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    CD137L在食管癌的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義

    2015-06-05 08:39:58陳潔王健
    關(guān)鍵詞:鱗狀活化食管癌

    陳潔,王健

    (江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,1、病理科;2、檢驗(yàn)科,江西 南昌330006)

    CD137/CD137L是除CD28/B7之外的另一對重要的共刺激分子,在免疫細(xì)胞之間進(jìn)行雙向信號傳導(dǎo),在免疫應(yīng)答、抗腫瘤免疫和自身免疫性疾病中起重要作用[1]。CD137L屬于腫瘤壞死因子超家族9,是腫瘤壞死因子家族的一員,它主要表達(dá)在抗原呈遞細(xì)胞(APC),成熟的樹突狀細(xì)胞,也可表達(dá)于活化的B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等[2]。CD137信號傳導(dǎo)途徑既能提供刺激信號激活T細(xì)胞,使T細(xì)胞活化增殖分泌細(xì)胞因子,在誘導(dǎo)這種刺激信號的同時(shí)它也介導(dǎo)反向刺激信號,誘導(dǎo)APC活化增殖和分泌細(xì)胞因子,這種雙向信號傳導(dǎo)更加迅速和精確地調(diào)節(jié)機(jī)體的生物反應(yīng)[3]。研究發(fā)現(xiàn)CD137L除了高表達(dá)于淋巴或骨髓來源的腫瘤細(xì)胞表面,還表達(dá)于多種實(shí)體瘤細(xì)胞株表面,如Colo205、PC3、SKBR3等腫瘤細(xì)胞株[4]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)染色方法檢測食管癌組織及癌旁組織中CD137L的表達(dá),探討CD137L在食管癌組織及癌旁組織中的表達(dá)差異及CD137L的表達(dá)水平與食管癌的臨床病理特征、預(yù)后等臨床參數(shù)之間的關(guān)系,揭示CD137L在食管癌發(fā)生進(jìn)展中的作用,為尋找食管癌新的分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 標(biāo)本來源 收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院和江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2010年1月至2013年12月期間經(jīng)手術(shù)切除病理診斷為食管鱗狀細(xì)胞癌的石蠟標(biāo)本31例,購買食管鱗狀細(xì)胞癌組織芯片30例,癌旁組織30例。其中男性36例,女性25例,年齡25~78歲,中位年齡59歲。這些標(biāo)本用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院2014年5月至12月手術(shù)切除的食管癌組織18例,正常食管組織3例,經(jīng)福爾馬林浸泡時(shí)間均小于5h,采集未直接接觸福爾馬林的黃豆大小的癌組織、癌旁組織及正常食管組織,置-80℃冰箱保存。這些標(biāo)本用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。(癌旁組織是指距離癌組織邊緣1㎝以上沒有癌組織的正常食管組織)

    1.2 試劑和方法 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP)檢測CD137L在食管癌中的表達(dá)。61例食管癌組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定,石蠟包埋,4μm連續(xù)切片。兔抗人CD137L單克隆抗體和SP試劑盒均購自武漢博士德公司,具體實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒操作說明書進(jìn)行。每次染色均用PBS替代一抗作為陰性對照。組織芯片購自于上海芯超公司。

    RT-PCR所用的試劑盒主要有固定組織RNA提取試劑盒、HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture等均購自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司,Real Time PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司生產(chǎn)。引物由上海生工合成。

    1.3 總RNA提取及cDNA合成 根據(jù)固定組織RNA提取試劑盒說明書提取總RNA,提取產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳確定RNA質(zhì)量,使用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的純度并計(jì)算濃度。根據(jù)HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA。先去除基因組DNA反應(yīng),然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,合成條件 37℃孵育 15min,85℃孵育 5s。合成產(chǎn)物進(jìn)行下一步熒光定量PCR。

    1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR β-actin上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′, 下 游 引 物 5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物186bp;CD137L 上 游 引 物 5′ -CATGTTTGCGCAGCTGGTG-3′, 下 游 引 物 5′-CGCCGCAGCTCTAGTTGAAAG-3′, 擴(kuò)增產(chǎn)物 183bp。PCR反應(yīng)體系總體積為25μl:2xUltraSYBR Mixture(with ROX)12.5μl,上、下游引物混合物 1.5μl,模板cDNA1μl,RNase-Free Water10μl。PCR 反應(yīng)條件為95℃ 10min,95℃ 15s,60℃ 1min,40cycles。 融解曲線分析 95℃ 15s,60℃ 1min,95℃ 15s,60℃ 15s。 每個(gè)cDNA標(biāo)本進(jìn)行三次PCR反應(yīng),數(shù)據(jù)以x±s表示,最后結(jié)果按公式:2-△△Ct進(jìn)行計(jì)算。

