Rhizopusoryzae LS-1利用丟糟水解液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸

田艷花,任海偉,劉娜麗

(1.山西藥科職業(yè)學(xué)院食品工程系,山西太原 030031;2. 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050)

RhizopusoryzaeLS-1利用丟糟水解液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸

田艷花1,任海偉2,*,劉娜麗1

(1.山西藥科職業(yè)學(xué)院食品工程系,山西太原 030031;2. 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050)

研究了一株誘變米根霉RhizopusoryzaeLS-1利用丟糟水解液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的可行性。首先考察R.oryzaeLS-1利用葡萄糖和木糖的糖代謝差異特性,并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化丟糟水解液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的工藝參數(shù)。結(jié)果表明,R.oryzaeLS-1能代謝利用葡萄糖和木糖,且二者存在協(xié)同互補(bǔ)作用,有利于乳酸生成和糖酸轉(zhuǎn)化,可用于木質(zhì)纖維原料的乳酸生產(chǎn)。丟糟水解液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的實(shí)驗(yàn)表明,氯化銨是R.oryzaeLS-1適宜的氮源。在接種量為3.0%、pH為6.5、發(fā)酵時(shí)間為96h、CaCO3添加量為80g/L的條件下,乳酸生成濃度為13.27g/L,糖利用率為79.61%。說(shuō)明誘變菌株R.oryzaeLS-1具備發(fā)酵丟糟水解液制備乳酸的潛力。

丟糟水解液,米根霉,乳酸發(fā)酵

乳酸是一種重要的多用途有機(jī)酸,學(xué)名2-羥基丙酸,被廣泛用于食品、醫(yī)藥、飼料、化工等領(lǐng)域。尤其引人關(guān)注的是,乳酸聚合而成的聚乳酸(PLA)作為無(wú)毒、無(wú)刺激、高強(qiáng)度的生物相容性高分子材料能用做制造生物可降解塑料、綠色包裝材料和藥用修復(fù)材料等,應(yīng)用前景廣闊[1]。

乳酸生產(chǎn)有化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法以及微生物發(fā)酵法。其中,微生物發(fā)酵法因其原料來(lái)源廣泛、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品光學(xué)純度高、安全性好等優(yōu)點(diǎn)已成為主要的乳酸生產(chǎn)方法。目前報(bào)道的乳酸發(fā)酵微生物有絲狀真菌(Rhizopusoryzae、R.stolonifer、R.ritici,R.elegans)、細(xì)菌(lactic acid bacteria,Bacillusspecies)和基因工程菌(Pichiastipitis,Corynebacteriumglutamicum,Candidautilis,Escherichiacoli)等[2]。其中,乳酸菌(Lactobacillus,Lactococcus,Streptococcus,Leuconostoc,Enterococcus)對(duì)營(yíng)養(yǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)培養(yǎng)基的要求嚴(yán)格,只能在氨基酸、維生素和其他生長(zhǎng)因子具備的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),且產(chǎn)物多為乳酸的外消旋混合物,使得生產(chǎn)和分離純化成本提高。與之相比,米根霉(Rhizopusoryzae)發(fā)酵生產(chǎn)的乳酸具有光學(xué)純度高、營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、好氧發(fā)酵及產(chǎn)物容易提純等優(yōu)點(diǎn),是工業(yè)生產(chǎn)高光學(xué)純度乳酸的理想菌株[3]。

木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成,可降解轉(zhuǎn)化為富含葡萄糖和木糖的混合糖基質(zhì)用于乳酸發(fā)酵生產(chǎn)[4],是乳酸工業(yè)化生產(chǎn)的重要原料,如農(nóng)作物秸稈(麥秸、玉米秸等)[5-6]、玉米芯[7]、木材[8]、廢棄報(bào)紙[9]、蔗渣[10]等。中國(guó)是白酒生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)。白酒釀造副產(chǎn)物——丟糟不僅產(chǎn)量巨大,資源豐富,而且纖維素和半纖維素含量高達(dá)60%以上,是一種亟待開發(fā)的木質(zhì)纖維素資源。若能將其降解糖化后用于發(fā)酵生產(chǎn)乳酸,不僅能拓寬乳酸的生產(chǎn)原料來(lái)源,降低原料成本,而且對(duì)減少工業(yè)廢棄物污染具有積極意義。

