徽州貢菊中熊果酸的高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)(HIPEF)輔助提取及純化工藝研究

孫克奎,金聲瑯,王 瑩

(1.黃山學(xué)院旅游學(xué)院,安徽黃山 245021;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266109)

徽州貢菊中熊果酸的高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)(HIPEF)輔助提取及純化工藝研究

孫克奎1,金聲瑯1,王 瑩2

(1.黃山學(xué)院旅游學(xué)院,安徽黃山 245021;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266109)

本文以徽州貢菊為原料,以熊果酸得率為指標(biāo),利用高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)(HIPEF)輔助提取徽州貢菊中熊果酸。最后確定的最佳提取參數(shù)是:電場(chǎng)強(qiáng)度30kV/cm、脈沖數(shù)2、料液比1∶12、溫度30℃,最終熊果酸的提取率可達(dá)97.577%;并確定了使用X-5大孔樹(shù)脂,上樣量60BV、pH11、吸附速率為2BV/h、洗脫劑用70%乙醇、2BV/h的洗脫速度純化效果最佳,最終徽州貢菊熊果酸的純度可以達(dá)到85%以上。

徽州貢菊,熊果酸,HIPEF輔助提取,純化

徽州貢菊(Dendranthemamorifolium(Ramat.)Tzvel.Gongju)名列全國(guó)四大名菊之首[1]?；罩葚暰崭缓者?、腺嘌吟、氨基酸、膽鹼、熊果酸、水蘇鹼、黃酮類及多種維生素[2-3]。其中熊果酸含量尤為豐富。熊果酸具有多種生物學(xué)活性,有抗病毒、抗腫瘤、降血脂和抗艾滋病等作用[4-5]。目前徽州貢菊已經(jīng)實(shí)施原產(chǎn)地產(chǎn)品保護(hù),推進(jìn)無(wú)公害貢菊生產(chǎn)及品牌創(chuàng)建的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展道路,由于市場(chǎng)上對(duì)貢菊的賣相十分看重,導(dǎo)致很多殘次的貢菊失去了市場(chǎng),造成了浪費(fèi)。顯然,單一的以茶用作為發(fā)展手段已不能滿足現(xiàn)代發(fā)展的需要,對(duì)其進(jìn)行深加工以提高其附加值顯得刻不容緩。

本論文在前期研究的基礎(chǔ)上,引入高壓脈沖電場(chǎng)浸提技術(shù),探討其對(duì)徽州貢菊熊果酸的浸提和純化工藝,以期提高徽州貢菊熊果酸的提取率,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)徽州貢菊的功能性產(chǎn)品提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

徽州貢菊 黃山市歙縣采購(gòu);熊果酸對(duì)照品 安徽蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司,HPLC 98%;HP2MG、HP2MGL、NKA-12、X-5大孔樹(shù)脂 南開(kāi)大學(xué)化工廠;NaOH、H2SO4、乙醇 武漢宏大化學(xué)試劑廠,均為分析純;甲醇 天津科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心,色譜純。

Waters 600型高效液相色譜儀 Waters公司;CS501型恒溫水浴鍋 中國(guó)重慶銀河儀器有限公司;FA1204電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;98-1-B型電子調(diào)溫電熱套 天津泰斯特儀器有限公司;XFB-500型高速中藥粉碎機(jī) 吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠;高壓脈沖電場(chǎng)(High Intensity Pulsed Electric Fields,HIPEF)系統(tǒng)裝置 自制[6],如圖1所示。

圖1 HIPEF處理系統(tǒng)Fig.1 Processing apparatus of high intensity pulsed electric field

1.2 熊果酸的提取

1.2.1 提取方法 徽州貢菊經(jīng)清洗后粉碎,過(guò)80目篩,篩下物加入一定比例95%乙醇并混合,然后放入HIPEF處理系統(tǒng)的樣品容器中,用泵來(lái)抽取原料,使其在裝置中循環(huán)流動(dòng)。