    1.5 免疫組化結(jié)果判定CD137L蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜,呈棕黃色或棕褐色顆粒。結(jié)果判定:每例標(biāo)本在高倍鏡視野下隨意觀察5個(gè)視野。CD137L染色強(qiáng)度評分為:0 分(沒著色),1 分(弱),2 分(中等),3分(強(qiáng))。 陽性細(xì)胞的百分比評分為:0 分(≤1%),1 分(1%~10%),2 分(10%-50%),3 分(≥50)。 將兩者分?jǐn)?shù)疊加后分?jǐn)?shù)>4分即為陽性,0-3分為陰性。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均用SPSS18.0軟件完成。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,臨床病理參數(shù)組間數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn),兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05時(shí)各組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 食管癌組織中CD137L的分布和表達(dá)CD137L陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜,呈棕黃色或棕褐色顆粒(圖1)。在61例食管癌組織中32例陽性,表達(dá)率為52.5%,而鄰近的癌旁組織中呈陰性表達(dá)或者弱陽性的非特異性表達(dá)(圖2)。

    圖1 CD137L在食管癌組織中表達(dá)陽性(×400)

    圖2 CD137L在癌旁組織中表達(dá)陰性(×400)

    2.2 與臨床病理資料的聯(lián)系 將61例食管癌患者按性別、年齡、腫瘤分化程度和分期等分組進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,CD137L的表達(dá)在中-高分化的食管鱗狀細(xì)胞癌中的陽性率高于低分化的鱗狀細(xì)胞癌(P=0.001),在早期食管癌中的表達(dá)高于進(jìn)展期食管癌(P=0.048),與其他因素?zé)o明顯相關(guān),P>0.05(表 1)。

    2.3 總RNA電泳圖 將提取的RNA產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,可以清晰地看到28s、18s和5s三條帶,說明提取的RNA質(zhì)量可靠,可以進(jìn)行下一步的RT-PCR實(shí)驗(yàn)。見圖3。

    2.4 食管癌組織中CD137LmRNA的表達(dá) 各實(shí)驗(yàn)組CD137L和內(nèi)參β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct值見表2。食管癌組織中CD137L mRNA的相對表達(dá)量為0.075±0.355,高于癌旁組織的相對表達(dá)量0.031±0.383(P<0.05)。

    表1 食管癌組織CD137L的表達(dá)與臨床病理資料的聯(lián)系

    表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測食管癌組織CD137LmRNA的表達(dá)

    圖3 RNA1%瓊脂糖凝膠電泳

    3 討論

    食管癌是世界上常見的八大惡性腫瘤之一,對人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。研究顯示食管癌在國際上的發(fā)病率居惡性腫瘤發(fā)病率的第九位,死亡率居第八位。而我國是食管癌的高發(fā)地區(qū),特別是北方地區(qū)河南省一帶,以食管鱗狀細(xì)胞癌最為常見,全國每年發(fā)病人數(shù)約25.9萬人,占全世界每年發(fā)病人數(shù)的一半以上,發(fā)病率居全國惡性腫瘤第五位,死亡率居第四位[5,6]。到目前為止,食管癌的確切病因尚未完全明了,哪些因素與食管癌的生存和預(yù)后相關(guān),以及尋找治療食管癌的新的方法等等都是我們迫切需要解決的問題。

    通過對CD137/CD137L信號傳導(dǎo)途徑研究發(fā)現(xiàn),CD137L作用于CD137后可以通過 TRAF2、TRAF1和MAPK等途徑傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號,調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放以及調(diào)控單核細(xì)胞的增殖和分化等,影響生物學(xué)行為??梢源龠M(jìn)腫瘤特異性T細(xì)胞的活化、增殖,細(xì)胞因子分泌增加,保護(hù)T細(xì)胞免于活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 (activation-induced cell death,AICD)[7-9]。同時(shí)它也介導(dǎo)反向共刺激信號,因此能誘導(dǎo)APC活化增殖和分泌細(xì)胞因子。誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子M-CSF,促進(jìn)單核細(xì)胞的增殖,延長其生存;促進(jìn)炎性因子 IL-6、IL-8、TNF-α的分泌,抑制抗炎性因子IL-10的分泌等[10]。其中IL-8是炎細(xì)胞趨化因子,參與白細(xì)胞聚集,也是許多惡性腫瘤的生長因子[11]。T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞通過CD137/CD137L雙向作用而相互活化,介導(dǎo)雙向信號傳導(dǎo),促進(jìn)免疫反應(yīng)。