本文以1株誘變的米根霉(Rhizopusoryzae)LS-1為發(fā)酵菌種,首先研究了R.oryzaeLS-1的葡萄糖和木糖代謝特性,并以丟糟水解液為原料,選取乳酸濃度和總糖利用率為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察了氮源種類、發(fā)酵時(shí)間、接種量、pH和CaCO3添加量等參數(shù)對(duì)乳酸發(fā)酵工藝的影響,探索丟糟用于乳酸發(fā)酵的可行性,為丟糟利用和白酒釀造企業(yè)循環(huán)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丟糟,甘肅金徽酒股份有限公司提供。鮮酒糟自然風(fēng)干后粉碎過(guò)50 目篩備用。基本成分為(以干基計(jì)):蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.42%±0.03%,淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.81%±0.09%,粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.56%±0.02%,纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53.17%±1.26%,半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.86%±0.06%。

米根霉(Rhizopusoryzae)LS-1(CICC41411的誘變菌種) 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院保藏。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;SHD-III 型循環(huán)水式多用真空泵 保定高新區(qū)陽(yáng)光科教儀器廠;TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;GZX-9240MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Cary 50 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;SHZ-82氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

菌種保藏斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基;種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 50;(NH4)2SO44;KH2PO40.6,MgSO4·7H2O 0.25,ZnSO4·7H2O 0.44,CaCO310(添加1/10體積的10% CaCO3懸浮液?jiǎn)为?dú)滅菌,用于調(diào)節(jié)pH);生長(zhǎng)培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖120,(NH4)2SO41,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,ZnSO4.7H2O 0.04,CaCO325。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分析方法 乳酸測(cè)定采用對(duì)羥基聯(lián)苯比色法;木糖測(cè)定采用間苯三酚法;總糖(以還原糖計(jì))測(cè)定采用DNS法。

1.3.2 液體種子培養(yǎng)方法 LS-1米根霉在PDA斜面培養(yǎng)基上32℃培養(yǎng)5～7d,制備孢子懸浮液。250mL三角瓶中裝入50mL種子培養(yǎng)基,接種5mL孢子懸液,在32℃、220r/min條件下振蕩培養(yǎng)48h,得到液體種子,計(jì)算孢子濃度為5×106個(gè)/mL。

1.3.3 糖代謝特性研究 設(shè)置不同的C/N比值,考察碳源種類分別為葡萄糖、木糖或混合糖(m葡萄糖∶m木糖=1∶1)條件下米根霉的糖代謝特性。糖濃度分別為90、100、110、120、130、140g/L,培養(yǎng)過(guò)程中選擇氮源為氯化銨,氯化銨添加量以N濃度計(jì)為3.5g/L。培養(yǎng)條件為:250mL三角瓶中裝入50mL未加碳源的生長(zhǎng)培養(yǎng)基,接種量為5%,32℃搖床培養(yǎng)72h,轉(zhuǎn)速220r/min。發(fā)酵結(jié)束后計(jì)算糖酸轉(zhuǎn)化率和糖利用率。計(jì)算公式如下:

糖利用率(%)=初始糖質(zhì)量(g)-終了糖質(zhì)量(g)/初始糖質(zhì)量(g)×100

(1)

(2)

1.3.4 丟糟水解液發(fā)酵制備乳酸的工藝參數(shù)優(yōu)化

1.3.4.1 單因素實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[11]方法制備丟糟水解液,經(jīng)測(cè)定葡萄糖濃度為15.28g/L,木糖濃度為4.73g/L,總糖濃度為22.19g/L。