1.2.2 熊果酸的測(cè)定 采用高效液相色譜法,色譜條件:Phenomenex Luna C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相為甲醇-3%磷酸(88∶12),微濾膜過(guò)濾并超聲波脫氣20min;流速2.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)210nm;進(jìn)樣量10μL;色譜溫度為室溫。

計(jì)算熊果酸提取率的方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[7],即提取率η(%)=浸出液中熊果酸的濃度(g/mL)×浸出液中熊果酸的體積(mL)/原料中熊果酸的質(zhì)量(g)×100

1.2.3 HIPEF輔助提取的正交實(shí)驗(yàn) 每次取100g經(jīng)預(yù)處理的徽州貢菊進(jìn)行最佳提取工藝實(shí)驗(yàn),根據(jù)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)及以往相關(guān)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)[8-9],以加入的電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)、料液比、提取溫度作為考察因素,以熊果酸的提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo),選擇L9(34)正交表進(jìn)行最佳提取工藝實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

表1 正交因素及水平表Table 1 The factors and levels of experiment

1.2.4 對(duì)比實(shí)驗(yàn) 參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]采用傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑法浸提徽州貢菊中的熊果酸,并與HIPEF輔助提取法進(jìn)行比較。

1.3 熊果酸的純化

1.3.1 大孔樹(shù)脂的篩選 取HP2MG、HP2MGL、NKA-12、X-5這4種大孔樹(shù)脂進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分別加入徽州貢菊提取液40mL,在室溫下每5min振搖1次,24h后達(dá)到吸附平衡。測(cè)定這4種樹(shù)脂對(duì)徽州貢菊中熊果酸的吸附率。加40mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液對(duì)上述吸附飽和的大孔樹(shù)脂進(jìn)行解吸,在室溫下每5min振搖1次,24h后測(cè)定各種樹(shù)脂對(duì)徽州貢菊熊果酸的解吸率。吸附率和解析率的計(jì)算方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]。

1.3.2 pH的篩選 取徽州貢菊提取液40mL,用1mol/L的鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉將提取液的pH分別調(diào)整成3、5、7、9、11,加于X-5大孔樹(shù)脂柱上,分別以2BV/h的流速吸附以及以5BV水洗脫,最后再由體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇進(jìn)行洗脫。

1.3.3 吸附速率的篩選 取徽州貢菊提取液40mL,用1mol/L的氫氧化鈉將pH調(diào)整為11,加于X-5大孔樹(shù)脂柱上,分別以1、2、3、4、5BV/h的流速進(jìn)行吸附后,以5BV水洗脫,再用70%乙醇以2BV/h的速度洗脫,收集洗脫液測(cè)定熊果酸的濃度。

1.3.4 上樣量的篩選 取徽州貢菊提取液40mL,用1mol/L的氫氧化鈉將pH調(diào)整為11,加于20mL X-5大孔樹(shù)脂柱上,以2BV/h的流速進(jìn)行吸附,按樹(shù)脂床體積數(shù)收集流出液,測(cè)定熊果酸的濃度。

1.3.5 乙醇洗脫濃度的篩選 取徽州貢菊提取液40mL,用1mol/L的氫氧化鈉將pH調(diào)整為11,加于X-5大孔樹(shù)脂柱上,以2BV/h的流速進(jìn)行吸附,再以5BV水洗脫后,分別用10%、30%、50%、70%、90%的乙醇洗脫,收集洗脫液,測(cè)定熊果酸的濃度。

1.3.6 洗脫速率的篩選 取徽州貢菊提取液40mL,用1mol/L的氫氧化鈉將pH調(diào)整為11,加于X-5大孔樹(shù)脂柱上,用70%乙醇洗脫,流速分別為1、2、3、4、5BV/h,收集洗脫液,測(cè)定熊果酸的濃度。

1.3.7 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證 取徽州貢菊提取液40mL,用1mol/L的氫氧化鈉將pH調(diào)整為11,加于X-5大孔樹(shù)脂柱上,按照上述最佳參數(shù)進(jìn)行純化,并收集洗脫液,測(cè)定熊果酸的含量。然后水浴蒸干,于105℃干燥3h,測(cè)定干膏重,計(jì)算熊果酸的純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 熊果酸提取結(jié)果與分析

