桂芍知母湯對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型鼠滑膜組織血管內(nèi)皮生長因子的影響

孫 乾，王金春，孫 鋒

桂芍知母湯對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型鼠滑膜組織血管內(nèi)皮生長因子的影響

孫 乾，王金春，孫 鋒

目的 觀察桂芍知母湯對膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(CIA)模型鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的影響，探討其作用靶點。方法 將40只健康雌性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、來氟米特組、桂芍知母湯組，除正常組之外,其余各組使用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)大鼠造成CIA模型。桂芍知母湯組、來氟米特組，造模后開始給藥,共計30 d。按評分法評價關(guān)節(jié)炎指數(shù),ELISA法檢測VEGF表達(dá)。結(jié)果 給藥組較模型組關(guān)節(jié)發(fā)病數(shù)目減少，關(guān)節(jié)腫脹程度減輕，皮膚紅腫不明顯，關(guān)節(jié)變形程度減輕。給藥組與模型組在關(guān)節(jié)炎指數(shù)方面比較有明顯差異(P<0.05)。給藥組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織升高的VEGF水平顯著降低(P<0.01)。結(jié)論 桂芍知母湯組與模型組比較,關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯降低,大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織VEGF水平明顯下降。

桂芍知母湯；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；血管內(nèi)皮生長因子

0 引言

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)可導(dǎo)致滑膜和關(guān)節(jié)軟骨損傷,進(jìn)而出現(xiàn)骨破壞,使患者關(guān)節(jié)畸形、功能障礙。治療的關(guān)鍵在于阻止骨破壞及改善局部癥狀。西藥在治療本病時，明確提出控制病情及改善癥狀。中藥在治療RA 時，是否有類激素樣作用，或者通過阻止骨破壞起到控制病情的作用目前尚無系統(tǒng)研究。本研究從一般形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方面觀察了經(jīng)方桂芍知母湯抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞的生物學(xué)效應(yīng)，為臨床治療此病正確選擇用藥提供充分的證據(jù)，為中醫(yī)經(jīng)方的科學(xué)應(yīng)用提供有力的支撐。

1 資料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物 普通級健康雌性大鼠40只，體重(146±20)g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。

1.1.2 實驗藥品及制備 方用桂芍知母湯[1]：桂枝12 g、白芍藥9 g、甘草6 g、麻黃6 g、生姜15 g、白術(shù)15 g、知母12 g、防風(fēng)12 g、炮附子9 g購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗室煎煮。對照組用藥：來氟米特片[2](蘇州長征欣凱制藥有限公司，批號：110221)。

1.1.3 主要試劑 弗氏完全佐劑：購自北京欣惠澤奧科技有限公司，批號：049k8700。血管內(nèi)皮生長因子試劑盒：美國Initorgenv公司。

1.1.4 主要儀器及設(shè)備 電子天平：瑞士precisa，型號：xs-225A；低速臺式離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠，型號：LD4-ZA；熒光顯微鏡：日本奧林巴斯，型號：BX51TRF；全自動酶標(biāo)儀：奧地利Anthosl，型號：17550；以上均由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)分子生物學(xué)實驗室提供。

1.1.5 實驗室 整個實驗均安排在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)清潔級實驗室中實施。本課題涉及實驗室-分子生物學(xué)實驗室系國家中醫(yī)藥管理局局級科研三級實驗室(2002年批準(zhǔn))。

1.2 實驗方法與結(jié)果

1.2.1 實驗動物分組 選擇雌性健康大鼠40只，體重(146±20)g，鼠齡4～5周。隨機(jī)選10只為正常鼠，另外30只建立Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠模型[3]。后者隨機(jī)分成：模型組、來氟米特組、桂芍知母湯組，10只為一組。正常組大鼠每只左后足跖皮內(nèi)注射生理鹽水100 μL。

1.2.2 模型制備 隨機(jī)取10只為正常組，另外30只建立Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠RA模型,將酸溶性膠原蛋白[collagen(Ⅱ)]用弗氏完全佐劑配成CⅡ濃度為2.5 mg/mL的乳劑,在每只大鼠左后足跖皮內(nèi)注射100 μL乳劑(含CⅡ250 μg)。