采用250mL三角瓶裝液50mL進(jìn)行發(fā)酵。準(zhǔn)確量取50mL丟糟水解液,依次添加KH2PO4、MgSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O,使其濃度分別為0.5g/L、0.5g/L和0.04g/L。滅菌后接入種子培養(yǎng)液進(jìn)行乳酸發(fā)酵,發(fā)酵溫度32℃,搖床轉(zhuǎn)速為220r/min。發(fā)酵結(jié)束后,取發(fā)酵樣液5000r/min、4℃離心10min,取適量上清液測(cè)定乳酸濃度和總糖濃度,并按照公式(1)計(jì)算糖利用率。

a.氮源種類對(duì)乳酸發(fā)酵的影響

在總糖濃度為100g/L、碳源為葡萄糖和木糖(m葡萄糖∶m木糖=1∶1)的條件,考察硫酸銨(AS)、氯化氨(AC)、尿素(UR)、蛋白胨(PE)和酵母抽提物(TE)等5種氮源對(duì)乳酸濃度和糖利用率的影響,上述5種氮源的添加量均以N濃度計(jì)(3.5g/L)。

篩選出適宜的氮源種類后,在相同碳源(同上)和氮源為氯化氨(AC添加量以N濃度計(jì)為3.5g/L)條件下,進(jìn)行乳酸發(fā)酵工藝參數(shù)的單因素和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

b.pH對(duì)乳酸發(fā)酵的影響

固定CaCO3添加量70g·L-1,發(fā)酵時(shí)間96h,接種量2.5%,研究不同pH(4.5、5.0、5.5、6.0和6.5)對(duì)米根霉發(fā)酵的影響。

c.接種量對(duì)乳酸發(fā)酵的影響

固定CaCO3添加量70g·L-1,pH6.0,發(fā)酵時(shí)間96h,研究不同接種量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%)對(duì)米根霉發(fā)酵的影響。

d.發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸發(fā)酵的影響

固定CaCO3添加量70g·L-1,pH6.0,接種量2.5%,研究發(fā)酵時(shí)間(12、24、36、48、60、72、84、96和108h)對(duì)米根霉發(fā)酵的影響。

e.CaCO3添加量對(duì)乳酸發(fā)酵的影響

固定pH6.0,接種量2.5%,發(fā)酵時(shí)間96h,研究CaCO3添加量(40、50、60、70和80g/L)對(duì)米根霉發(fā)酵的影響。

1.3.4.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取CaCO3添加量、pH、接種量和發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),各取3個(gè)水平,優(yōu)化發(fā)酵參數(shù),并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal tests

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,采用SPSS軟件處理,置信水平為95%時(shí),p<0.05說(shuō)明數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 米根霉糖代謝特性研究

木質(zhì)纖維素的降解產(chǎn)物是以葡萄糖和木糖為主的混合糖,為更好地將其作為發(fā)酵基質(zhì),研究了米根霉發(fā)酵葡萄糖、木糖或混合糖(葡萄糖∶木糖=1∶1)的糖代謝情況。由圖1可見(jiàn),葡萄糖或木糖單獨(dú)作為碳源時(shí)的糖利用率和糖酸轉(zhuǎn)化率基本相同,但混合糖發(fā)酵的糖酸轉(zhuǎn)化率和糖利用率均明顯提高,尤其糖酸轉(zhuǎn)化率成倍增長(zhǎng)。因?yàn)?二者代謝途徑存在差異,葡萄糖代謝主要與糖酵解途徑相關(guān),純葡萄糖培養(yǎng)條件下,不斷下降的體系pH對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用,使菌體生物量偏低,造成糖利用率和糖酸轉(zhuǎn)化率偏低;而米根霉代謝木糖時(shí)會(huì)產(chǎn)生較高的胞內(nèi)還原力(NADH/NAD+)和ATP,代謝反應(yīng)以促進(jìn)細(xì)胞生物量的合成以及細(xì)胞大分子組分的合成為主,指向生物量積累的能量代謝旺盛[12-13]。另一方面,與葡萄糖相比較,米根霉發(fā)酵木糖所需要的C/N比較低,積極有效的呼吸作用比葡萄糖基質(zhì)更重要,而木糖代謝過(guò)程中的氧化還原途徑與較高的呼吸通量有關(guān)系[14]。因此,米根霉R.oryzaeLS-1不僅可以發(fā)酵葡萄糖和木糖,且二者共存時(shí)還可以提高糖酸轉(zhuǎn)化率,對(duì)乳酸發(fā)酵具有協(xié)同促進(jìn)作用。