2.1.1 熊果酸提取結(jié)果 采用1.2.2色譜條件,圖譜見(jiàn)圖2,以吸光度y為縱坐標(biāo),熊果酸濃度x為橫坐標(biāo),根據(jù)回歸方程:y=5146.3x-3214.8,R2=0.9953,按1.2.2中提取率公式計(jì)算出熊果酸的濃度。

圖2 HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram chart注:A.對(duì)照品溶液,B.樣品+對(duì)照品溶液,C.供試品溶液。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表2和表3,綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出,影響HIPEF輔助提取徽州貢菊中熊果酸的因素主次順序?yàn)榱弦罕?電場(chǎng)強(qiáng)度>溫度>脈沖數(shù)。而且電場(chǎng)強(qiáng)度、料液比、溫度三因素有極顯著差異,脈沖數(shù)差異不顯著;結(jié)合表2和表3,得出最佳提取參數(shù)是A3B2C3D2,即電場(chǎng)強(qiáng)度30kV/cm、脈沖數(shù)4次、料液比1∶12、溫度30℃。

2.1.3 對(duì)比實(shí)驗(yàn) 本文應(yīng)用HIPEF法、有機(jī)溶劑提法分別提取徽州貢菊中的熊果酸,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了各種方法的最優(yōu)條件,即電場(chǎng)強(qiáng)度30kV/cm、脈沖數(shù)4次、料液比1∶12、溫度30℃,在最佳參數(shù)下最終熊果酸的提取率可達(dá)97.577%,與第七組實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。由于第七組脈沖數(shù)更少,為減少能耗,則選用第七組的實(shí)驗(yàn)參數(shù)為最后使用參數(shù),即電場(chǎng)強(qiáng)度30kV/cm、脈沖數(shù)2次、料液比1∶12、溫度30℃。使用該方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑法得到的提取率82.748%。經(jīng)重復(fù)該參數(shù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,也確實(shí)達(dá)到了該提取率。該方法能夠連續(xù)處理樣品,非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment results

表3 熊果酸提取率的方差分析表Table 3 The ursolic acid content in anova table

注:*p<0.1,**p<0.05,***p<0.01。

2.2 熊果酸純化工藝結(jié)果與分析

2.2.1 大孔樹(shù)脂的確定 從表4中可以看出,HP2MG、HP2MGL、NKA-12、X-5這4種樹(shù)脂當(dāng)中X-5大孔樹(shù)脂對(duì)徽州貢菊熊果酸的吸附和解析能力最好,所以選擇X-5大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化實(shí)驗(yàn)。

表4 4種大孔樹(shù)脂對(duì)徽州貢菊熊果酸的吸附率與解析率Table 4 The adsorption rate and parse rate of huizhou gongju ursolic acid by 4 macroporous resin

2.2.2 pH考察結(jié)果 從表5中可以看出,當(dāng)pH為11時(shí),上柱后熊果酸的濃度達(dá)到了4.312mg/mL,解析率最高,因此選擇pH為11作為最佳參數(shù)。

表5 pH考察結(jié)果Table 5 The result of pH values

2.2.3 吸附速率對(duì)熊果酸的影響 從表6中可以看出,當(dāng)吸附速率為1BV/h時(shí),吸附效果最好,熊果酸濃度達(dá)到了4.420,解析率最高。但吸附速率為2BV/h的解析率與吸附速率與1BV/h的解析值相差不大,且速度快了一倍,所以選擇2BV/h吸附速率為最佳參數(shù)。

表6 吸附速率對(duì)熊果酸的影響Table 6 The result of the adsorption rate

2.2.4 上樣量對(duì)熊果酸的影響 從表7中可以看出,上樣量40BV為時(shí)開(kāi)始泄漏,60BV時(shí)達(dá)到吸附最高值,故可選擇60BV上量。