    CD137/CD137L除了表達(dá)在免疫細(xì)胞也可以表達(dá)在其他非免疫細(xì)胞。Salih HR等研究發(fā)現(xiàn)人的不同癌細(xì)胞株和來源于這些細(xì)胞株的實(shí)體瘤及人體腫瘤細(xì)胞上均有CD137L的表達(dá)[4]。還有人研究了結(jié)腸癌、肺癌、淋巴瘤和肝癌等腫瘤細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞不同程度地表達(dá)CD137L[12],這與Salih HR等研究結(jié)果一致,說明CD137L在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)是普遍現(xiàn)象。在人類惡性血液疾病中,CD137L能將生長和生存信號轉(zhuǎn)換給腫瘤細(xì)胞而且還能引發(fā)抑制腫瘤生長的回應(yīng)[13,14]。

    一般認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程中,腫瘤組織通常低表達(dá)或不表達(dá)共刺激分子從而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別。多種惡性腫瘤細(xì)胞株均表達(dá)CD137L,并且該分子具有的生物學(xué)活性,能促使腫瘤細(xì)胞增殖、分泌IL-8,降低細(xì)胞凋亡,減弱抗癌藥物的細(xì)胞毒效應(yīng)。另一方面通過結(jié)合CD137,能促進(jìn)T細(xì)胞分泌IFN-γ,抑制增殖促進(jìn)凋亡。CD137L表達(dá)于多種人體惡性腫瘤組織細(xì)胞表面,CD137則表達(dá)于腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞,這一對共刺激分子通過雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對腫瘤的發(fā)生進(jìn)展及轉(zhuǎn)移可能具有特殊的生物學(xué)意義。CD137L作為共刺激分子,因其逆向信號的存在,使它的作用不單是提供第二信號引起T細(xì)胞活化的功能[15]。研究表明 CD137L參與腫瘤的發(fā)展,通過與CD137交聯(lián)向表達(dá)CD137L的腫瘤細(xì)胞傳遞逆向信號,產(chǎn)生的效應(yīng)可以是增強(qiáng)免疫,最近關(guān)于CD137L在非小細(xì)胞肺癌中的作用的研究證明了這一點(diǎn)[16]。也可以使機(jī)體腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視,影響機(jī)體免疫功能。有研究顯示CD137L是診斷非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤的一個(gè)新的標(biāo)記,它的表達(dá)可以作為免疫治療淋巴瘤或其他惡性腫瘤的靶點(diǎn)[17]。因此,進(jìn)一步研究CD137L參與腫瘤發(fā)展的機(jī)制使CD137L可能成為抗腫瘤免疫治療的一個(gè)靶標(biāo)。

    本研究中,我們運(yùn)用免疫組化的方法檢測61例食管癌組織及30例癌旁組織CD137L蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示食管癌組織中CD137L的表達(dá)為陽性,在癌旁組織中的表達(dá)為陰性。CD137L表達(dá)在食管癌細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì),呈棕黃色或棕褐色顆粒。同時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測18例食管癌組織及癌旁組織中CD137LmRNA的表達(dá),結(jié)果顯示癌組織中CD137LmRNA的表達(dá)水平高于癌旁組織。CD137L蛋白的表達(dá)在中-高分化的食管鱗狀細(xì)胞癌中的陽性率高于低分化的鱗狀細(xì)胞癌(P=0.001),在早期食管癌中的表達(dá)高于進(jìn)展期食管癌(P=0.048)。中-高分化的鱗狀細(xì)胞癌和早期的食管癌的預(yù)后均要好于低分化鱗狀細(xì)胞癌和進(jìn)展期食管癌。提示CD137L對預(yù)后有一定的影響,高表達(dá)CD137L的食管癌患者預(yù)后要相對較好。作用機(jī)制可能是CD137L和CD137相互作用向表達(dá)CD137L的腫瘤細(xì)胞傳遞逆向信號產(chǎn)生增強(qiáng)免疫的效應(yīng),而具體的作用途徑有待進(jìn)一步研究。由本文的結(jié)果推斷CD137L可以作為食管癌一個(gè)新的診斷標(biāo)記和治療靶點(diǎn)。

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