圖1 不同碳源條件下的米根霉糖代謝特性Fig.1 Sugar metabolism of Rhizopus oryzae LS-1 for different carbon sources

2.2 米根霉發(fā)酵丟糟水解液產(chǎn)乳酸工藝研究

2.2.1 氮源種類對(duì)丟糟水解液發(fā)酵乳酸的影響 氮源不僅對(duì)微生物合成細(xì)胞物質(zhì)至關(guān)重要,而且是一種成本較高的培養(yǎng)基組分。為了降低發(fā)酵成本,研究了硫酸銨(AS)、氯化氨(AC)、尿素(UR)、蛋白胨(PE)和酵母抽提物(TE)五種氮源對(duì)乳酸發(fā)酵的影響。氮源量均以N濃度計(jì)(3.5g/L)。

由圖2可知,無(wú)氮源添加時(shí),乳酸濃度僅為2.52 g·L-1,糖利用率為12.35%;添加氮源后均能不同程度地提高乳酸濃度和糖利用率。因?yàn)樨S富的N源為生物大分子如蛋白質(zhì)、脂肪等提供了充足的原料,從而促進(jìn)米根霉糖酸轉(zhuǎn)化率的提高。然而,不同氮源對(duì)乳酸發(fā)酵的影響各有差異,其中氯化銨對(duì)應(yīng)的乳酸濃度和糖利用率最高,說(shuō)明與其它四種氮源相比,氯化銨能更多地促進(jìn)乳酸合成。該結(jié)果與硫酸銨是最適宜氮源的研究結(jié)果不一致,這可能是由于培養(yǎng)基成分不同所致[15],因?yàn)榕囵B(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)通過(guò)影響乳酸菌形態(tài)來(lái)影響發(fā)酵過(guò)程和乳酸產(chǎn)量。另外,總體比較而言,盡管有機(jī)氮源富含礦物質(zhì)、維生素和糖分,但無(wú)機(jī)氮源更有利于促進(jìn)乳酸生成。從培養(yǎng)基成本和氮源作用效果等角度衡量,本實(shí)驗(yàn)選用氯化銨作為培養(yǎng)基中的氮源。

圖2 氮源種類對(duì)乳酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on the fermentation of lactic acid

2.2.2 pH對(duì)丟糟水解液發(fā)酵乳酸的影響 微生物生存環(huán)境中的pH對(duì)微生物的活動(dòng)影響很大,主要作用在于引起細(xì)胞膜電荷變化,從而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收;影響代謝過(guò)程中酶的活性;改變生長(zhǎng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可給性以及有害物質(zhì)的毒性。因此,適宜的pH能使菌體獲得最佳培養(yǎng)效果。由圖3可以看出,隨著體系pH不斷升高,乳酸濃度和總糖利用率均逐漸增加,說(shuō)明pH升高有利于乳酸的生成。當(dāng)pH為6.0時(shí),乳酸產(chǎn)量最高為10.82g/L,對(duì)應(yīng)的總糖利用率也達(dá)到峰值75.33%。當(dāng)pH升至6.5時(shí),乳酸濃度顯著降低,總糖利用率也隨之減小,這可能是長(zhǎng)時(shí)間高pH環(huán)境嚴(yán)重影響了菌體的生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酸過(guò)程。但另一方面,發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乳酸也會(huì)造成體系pH自動(dòng)下降,對(duì)糖利用效率和乳酸的合成產(chǎn)生較大影響。因此,適當(dāng)高的初始pH不僅能縮短菌體生長(zhǎng)的遲滯期,而且還能使發(fā)酵體系維持較長(zhǎng)時(shí)間的良好環(huán)境,避免過(guò)早發(fā)生產(chǎn)物抑制現(xiàn)象,有利于米根霉的發(fā)酵代謝。故發(fā)酵初始pH確定為6.0,這與Martak J等[16]米根霉生長(zhǎng)最適pH范圍5.0～6.0的研究結(jié)果相一致。

