HPLC法測定小兒腹瀉散中沒食子酸的含量

雷林潔楊 淼霍潘峰王 軍馬亮英*

1.新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 新疆 烏魯木齊 830028；2.新疆醫(yī)科大學藥學院 新疆 烏魯木齊 830011

HPLC法測定小兒腹瀉散中沒食子酸的含量

雷林潔1楊 淼1霍潘峰2王 軍1馬亮英1*

1.新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 新疆 烏魯木齊 830028；2.新疆醫(yī)科大學藥學院 新疆 烏魯木齊 830011

目的：建立小兒腹瀉散中沒食子酸的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱：Inert Sustain C18柱（250× 4.6mm，5μm）；檢測波長：271nm；流速：1.0ml·min－1；柱溫：40℃；流動相：甲醇－0.085%磷酸溶液（6∶94）。結果：沒食子酸在1.55～62μg·ml－1范圍內(nèi)呈良好的線性關系，r＝0.9999，平均回收率為99.24%，RSD＝0.64%。小兒腹瀉散中沒食子酸的含量為5.18mg ·g－1，RSD＝1.66%。結論：該方法操作簡單、準確，可用于小兒腹瀉散中沒食子酸的含量測定及質(zhì)量控制。

HPLC；小兒腹瀉散；沒食子酸；含量測定

小兒腹瀉散為我院的醫(yī)院制劑 （制劑批準文號：新藥制字Z20040551），全方由兒茶、五倍子、清半夏、朱砂、枯礬、氫氯噻嗪等藥組成，已臨床使用多年，具有澀腸止瀉的功效，主要用于小兒 “水樣便”腹瀉。處方中除兒茶具有收斂止瀉的作用外，五倍子中的鞣質(zhì)也是其止瀉的主要化學成分。多年來，鞣質(zhì)成分在醫(yī)藥領域被公認為具有較強的收斂性及蛋白質(zhì)凝固作用，臨床上用于各種止血、止瀉及抗菌抗病毒［2］。隨著新技術、新方法的應用，還發(fā)現(xiàn)鞣質(zhì)具有抗脂質(zhì)過氧化、抗突變、清除自由基、抗艾滋病與抗腫瘤等多種藥理活性［3］，使其在臨床中日益受到重視，也對沒食子酸的含量測定方法提出了更高的要求。中國藥典記載五倍子中鞣質(zhì)的含量以沒食子酸［1］計不低于50%。本文參照中國藥典，采用高效液相色譜法測定小兒腹瀉散中沒食子酸的含量，提高小兒腹瀉散的質(zhì)量標準，為更好地控制該制劑的質(zhì)量提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－20AT型高效液相色譜儀（SPD－M20型檢測器、CTO－20ASVP型柱溫箱、SIL－20A自動進樣器，日本島津）；電子天平（BS210S，北京賽多利斯天平有限公司，d＝0.1mg）；恒溫水浴鍋（DK－S26型，上海精宏實驗設備有限公司）；高速中藥粉碎機 （HX－200型，浙江省永康市溪岸五金藥具廠）；超聲波清洗器（KQ500DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；智能恒溫電熱套 （DRTSX型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。1.2 材料 沒食子酸對照品（批號：110831－201204，中國食品藥品檢定研究院）；小兒腹瀉散（批號：20141224、20141226、20141228，新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院）；甲醇（sigma，色譜純）；水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inert Sustain C18柱（250mm× 4.6mm，5μm）；流動相：甲醇－0.085%磷酸溶液（6∶94）；流速：1.0 ml·min－1；進樣量：10μl；柱溫：40℃，由對照品色譜 （液相檢測器為二極管陣列）確定檢測波長為271nm。理論板數(shù)按沒食子酸峰計算應不低于5000。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品6.2mg，置100ml棕色量瓶中，采用50%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得62μg·ml－1沒食子酸對照品儲備液。