1.2.3 處理因素 ①模型組：造模后10 d開始給予生理鹽水2 mL/(只·d)灌胃。②其他組:造模后10 d,按照鼠-人的折算劑量分別以不同藥物灌胃,1次/d。③正常組:不做任何處理。

1.2.4 取材 以上各組大鼠治療30 d后，先做一般形態(tài)學(xué)觀察，取雙側(cè)踝關(guān)節(jié),放置在含多聚甲醛和焦碳酸二乙酯(DEPC)的固定液中固定備用。

1.2.5 指標(biāo)檢測 大鼠足跖的外觀：觀測其腫脹程度，計算出關(guān)節(jié)炎指數(shù)。關(guān)節(jié)炎指數(shù)計算：觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度，關(guān)節(jié)病變按4級評分法評價，根據(jù)四肢各肢體的病變程度累計積分，計算出關(guān)節(jié)炎指數(shù)。0分：無紅腫;1分：1個趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：2個趾關(guān)節(jié)紅腫；3分：3個及以上趾關(guān)節(jié)和跖足腫脹。各個關(guān)節(jié)的積分累計，即為每只小鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，最大值為12。治療前，模型組、來氟米特組、桂芍知母湯組關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織血管內(nèi)皮生長因子[4]檢測：ELISA法檢測滑膜VEGF的水平,嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所有實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般形態(tài)學(xué)考察 桂芍知母湯組及來氟米特組較模型組關(guān)節(jié)發(fā)病關(guān)節(jié)腫脹及關(guān)節(jié)變形程度明顯減輕，關(guān)節(jié)變形數(shù)目明顯減少,桂芍知母湯組及來氟米特組與模型組關(guān)節(jié)炎指數(shù)均大幅度下降。見表1。

表1 各組模型大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

注：與模型組比較,*P<0.05

2.2 ELISA法檢測結(jié)果 CIA造模后治療30 d，經(jīng)ELISA法檢測：模型組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹明顯，大鼠滑膜組織VEGF水平明顯升高，桂芍知母湯及來氟米特組與模型組比較關(guān)節(jié)腫脹明顯減輕，大鼠滑膜組織VEGF水平明顯下降。與正常組比較,模型組大鼠滑膜組織VEGF水平明顯升高(P<0.01),桂芍知母湯組及來氟米特組均能明顯降低大鼠滑膜組織升高的VEGF水平(P<0.01),桂芍知母湯組與來氟米特組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組模型大鼠滑膜組織VEGF水平的比較

注：與模型組比較,*P<0.01

3 討論

RA是一種慢性侵襲性關(guān)節(jié)炎性疾病，若得不到有效治療，會導(dǎo)致患者的關(guān)節(jié)功能喪失，進(jìn)而造成患者生活自理能力及勞動能力的喪失，給社會及家庭造成嚴(yán)重的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是我國人群喪失勞動力和致殘的主要疾病之一。因此，延緩甚至阻斷骨質(zhì)破壞成為RA治療的重要目標(biāo)之一。滑膜炎是引起軟骨破壞[5]和骨侵蝕[6]繼而引起關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形、功能喪失的重要標(biāo)志。