圖3 初始pH對(duì)乳酸濃度和總糖利用率的影響Fig.3 Effects of pH on lactic acid concentration and total sugars utilization

2.2.3 接種量對(duì)丟糟水解液發(fā)酵乳酸的影響 接種量是由發(fā)酵時(shí)菌體生長(zhǎng)繁殖的速度決定的,通常較大的接種量可以縮短生長(zhǎng)周期,使產(chǎn)物合成提前,但接種量過(guò)大也可能使菌體生長(zhǎng)過(guò)快,造成溶氧量不足,從而影響產(chǎn)物合成。由圖4可知,隨著接種量的增加,乳酸濃度和總糖利用率均逐漸升高,二者變化趨勢(shì)基本一致,當(dāng)接種量為2.5%時(shí)的乳酸濃度和總糖利用率均達(dá)到最大值,分別為9.06g/L和62.90%,當(dāng)接種量提高到3.0%時(shí),二者反而降低。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察發(fā)現(xiàn),接種量的大小影響菌體形態(tài)。隨著接種量的不斷提高,菌絲體越易聚集成較大的絮狀菌團(tuán)。因?yàn)檫^(guò)高的接種量容易導(dǎo)致過(guò)高的菌絲體生長(zhǎng)密度,進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)酵液粘度過(guò)高,而相對(duì)較低的攪拌轉(zhuǎn)速(220r/min)所產(chǎn)生的剪切力,也不足以克服菌絲之間由Ca2+介導(dǎo)的靜電引力,從而使得菌絲體聚集成較大的絮狀菌團(tuán)。絮狀菌團(tuán)導(dǎo)致發(fā)酵體系的傳質(zhì)效率降低,乳酸產(chǎn)量下降。另一方面,盡管過(guò)高的接種量會(huì)縮短延遲期時(shí)間,菌體進(jìn)入快速生長(zhǎng)期,但菌體大量繁殖,也會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的代謝副產(chǎn)物,反而抑制乳酸的形成。Bai等[17]研究發(fā)現(xiàn),接種量過(guò)小,米根霉呈現(xiàn)絲狀菌絲形態(tài),接種量過(guò)高,菌絲發(fā)生聚集形成菌塊,造成氧氣和營(yíng)養(yǎng)成分的傳質(zhì)受限引起菌會(huì)內(nèi)部發(fā)生自溶現(xiàn)象。因此,選定接種量為2.5%。

圖4 接種量對(duì)乳酸濃度和總糖利用率的影響Fig.4 Effects of inoculum size on lactic acid concentration and total sugars utilization

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)丟糟水解液發(fā)酵乳酸的影響 由圖5可知,發(fā)酵開始96h內(nèi),總糖利用率和乳酸濃度逐漸增加,分別提高了75.86%和52.36%;總糖濃度下降明顯,說(shuō)明乳酸主要在總糖不斷消耗的過(guò)程中產(chǎn)生。隨著時(shí)間的推移,一方面營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡,菌體早衰,發(fā)酵后勁不足;另一方面,大的菌球顆?；蚓奂矔?huì)引起傳氧傳質(zhì)阻力急劇增加,從而影響乳酸產(chǎn)量和總糖利用率。故確定發(fā)酵時(shí)間為96h。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸濃度和總糖利用率的影響Fig.5 Effects of fermentation time on lactic acid concentration and total sugars utilization

