激情综合| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲一区二区三区色噜噜| 一级片免费观看大全| 色综合婷婷激情| 久久亚洲精品不卡| 国产视频内射| 一区二区三区高清视频在线| 夜夜爽天天搞| 人人妻人人看人人澡| 1024香蕉在线观看| 女人被狂操c到高潮| 999精品在线视频| 国产黄色小视频在线观看| 脱女人内裤的视频| 日本 av在线| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美激情高清一区二区三区| 精品一区二区三区av网在线观看| 美女免费视频网站| 一级作爱视频免费观看| 国产精品1区2区在线观看.| 久久中文字幕人妻熟女| 黄片播放在线免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 在线看三级毛片| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 成年人黄色毛片网站| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 一级黄色大片毛片| 极品教师在线免费播放| 脱女人内裤的视频| 欧美黑人精品巨大| 久久久国产成人精品二区| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲av第一区精品v没综合| 一区二区三区国产精品乱码| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲男人的天堂狠狠| 精品久久久久久,| 两性夫妻黄色片| 麻豆成人av在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 日日夜夜操网爽| 精品乱码久久久久久99久播| 成人18禁在线播放| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 又紧又爽又黄一区二区| 欧美日韩乱码在线| 国产精品野战在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 在线播放国产精品三级| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久久久久大精品| 久久这里只有精品19| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美日韩乱码在线| 国产熟女xx| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 这个男人来自地球电影免费观看| 久热爱精品视频在线9| 搡老岳熟女国产| 亚洲欧美激情综合另类| 日韩欧美 国产精品| 久久久久九九精品影院| 亚洲av五月六月丁香网| 免费看美女性在线毛片视频| 一级毛片精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 丁香欧美五月| 无人区码免费观看不卡| 丝袜在线中文字幕| 国产精华一区二区三区| 少妇 在线观看| 日本 欧美在线| 国产乱人伦免费视频| 日韩欧美免费精品| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 黑人欧美特级aaaaaa片| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美色视频一区免费| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲欧美激情综合另类| 自线自在国产av| 给我免费播放毛片高清在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 色播在线永久视频| 视频区欧美日本亚洲| 国产1区2区3区精品| АⅤ资源中文在线天堂| www.熟女人妻精品国产| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美黑人精品巨大| 色av中文字幕| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久久久亚洲av毛片大全| 国内精品久久久久久久电影| 久久精品人妻少妇| 99热6这里只有精品| 自线自在国产av| 国产区一区二久久| 亚洲成人精品中文字幕电影| 无人区码免费观看不卡| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 精品欧美国产一区二区三| 欧美精品啪啪一区二区三区| 两个人视频免费观看高清| 岛国在线观看网站| 日本 欧美在线| 国产精品亚洲一级av第二区| 视频在线观看一区二区三区| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜福利视频1000在线观看| 在线观看66精品国产| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 老鸭窝网址在线观看| 一级黄色大片毛片| 久久亚洲真实| 日本成人三级电影网站| 日本 欧美在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产精品久久视频播放| 一二三四在线观看免费中文在| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲中文字幕日韩| 午夜精品在线福利| 午夜福利高清视频| e午夜精品久久久久久久| 欧美日本亚洲视频在线播放|