表7 樣量對(duì)熊果酸的影響Table 7 The effect of the sample volume

2.2.5 不同乙醇濃度對(duì)熊果酸的影響 從表8中可以看出,當(dāng)乙醇濃度從10%到70%,上柱后熊果酸的濃度逐步提高,乙醇濃度為90%時(shí)又開(kāi)始降低,其中70%時(shí)洗脫效果最好,解析率達(dá)到90.454,因此選擇乙醇濃度70%為最佳參數(shù)。

表8 不同乙醇濃度對(duì)熊果酸的影響Table 8 The effect of the ethanol concentration

2.2.6 洗脫速率對(duì)熊果酸的影響 從表9可以看出,以1BV/h和2BV/h洗脫的解析率都很高,且相差很小,本實(shí)驗(yàn)采用2BV/h的流速進(jìn)行洗脫,以提高洗脫的效率。

表9 洗脫速率對(duì)熊果酸的影響Table 9 The effect of the rate of elution

2.2.7 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 從表10可以看出,在上樣液pH11、吸附速率為2BV/h,上樣量為60倍的床體積,選用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液,2BV/h洗脫速率進(jìn)行洗脫的工藝參數(shù)下,經(jīng)X-5大孔樹(shù)脂柱處理后的熊果酸純度可達(dá)85%以上,且具有較好的重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

應(yīng)用高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取技術(shù),通過(guò)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)考察了多種提取因素對(duì)徽州貢菊中提取熊果酸的影響,運(yùn)用L9(34)正交設(shè)計(jì)表對(duì)電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)、料液比、溫度等四種因素進(jìn)行優(yōu)化,得出最優(yōu)的熊果酸提取條件為:電場(chǎng)強(qiáng)度30kV/cm、脈沖數(shù)2、料液比1∶12、溫度30℃,最終熊果酸的提取率可達(dá)97.577%,高于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑法得到的提取率。

表10 熊果酸純度測(cè)定結(jié)果Table 10 The ursolic acid purity measurement results

利用大孔樹(shù)脂對(duì)徽州貢菊熊果酸進(jìn)行富集純化實(shí)驗(yàn)。通過(guò)對(duì)四種大孔樹(shù)脂對(duì)比實(shí)驗(yàn),得出X-5大孔樹(shù)脂為徽州貢菊熊果酸的理想吸附樹(shù)脂。其純化工藝參數(shù)為:上樣液pH11、吸附速率為2BV/h,上樣量為60倍的床體積,選用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液,2BV/h洗脫速率進(jìn)行洗脫。最終經(jīng)X-5大孔樹(shù)脂處理后的徽州貢菊熊果酸的純度可以達(dá)到85%以上。

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High intensity pulsed electric fields(HIPEF)-assisted extraction and purification of ursolic acid from Huizhou Gongju

SUN Ke-kui1,JIN Sheng-lang1,WANG Ying2

(1.Tourism College,Huangshan University,Huangshan 245021,China;2.School of Food Science and Engineering,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

The effects of the HIPEF-assisted extraction of ursolic acid from Huizhou Gongju were preliminary investigated,in which the technical parameters were optimized. The optimal conditions were as follows:electric field intensity of 30 kV/cm,pulse number of 2,material-solvent ratio of 1∶12 and 30℃. Under these conditions,the extraction yield of ursolic acid can reach to 97.577%. The results showed that the X-5 macroporons resin had the best effect on the separation when the volume of drug 60BV with the adsorption-speed 2BV/h,pH11,and the volume of 70% ethanol with desorption-speed 2BV/h,and the purity of ursolic acid could reach to 85%.

huizhou gongju;ursolic acid;HIPEF-assisted extraction;purification

2014-02-17

孫克奎(1978-)，男，碩士，講師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及設(shè)備研究方面的研究。

2014年度安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2014A243)；2013年度安徽省高校重點(diǎn)研究基地招標(biāo)項(xiàng)目(SK2013B484)。

TS255.5

B

1002-0306(2015)01-0207-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.034