2.2.5 CaCO3添加量對(duì)丟糟水解液發(fā)酵乳酸的影響 乳酸發(fā)酵過(guò)程中,發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸會(huì)使反應(yīng)體系pH快速下降,較低的pH會(huì)對(duì)菌體正常生長(zhǎng)和產(chǎn)酸過(guò)程產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制,需加入一定的中和劑來(lái)控制pH。CaCO3是最為常用的中和劑,作用溫和,不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷,有利于菌體生長(zhǎng)。同時(shí),溶解釋放的Ca2+在菌體生長(zhǎng)和菌球形成過(guò)程起重要作用,適量Ca2+有利于米根霉菌絲體的生長(zhǎng)及菌球的形成。由圖6可知,未添加CaCO3時(shí),生成的乳酸濃度僅為2.12g/L,總糖利用率為20.83%,可能受到低pH和乳酸反饋抑制的影響。當(dāng)CaCO3添加量為40g/L時(shí),乳酸濃度迅速上升至5.82g/L,總糖利用率也提高至60.47%。當(dāng)CaCO3添加量由40g/L提高到70g/L時(shí),乳酸濃度繼續(xù)保持高增長(zhǎng),達(dá)到10.62g/L,且增幅高于總糖利用率,說(shuō)明該范圍更有利于乳酸濃度的積累,同時(shí)觀察到該階段的米根霉形態(tài)為大小均一的小球體,這種形態(tài)有利于促進(jìn)乳酸生成量的提高[1],而且Ca2+對(duì)乳酸脫氫酶(LDH)有激活作用,可從一定程度上加快乳酸的生成[18],說(shuō)明CaCO3的適當(dāng)增加能提高菌體對(duì)糖的利用效率和乳酸積累。隨著CaCO3添加量的繼續(xù)增加(80g/L),乳酸濃度反而下降,總糖利用率僅微幅增長(zhǎng),基本保持恒定。因?yàn)镃aCO3的過(guò)量添加會(huì)對(duì)菌體造成包埋,不利于菌體與培養(yǎng)基接觸而影響發(fā)酵進(jìn)程,影響溶氧傳遞系數(shù),甚至造成局部厭氧環(huán)境,導(dǎo)致乙醇等副產(chǎn)物的生成[17]。因此,適量添加CaCO3會(huì)促進(jìn)菌體繁殖生長(zhǎng)和乳酸生成。綜合考慮pH調(diào)節(jié)效果、乳酸產(chǎn)量和菌體形態(tài)等因素,確定CaCO3添加量為70g/L。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 L9(34) Orthogonal design and experimental results

圖6 CaCO3添加量對(duì)乳酸濃度和總糖利用率的影響Fig.6 Effects of calcium carbonate addition on lactic acid concentration and total sugars utilization

2.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

在上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,選取一定區(qū)間內(nèi)對(duì)米根霉發(fā)酵產(chǎn)乳酸效果影響較顯著的CaCO3添加量、pH、接種量和發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素作為研究對(duì)象,選取乳酸濃度和總糖利用率2個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表2～表4。

從表2可以看出,各因素對(duì)乳酸濃度的影響大小順序?yàn)镈>C>A>B,最優(yōu)組合為 A2B3C3D2;各因素對(duì)總糖利用率的影響大小順序?yàn)镃>A>D>B,最優(yōu)組合為A2B3C3D2,不同指標(biāo)條件下的最優(yōu)組合一致。從表3和表4方差分析可知,上述四個(gè)因素對(duì)乳酸濃度和總糖利用率的影響均不顯著。

為了更準(zhǔn)確判定最優(yōu)發(fā)酵參數(shù),選取表2中正交最優(yōu)組合A2B3C3D2條件進(jìn)行五次重復(fù)實(shí)驗(yàn)(取平均值),發(fā)現(xiàn)該條件下的乳酸濃度和總糖利用率分別為12.47g/L和76.92%,略低于表2中的直觀優(yōu)組合7(A3B1C3D2)。鑒此,再次選擇這兩個(gè)組合(A3B1C3D2和A2B3C3D2)進(jìn)行五次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(取平均值)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),組合A2B3C3D2條件對(duì)應(yīng)的乳酸濃度和總糖利用率較高,分別為13.27g/L和79.61%,高于組合A2B3C3D2條件對(duì)應(yīng)的12.81g/L和77.58%,但二者差異不顯著(p<0.05)。