2.3 供試品溶液制備［1］精密稱取小兒腹瀉散0.1g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25ml，稱定重量，超聲處理5min，冷卻，再次稱量重量，采用50%甲醇補足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關系考察 精密量取沒食子酸對照品溶液 （沒食子酸濃度為62μg·ml－1）0.2、0.5、1、3、5、10m l分別置10ml棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取10μl，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。沒食子酸的線性回歸方程為y＝29474x＋4186.7，相關系數(shù)r＝0.9999，表明沒食子酸在1.24～62μg·ml－1范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 分別精密吸取濃度為12.4μg·m l－1的同一對照品溶液，連續(xù)重復進樣6次，進樣量10μl，結果峰面積平均值為368037.8，RSD為0.49%，試驗結果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于配制后1、2、3、6、9、12h進樣，記錄色譜圖，結果沒食子酸的平均峰面積為367542.8，RSD為0.15%，試驗結果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗 分別精密稱取同一批樣品6份，按“2.3”項制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μl進樣，供試品中沒食子酸平均含量為5.26mg·g－1，RSD為0.98%，結果表明沒食子酸含量測定方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取已知含量樣品9份，分別精密加入高、中、低濃度對照品溶液各3份，按供試品溶液的制備方法制備，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率，結果見表1。平均回收率為99.24%，RSD＝0.64%。

2.9 樣品含量測定 照供試品溶液的制備方法分別制備3個批次的供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液10μl進樣，記錄峰面積，計算沒食子酸含量，結果3批樣品中沒食子酸平均含量為5.18mg·g－1，RSD為1.66%。

表1 加樣回收率試驗 （n＝9）

3 討論

3.1 供試品處理［4－6］供試品溶劑的選擇，分別采用無水乙醇、60%乙醇、甲醇、50%甲醇、純水對樣品進行超聲提取，結合液相色譜系統(tǒng)適用性的考察，確定采用50%甲醇作為提取溶劑提取效果最佳，色譜峰能夠較好的分離，而含乙醇的溶劑提取出的樣品色譜峰不能分離，無法計算峰面積。超聲提取時間的考察分別考察了5、10、15、30min，沒食子酸的含量無顯著性差異。因此，供試品的制備選用50%甲醇超聲提取5min。

3.2 流動相的選擇［7－10］實驗考察了不同比例甲醇－磷酸溶液、乙腈－冰醋酸溶液、乙腈－磷酸溶液作為流動相，均能得到較好的色譜峰。其中當甲醇－0.085%磷酸溶液（15∶85）時，出峰時間較快，但色譜峰分離度不夠。經(jīng)預實驗篩選，結合節(jié)約成本和保護色譜柱的考慮，確定采用甲醇－0.085%磷酸溶液（6∶94）作為流動相。

小兒腹瀉散作為我院特色制劑，療效顯著，但處方成分復雜，不僅由中西藥組合，還含有毒性藥材朱砂，因此在臨床使用與制劑質(zhì)量控制過程中應該嚴格控制，加強臨床監(jiān)管，提高制劑質(zhì)量標準，保障患兒的生命健康。本文結合制劑的特點，參照中國藥典中五倍子的含量測定方法，建立了小兒腹瀉散中沒食子酸的HPLC含量測定方法，該方法簡單，靈敏度高，穩(wěn)定性好，可用于小兒腹瀉散的質(zhì)量控制。

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Determ ination of gallic acid in infantile diarrhea powder by HPLC

LEILinjie1YANG Miao1HUO Panfeng2WANGJun1MALiang ying1*
1.The second affiliated hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi，830028；2.Pharmacy college of Xinjiangmedical university，Urumqi，830054

ObjectiveTo establish an HPLCmethod for the determination ofgallic acid in infantile diarrhea powder.M ethods the HPLC separation was performed on a Inert Sustain C18column（250×4.6mm，5μm）in gradient elutemode with amixture consisting ofmethol and 0.085m l·L－1phosphate acid solution at40℃，the flow rate was 1.0ml·min－1，the detection wave length was set at 271nm.Results There were established a good linear relation between 1.55～62.0μg·ml－1of gallic acid，r＝0.9999，the average recovery was99.24%，RSD was0.64%.the contentofgallic acid in infantile diarrhea powderwas5.18mg·g－1，RSD was1.66%. Conclusions Thismethod is simple，accurate，which can be used to detemination of contents and quality control of the infantile diarrhea powder.

HPLC；infantile diarrhea powder；gallic acid；content determination

R917

A

1007－8517（2015）13－0004－02

2015.03.23）

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目（2011KTCL03－05）；陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化中試項目（2010JC05）。

張嚴磊 （1984－），男，博士，講師，從事中藥資源產(chǎn)業(yè)化開發(fā)與利用研究工作。

王梅 （1971－），女，碩士，主任藥師，從事中藥配伍應用及其安全性與有效性研究。