RA的滑膜病變表現(xiàn)為滑膜組織的異常增生,血管翳形成,甚至嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)周圍組織,具有類腫瘤樣生長的特點。上述特點與本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化相符合。許多生長因子和大量炎性因子參與此病理過程,VEGF是滑膜炎癥發(fā)展及滑膜血管翳形成的十分重要的炎性因子之一。VEGF的分子量約為46 kD，其性質(zhì)是高度糖基化的堿性蛋白,同時也是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原。VEGF直接通過滑膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及浸潤的單核巨噬細(xì)胞等起作用,是一種強(qiáng)有力的促血管生成因子，其主要靶細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞,通過增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂,促進(jìn)新生血管形成,VEGF廣泛存在于RA的滑膜和滑膜液中。有實驗證明，血管平滑肌細(xì)胞、梭樣襯里內(nèi)層細(xì)胞、巨噬樣滑膜襯里細(xì)胞均有VEGF表達(dá)。近年來的研究又發(fā)現(xiàn)，RA的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均有豐富的VEGF表達(dá)，滑膜液的成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞可以分泌VEGF。Dufe等[7]發(fā)現(xiàn)，VEGF在滑膜和滑膜表面表達(dá)顯著。在鄰近區(qū)發(fā)現(xiàn)121酪氨酸激酶1表達(dá)VEGF，可以解釋fms酪氨酸激酶Ⅰ在滑膜表面附近的血管上出現(xiàn)；DeBandt等[8]研究發(fā)現(xiàn)，接近人類關(guān)節(jié)炎造模鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞能夠表達(dá)VEGF、含激酶插入功能區(qū)受體、121樣酪氨酸激酶1胎肝激酶1。RA的病理性新生血管形成過程中有多種血管新生相關(guān)因子參與。有研究表明，VEGF與內(nèi)皮抑制素失衡是RA血管新生的罪魁禍?zhǔn)譡9]。其作用機(jī)制為：VEGF等促血管生成因子與內(nèi)皮抑制素[10]等抑制血管生成因子之間失衡,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡抵抗性升高，從而使多種調(diào)節(jié)因子誘導(dǎo)VEGF持續(xù)高水平表達(dá)，VEGF與其受體結(jié)合，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致血管周圍細(xì)胞外基質(zhì)的異常降解、內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和異常增殖、毛細(xì)血管的分化和吻合，進(jìn)一步形成新生血管。VEGF在RA整個病理性新生血管形成過程中起著不可或缺的作用。

長期以來，中藥對RA的治療優(yōu)勢已被業(yè)內(nèi)人士所公認(rèn)，但缺乏中藥對RA的作用靶點及作用機(jī)制系統(tǒng)深入的研究。本實驗觀察了桂芍知母湯對RA大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)展的影響,實驗結(jié)果顯示，經(jīng)桂芍知母湯治療后,CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯降低，損傷程度明顯減輕,表明桂芍知母湯具有良好的抗炎、抑制骨破壞的作用。同時實驗進(jìn)一步觀察了桂芍知母湯治療RA大鼠的作用機(jī)制,結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)桂芍知母湯治療后,RA大鼠滑膜組織VEGF水平明顯下降，表明桂芍知母湯是通過抑制VEGF的生成而起到對CIA大鼠抗炎、抑制骨破壞的作用。

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Influence of Guishao Zhimu decoction on vascular endothelial growth factor in sliding membrane tissue of rheumatoid arthritis model rats

SUN Qian,WANG Jin-chun,SUN Feng

(Department of Rheumatology and Immunology,Shenyang Fifth People Hospital,Shenyang 110023,China)

Objective To observe the influence of Guishao Zhimu decoction on vascular endothelial growth factor(VEGF) in rheumatoid arthritis(CIA) model of mice induced by collagen,and discuss the acting targets.Methods 40 healthy female rats were randomly divided into normal group,model group,fluorine mitt group and Guishao Zhimu decoction group.All groups were induced by using Ⅱ type collagen to form the CIA model in rats except the normal group.The arthritis index was evaluated by using score method,vascular endothelial growth factor (VEGF)expression was evaluated by using ELISA method in Guishao Zhimu decoction group and fluorine mitt group after 30 d of treatment.Results Compared with model group,the numbers of joint disease reduced,the degree of joint swelling relieved,skin irritation disappeared,the degree of joint deformation alleviated in the medication group.There was significant difference in arthritis index between the medication groups and model group(P<0.05).The increased levels of VEGF in ankle synovial tissue of rheumatoid arthritis significantly reduced in medication group(P<0.01).Conclusion Compared with model group,the arthritis index and ankle synovial tissue VEGF levels of rats in Guishao Zhimu decoction group significantly decreased.

Guishao Zhimu decoction;Rheumatoid arthritis;Vascular endothelial growth factor

2014-06-28

沈陽市第五人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，沈陽 110023

10.14053/j.cnki.ppcr.201503002