綜合上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果,從發(fā)酵參數(shù)控制、提高乳酸濃度和總糖利用率等角度考慮,確定最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B3C3D2,即CaCO3添加量80g/L、pH6.5、接種量3.0%和發(fā)酵時(shí)間96h。

表3 乳酸濃度的影響方差分析Table 3 Variance analyses statistical data on the factors of lactic acid concentration

注:p<0.05表示差異性顯著(下同)。

表4 總糖利用率的影響方差分析Table 4 Variance analyses statistical data on the factors of the reducing sugars utilization rate

3 結(jié)論

米根霉誘變菌株R.oryzaeLS-1的糖代謝研究表明,米根霉R.oryzaeLS-1能分別代謝利用葡萄糖和木糖生產(chǎn)乳酸,且二者共存時(shí)對(duì)發(fā)酵過(guò)程具有協(xié)同促進(jìn)作用,能顯著提高乳酸生成濃度和糖酸轉(zhuǎn)化率,這就為利用木質(zhì)纖維素中的木糖和葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸提供了理論依據(jù)。利用LS-1米根霉發(fā)酵丟糟水解液實(shí)驗(yàn)表明,發(fā)酵過(guò)程中選取氯化銨作為氮源最為適宜,在接種量為3.0%、pH為6.5、發(fā)酵時(shí)間為96h、CaCO3添加量為80g/L的條件下,乳酸發(fā)酵效果最好,濃度達(dá)到13.27g/L,糖利用率為79.61%。表明米根霉R.oryzaeLS-1具備發(fā)酵丟糟水解液制備乳酸的潛力,這也為丟糟生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用奠定了理論基礎(chǔ)。

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Production of lactic acid from distillers grains hydrolysates byRhizopusoryzaeLS-1

TIAN Yan-hua1,REN Hai-wei2,*,LIU Na-li1

(1.Food Engineering Department of Shanxi pharmaceutical Vocational College,Taiyuan 030031,China;2.School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

Distillers grains,one of the lignocellulosic biomasses riched in cellulose and hemicellulose,was used as an economically attractive carbohydrate feedstock for production of lactic acid by saccharification and microbial fermentation processes. The aim of this study was to investigate the possibility of lactic acid production from distillers grains hydrolysates by the mutant strainRhizopusoryzaeLS-1 and to optimize the biological conversion of reducing sugars into lactic acid to evaluate the culture conditions. The effects of factors such as inoculations size,CaCO3addition,pH value and fermentation time on the lactic acid concentration and the reducing sugars utilization rate were researched by the method of orthogonal experimental design. In addition,the sugar metabolism ofR.oryzaeLS-1 was also studied. The results show thatR.oryzaeLS-1 has the capability to utilize xylose or glucose as carbon resource,furthermore there are synergic and complementary actions during the coexistence of both sugars. The cooperated operations of metabolism was beneficial to the bioconversion of lignocellulosic biomass for lactic acid production. Fermentation results show that ammonium chloride is the most favorable nitrogen source for lactic acid production,the optimal fermentation conditions are inoculation size of 3.0% seed culture,CaCO3addition of 80g·L-1,fermentation time of 96h and culture pH of 6.5. Under optimal conditions,13.27g/L lactic acid was produced and the sugar conversion rate reached 79.61%. This study provided an encouraging means of producing lactic acid from lignocellulosic resource such as the low-cost distillers grains. It was concluded that the fermentation technics for the production of lactic acid from distiller grains was worthy to be developed on a large scale.

Rhizopusoryzae;distiller grains hydrolysates;lactic acid fermentation

2014-03-04

田艷花(1981-)，女，碩士，講師，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通訊作者:任海偉(1983-)，男，碩士，講師，研究方向：農(nóng)副產(chǎn)物資源轉(zhuǎn)化利用。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51366009)；甘肅省杰出青年科學(xué)基金項(xiàng)目(1210RJDA016)；蘭州理工大學(xué)“紅柳青年教師培養(yǎng)計(jì)劃”項(xiàng)目(Q201207)。

TS209

A

1002-0306(2015)01-0192-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.031